蛋白质多肽的微流控二维芯片电泳.pdf

收稿:2007年6月,收修改稿:2007年7月3 国家自然科学基金项目(No.20675089)、国家高技术发展计划(863)项目(No.2006AA04Z345)、科技部国际科技合作项目(No.2006DFA13510)和重庆市自然科学基金重点项目(No.2006BA4012)资助3 3 通讯联系人 e2mail:xuyibbd 蛋白质 多肽的微流控二维芯片电泳3徐 溢1,2,33 3 申纪伟1,2 陆嘉莉1,2 温志渝1,3(1.重庆大学微系统研究中心 重庆400044;2.重庆大学化学化工学院 重庆400044;3.重庆大学教育部光电技术及系统开放实验室 重庆400044)摘 要 在微流控芯片上构建多维分离系统,为蛋白质组学研究提供了一个有发展前景的高效分离分析技术平台。本文介绍了二维芯片电泳系统耦联模式的选取及正交性评价的方法;综述了针对蛋白质 多肽分离分析的各种耦联模式微流控二维芯片电泳分析系统,如胶束电动力学色谱(MEKC)与毛细管区带电泳(CZE),开管电色谱(OCEC)与CZE,等电聚焦(IEF)与CZE,IEF与SDS毛细管凝胶电泳(CGE),SDS2CGE与MEKC等。特别对二维电泳芯片切换接口的类型进行了分类,探讨了用于微流控二维芯片电泳系统的检测技术,并展望了微流控二维电泳芯片在蛋白质组学研究中的应用前景和发展方向。关键词 微流控芯片 二维芯片电泳 蛋白质 多肽分离中图分类号:O652;Q51 文献标识码:A 文章编号:10052281X(2008)0520754208ProteinPeptides Electrophoresis Separation by Two2DimensionalMicrofluidic ChipXu Yi1,2,33 3Shen Jiwei1,2Lu Jiali1,2Wen Zhiyu1,3(1.Micro System Research Center,Chongqing University,Chongqing 400044,China;2.Chemistry and Chemical Engineering College,Chongqing University,Chongqing 400044,China;3.Key Lab for Optoelectronic Technology&Systems of Ministry of Education,Chongqing University,Chongqing 400044,China)AbstractA powerful tool is presented in the proteome studies by multi2dimensional separation system constructedon the micofluidic chip platform.Approaches to estimate the orthogonality between selected separation modes arepresented in this paper.Microfluidic two2dimensional chip electrophoresis system of various coupling modes,such asmicellar electrokinetic chromatography(MEKC)coupled with capillary zone electrophoresis(CZE),open2channelelectro2chromatography(OCEC)2CZE,isoelectric focusing(IEF)2CZE,IEF2SDS2capillary gel electrophoresis(CGE),SDS2CGE2MEKC,etc.,designed for proteinpeptides separation are summarized.Particularly,types of switchinginterface for two2dimensional electrophoresis microchip are classified and detecting techniques for two2dimensionalmicrochip electrophoresis are discussed.Application prospects and developing trends of microfluidic two2dimensionalelectrophoresis chip in the proteome studies are also discussed.Key wordsmicrofluidic chip;two2dimensional electrophoresis;proteinpeptides separation 蛋白质组学是生命科学后基因组时代的研究重心。蛋白质组学的研究对象是蛋白质组,即一种细胞或一种组织所表达的全部蛋白质。在蛋白质组学研究的主要技术中,蛋白质分离占据着核心地位。第20卷 第5期2008年5月化 学 进 展PROGRESS IN CHEMISTRYVol.20 No.5May,2008 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/由于细胞内蛋白质的表达丰度差异很大,高丰度的蛋白质往往在分离鉴定过程中将低丰度蛋白质掩盖掉;蛋白质的表达具有时间和空间上的差异性,通过一种方法来分离鉴定一种细胞或一种组织中所有蛋白质难以实现。发展高分辨率、高峰容量的分离分析方法是蛋白质组学发展的重要内容。目前蛋白质组研究中最常用的方法是二维凝胶电泳(22DE),它需要手工制胶和染色,导致分析时间过长1,难以满足在线、快速、自动分析的要求。近年来,高效液相色谱(HPLC)和毛细管电泳(CE)的发展为蛋白质和多肽分离分析提供了新的手段。然而一维分离模式所能提供的分辨率和峰容量往往十分有限,不足以通过一维分析分辨出所有样品组分2,3,因此发展了基于柱分离技术的二维CE或HPLC耦联技术48。这种耦联方式需要通过接口实现,接口处的死体积往往会引起额外的谱带扩展,使耦联系统的分离能力下降。自1990年代Manz等9首次提出微全分析系统以来,微流控芯片技术和微机电加工技术得到迅速发展,微流控芯片分析技术具有进样量少、分析时间短、易于小型化和自动化等优势。国内方肇伦和林炳承10,11专著中对微流控芯片原理和技术进行了较为全面的论述。与基于常规柱分离的二维分离技术相比,以微流控芯片上集成微管道网络构建的二维芯片分离系统,将不同电泳分离模式在芯片系统中相互耦联起来,接口处的死体积大大减小,在提高分离系统的分辨率和峰容量方面显示出巨大潜力,也使其成为蛋白组学研究领域中备受关注的分离分析手段,并引起了国内研究组的关注。梁恒12、张玉奎13、罗国安14所在研究组对该领域研究工作分别做了评论和综述,肯定了微流控二维芯片电泳技术的应用前景。本文进一步探讨了二维芯片电泳系统耦联模式的选取及正交性评价方法,对二维电泳芯片切换接口的类型进行了较为细致的分类,并介绍了用于微流控二维芯片电泳系统的检测技术,综述了该领域的最新研究动态。1 二维芯片电泳的基本原理 任何一种分离方法所能获得的信息主要依赖于系统的分离度,而一种具体分离方法所能够达到的分离度往往随着样品成分复杂性的增加而降低。根据Giddings15的研究,多维分离系统的峰容量取决于各维分离模式之间的正交性以及每一维分离的峰容量。分离机理完全正交的分离模式构建的多维系统,系统的峰容量等于每一维分离峰容量的乘积。通常不同分离方法之间不可能具有完全正交性,因而,多维分离系统的实际峰容量低于理论值。二维芯片电泳是将两种不同分离机理的色谱方法整合到同一块电泳芯片上,构建成二维分离平台,以提高分离系统的分辨率和峰容量。与构建理想的多维液相色谱技术相似16,理想的二维电泳芯片分离分析系统应同时满足两个条件:(1)不同分离维应具有不同的选择性;(2)经一维分离模式分离的样品组分不应在后续分离维中被混合,即在尽可能不损失第一维分离效果的前提下,将第一维分离的样品引入第二维。因此,构建二维电泳芯片分离分析系统应从分离模式选取开始,以保证不同分离维具有不同的选择性;然后进行合理的接口设计,以保证第一维的分离效率不受到损失。2 二维芯片电泳的正交性评价 目前已有关于评价多维分离模式之间正交性的研究1720,可以借鉴到评价与全二维液相色谱分离系统模式相似的二维芯片电泳分离系统的正交性。正交性是隐含在分离模式保留机制之中的一个概念,是评价多维分离系统中不同分离维之间选择性的依据。无论是常规的二维分离体系,还是本文所讨论的蛋白质芯片二维电泳分离分析系统,均可以通过对实验数据的分析以及数学模型的建立,用数学的方法来表达不同分离模式之间的正交性,为多维分离系统的构建提供更明确的指导。Liu等17在考虑各种一维模式的峰容量、正交分离中峰展开角和二维保留空间的基础上,从理论上得到了二维分离模式下实际峰容量的计算公式。Slonecker等18也采用定性信息相似性技术,通过对信息熵、交互信息和信息相似性的计算,根据46种不同性质的溶质在各种一维分离模式下的保留时间推测出其在二维模式下信息的正交性。如果被分析物没有沿2D分离空间的对角线分布,采用上述两种方法所建立的模型来评价正交性比较困难。考虑到这一问题,Gilar等21提出了计算二维液相色谱正交性的简化几何模型,可以用来计算不同二维芯片电泳分离模式的正交性。该模型首先将每一维分离的保留时间进行标准化:RTi(norm)=RTi-RTminRTmax-RTmin(1)其中,RTmin和RTmax分别为样品的最小和最大保留时间,RTi为样品组分i的保留时间,RTi(norm)为557第5期徐 溢等 蛋白质 多肽的微流控二维芯片电泳 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/RTi转化的标准化保留时间。RT(norm)值在01之间。然后采用标准化的保留时间值得到如图1所示的二维分离空间图。如果二维分离的最大峰容量为Pmax,则将整个二维图形区域划分成Pmax个等面积的矩形块。假定Pmax=100,则整个二维区域划分成100个等面积的矩形块,如图1所示。以bins代表含有数据点的矩形块,则二维分离的正交性(O)可以用(2)式计算:O=bins-Pmax0.63Pmax(2)二维分离的峰容量P2D可以用两维分离峰容量(P1,P2)的乘积来表示:P2D=P1P2(3)在该模型的基础上,可以根据bins计算二维分离系统的实际峰容量(NP)(式4)。Np=P2DbinsPmax(4)图1 正交性计算方法示意图21Fig.1Scheme of orthogonality calculation213 微流控二维电泳芯片分离模式的选取 合理选取不同分离方法的组合模式,是构建高效二维芯片电泳分离系统的基础,选择依据主要是不同分离模式之间的正交性。微流控芯片技术发展至今,已有多种电泳分离模式在芯片上实现,并用于蛋白质或者肽的分离分析,其中包括:CZE22,23、MEKC24、CGE25、等速电泳(ITP)26、IEF2730等。此外,需要兼顾接口设计以及分离模式之间的匹配情况。因此,在分离模式的选取中,要考虑以下具体问题:(1)分离模式的正交性。由于目前芯片上各种分离模式之间正交性定量表征的研究很少见,并且针对不同样品对象,给定二维分离系统的正交性必然会存在差异,因而从正交性角度来选择分离模式的定量依据比较欠缺。(2)不同分离模式的缓冲体系往往存在差异,微流控芯片一般是在电泳前采用压力将缓冲溶液注入分离通道,在同一块芯片的不同通道中注入不同的缓冲液,必然导致不同缓冲液之间的相互扩散,给二维分离带来不利影响。(3)采用时间上的多维分离方式,将小部分一维分离产物顺序引入到二维通道进行分离检测,一般需要将后续的样品停滞下来以等待下一次二维进样。在停滞过程中,第一维通道中的样品扩散必然导致谱带展宽,可以通过分离模式的速度匹配来减轻这种不利影响,即将所需分离时间短的分离模式作为二维分离系统的第二维。(4)采用空间上的多维分离方式,即将多个与第一维分离通道垂直相交的通道作为第二维分离通道,使经第一维分离后样品能够全部、同时进入到第二维中进行分离分析。这种方式在耦联结口处存在样品相互扩散,会降低第一维分离的效率和分离度。(5)二维芯片电泳的分离对象是蛋白质或多肽样品,选择分离模式需要考虑它们自身的特性。例如,MEKC在分离小分子多肽上具有较大优势,而SDS2CGE在蛋白质分离中具有较大优势。考虑到以上因素,国外研究组已经设计制作了多种耦联模式的微流控二维电泳芯片,并将构建的二维芯片分离系统用于蛋白质或蛋白质酶解产物的分离分析。4 微流控二维电泳芯片的设计及其在蛋白质分离中的研究 微流控二维电泳芯片的设计宗旨是实现两种分离模式的有机结合,其中需要重点解决接口设计问题。芯片设计的原则主要包括:(1)芯片的结构、尺寸要满足每一维分离的需要,即要求二维分离系统中的每一维要能够发挥其单独使用时的效能;(2)芯片接口须能够保证将第一维分离的样品高效地引入到第二维。所谓高效是指不损失第一维的分离效果、进样易于控制以及能将所有感兴趣的第一维样品全部引入第二维。4.1 管道集成在有限面积的电泳芯片上实现二维分离机制的耦联,通常需要引入弯道来延长分离管道的长度,以保证每一维分离能够发挥其单独使用时的效能,进而满足二维分离高峰容量的需要。弯道的引入会带来样品带中样品分子迁移距离的差异和电场强度分657化 学 进 展第20卷 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/布的不均匀,增加样品带的分散31。这种几何分散依赖于溶质分子径向扩散时间与通过弯道所需时间的比率。采用合理的弯道设计,有效消除弯道带来的额外样品带几何扩散,对提高电泳芯片的分离效能非常重要。目前的芯片设计均采用非对称设计来降低这种几何扩散3236。已用于二维电泳芯片弯道设计的方法主要有两种:第一种是通过螺旋盘管设计来增大弯管道的半径,这种方式存在内外路径差异,造成样品带扭曲37;另一种更为有效的方式是逶迤形管道设计。4.2 接口设计与在蛋白质分离中的应用芯片上不同分离模式的耦联需要接口来实现,接口处的死体积往往引起额外的谱带展宽,接口设计成为二维电泳芯片设计的核心内容。对于缓冲体系一致的分离模式,耦联过程相对容易实现。对于缓冲液组成相似的分离模式,目前主要采用在不同通道中注入不同的缓冲液的兼容缓冲溶液方法。物理隔离是耦联缓冲组成差异很大的分离模式的一种有效途径。4.2.1MEKC与CZE耦联MEKC与CZE是两种完全不同的分离模式:前者以表面活性剂形成的胶束为准固定相,根据组分在胶束准固定相和水溶液之间的分配差异而实现分离;后者基于组分电泳迁移率的差异而实现分离。但MEKC缓冲液组成仅比CZE增加了表面活性剂,且两种分离方法pH值相近,因而可以直接采用兼容缓冲液的方法实现两者芯片上耦联。Rocklin等38构建了MEKC为第一维、CZE为第二维的兼容缓冲液二维芯片分离系统(芯片结构如图2(a)。选用玻璃材质制作了二维电泳芯片,并采用门式进样技术(gated injection)39进行了细胞色素c、核糖核酸酶、白蛋白等的胰蛋白酶解产物的分离实验,全部分离时间约为10min左右,系统峰容量在5001 000之 间(MEKC贡 献2040,CZE贡 献25)。Ramsey等40对上述芯片设计进行了改进,增加了第一维通道的长度,在蜿蜒通道的转折处引入非对称结构设计(图2(c),同时增加第二维取样频率,在15min内完成了对BSA胰蛋白酶解产物分离实验,获得了4 200的系统峰容量(MEKC贡献110,CZE贡献38)。该芯片二维电泳系统的峰容量已明显优于柱耦联模式二维分离系统,并与22DE峰容量相当,但自动化程度、分析速度和试剂消耗都明显优于22DE。4.2.2OCEC与CZE耦联图2MEKC2CZE耦联芯片结构(a)及其典型二维分离图(b)38;非对称结构弯道设计(c)40Fig.2Chipstructure ofMEKC2CZE couplingseparationsystem(a)and its typical plot of two2dimensional separation(b)38;asymmetrical turn(c)40由于OCEC与CZE两种分离模式可以采用一致的缓冲条件,两者的耦联相对容易。G ottschlich等41采用如图3(a)所示的芯片结构构建了二维分离系统。选用玻璃材质制作芯片,采用门式进样技术,第一维开管电色谱在表面用十八烷基三甲氧基硅烷改性的长25cm的盘形通道中进行,第二维区带电泳在1.2cm的直通道内进行。该二维分离系统对四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记的 2酪蛋白的胰蛋白酶解产物进行了分离,每次分离需要13min。系统的峰容量为150(OCEC贡献30,CZE贡献5)。OCEC实质上是反相液相色谱和毛细管电泳的复合技术,样品通过电动方式在管道中传输,并通过疏水作用和电泳方式实现分离,CZE仅是基于电泳迁移率不同,因此OCEC和CE的正交性不高,与单独一维分离模式相比,峰容量提高有限。图3OCEC2CZE耦联芯片结构(a)及其典型二维分离图(b)41Fig.3ChipstructureofOCEC2CZE couplingseparationsystem(a)and its typical plot of two2dimensional separation(b)414.2.3IEF与CZE耦联IEF是根据蛋白质、肽等两性离子等电点的差757第5期徐 溢等 蛋白质 多肽的微流控二维芯片电泳 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/异来实现分离分析。IEF的聚焦性质使得样品浓度增加,进而能提高系统的检测限。考虑到两性电介质在有pH边界条件下才能实现IEF分离,Herr等42以聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)材质制作的简单十字形芯片(图4(a),两维电泳均以两性电解质作为缓冲溶液,实现了IEF与CZE的耦联。在第一维IEF中,以pH=10的NaOH溶液作为阴极电解液,以pH=3的磷酸溶液作为阳极电解液。在十字交叉处,利用电场作用将第一维分离的组分带推入第二维CZE通道,在第二维中由于缺少了pH边界条件,缓冲溶液pH保持在815,因此组分在第二维中不会聚焦,以区带电泳的模式进行第二维分离。采用该系统对绿色荧光蛋白、FITC标记的右旋糖苷和卵清白蛋白进行了约5min的二维分离,峰容量达1 300(图4(b)。但该系统在进行第二维分离时需要将第一维等电聚焦停下,因此该系统只是将IEF中很小部分的分离组分带注入了CZE通道,并未实现对样品的全面分析。图4IEF2CZE耦联芯片结构(a)及其典型二维分离图(b)42Fig.4Chip structure of IEF2CZE coupling separation system(a)and corresponding typical two2dimensional“gel2like”plotsconstructed from a time sequence of CCD images collectedduring the 2D separations(b)424.2.4IEF与SDS凝胶电泳耦联凝胶电泳是根据带电分子在网状结构的筛分介质中电泳时受到的排阻作用不同而实现尺寸分离。IEF与SDS凝胶电泳耦联的高效性在22DE中得到了充分体现。Li等43采用聚碳酸酯(PC)材质制作芯片,构建了IEF为第一维、平行SDS2聚氧化乙烯(PEO)凝胶电泳为第二维的二维芯片分离系统(芯片结构如图5)。以单一分离介质和双重缓冲介质两种不同方式,用该二维分离系统对血清蛋白、卵清蛋白、胰蛋白酶抑制剂、牛血清白蛋白和肌动蛋白组成的混合物进行了分离。采用单一分离介质,聚焦的蛋白质区带在转移阶段展宽1152倍;采用双重分离介质,由于蛋白质在凝胶 溶液界面堆积,聚焦蛋白质区带的宽度在转移阶段减少为12,在10min之内完成了全面的蛋白质分离,并获得了约1 700的峰容量(IEF贡献10,SDS2PEO凝胶电泳贡献约170)。此外,可以通过简单地增加阵列中微通道的密度来增加该二维分离系统的峰容量,也可以通过采用灵敏度更高的多通道激光诱导荧光检测系统来提高该二维分离系统的灵敏度。该系统耦联阶段需要较长的时间(5min)以使变性的蛋白质样品与SDS充分结合,这将导致聚焦蛋白质峰在耦联阶段的互扩散,进而降低第一维分离的效率和分辨率;同时,这种耦联模式使样品离散分布在一个平面上,也给检测带来困难。图5IEF2SDS凝胶电泳耦联芯片结构及相应5种模板蛋白质的芯片二维分离荧光成像图43Fig.5Chip structure ofIEF2SDS2GE coupling separationsystem and corresponding typical fluorescent images of on2chiptwo2dimensional separation of five model proteins43Tsai等44采用玻璃材质制作芯片,构建了以毛细管等电聚焦(cIEF)为第一维,阵列通道SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS2PAGE)为第二维的二维芯片分离系统(图6(a)。该二维分离系统在第一维cIEF通道的两侧分别制作了一个称为“空气门”的毛细管,并在第二维阵列分离通道的入口处制作了堆积毛细管,在完成cIEF之后,通过在这两个“空气门”中引入缓冲液,实现两维的连接,进而通过电驱动将第一维IEF分离之后的样品注入第二维阵列管道。采用该系统对血色素、肌球素、藻青蛋白和细胞色素c组成的蛋白质混合物进行了分离,并最终观察到了血色素的二维分离(图6(b)。Chen等45利用聚二甲基硅氧烷(PDMS)的特殊性能,在第一维等电聚焦完成后,将第二维通道粘合上去,进行第二维凝胶电泳,实现了在空间上多维分离模式的微型化。他们利用该系统成功分离了荧光标记的碳酸酐酯酶、牛血清蛋白和得克萨斯红标记857化 学 进 展第20卷 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/图6IEF与SDS PAGE耦联芯片结构及相应有色蛋白质混合物的二维分离图44Fig.6Chip structure of IEF2SDS PAGE coupling separationsystem(a)and corresponding typical image of on2chip two2dimensional separation of commercial colored protein samplemixture(b)44的卵清蛋白。Griebel等46采用PMMA材质制作芯片,构建了在固相pH梯度(immobilized pH gradients,IPG)胶条中进行的IEF为第一维,在300条平行微通道阵列中进行的CGE为第二维的二维芯片分离系统(图7)。芯片结构中含有一个固定IPG胶条的腔体,300条平行微通道阵列与该腔体垂直。在该腔体中制作了50m宽的缺口,通过电压切换将等电聚焦分离之后的样品从该缺口转移到二维分离通道。采用该系统成功地将Alexa 488标记的肌球素从第一维转移到第二维。图7IEF与SDS PAGE耦联芯片结构(a)及转移的肌球素的二维分离结果(b)46Fig.7Chip structure of IEF2SDS CGE coupling separationsystem(a)and corresponding separation result of transferredmyoglobin(b)464.2.5IEF与CZE或CGE的微阀接口耦联对于兼容缓冲和非兼容缓冲,以上耦联模式在分离分析过程中都无法完全避免缓冲溶液之间的互扩散。采用机械的微结构单元实现分离介质的隔离是解决二维分离缓冲溶液隔离的一条途径。Wang等47设计制作了集成在二维分离系统通道中的微阀结构,以微阀隔离两维的缓冲液,实现了IEF与高离子强度电泳(包括CZE及CGE)的耦联。他们对芯片上影响二维分离的各主要因素都进行了分析,包括微通道钝化、电渗流控制及IEF线性控制等。该二维分离系统首先在一个短管道内建立pH梯度从3到10的高分辨率IEF,当目标蛋白质绿色荧光蛋白、卵清蛋白移动到峰转移区域时,关闭一组微阀来隔离选定的蛋白质峰;然后打开另一组阀,将峰转移区域连接到第二维分离管道,峰转移区域的蛋白质被切换到第二维通道。这种微阀结构可以方便地耦联不同分离机理的分离模式,适合于复杂生物分子在线质谱分析预分离和预富集。由于含微阀结构的二维分离系统接口处存在死体积,而且峰转移区域是一维和二维的共用分离通道,每次分离只有峰转移区域的聚焦蛋白质才能被引入第二维进行分离,为了使该二维分离系统能够获得更高的峰容量,必须对芯片设计进行改进。4.2.6SDS2CGE与MEKC耦联图8SDS2CGE与MEKC耦联芯片结构(a)及数据转换以后的二维分离谱图(b)48Fig.8Chip structure of SDS2CGE2MEKC coupling separationsystem(a)and two2dimensional electropherogram obtained fromdata conversion(b)48SDS2CGE与MEKC之间具有一定的正交性,由于SDS2CGE与MEKC可在缓冲液中SDS浓度差异的条件下进行,因而能够以缓冲液兼容的方式进行芯片设计。Shadpour等48采用PMMA材质制作芯片构建了SDS2CGE为第一维,MEKC为第二维的兼容缓冲液二维芯片分离系统(图8)。实验首先进行70s的SDS2CGE电泳,再开始MEKC循环过程,系统进样是957第5期徐 溢等 蛋白质 多肽的微流控二维芯片电泳 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/进行015s的SDS2CGE电泳过程来实现的,然后将第一维的流出液引入到二维分离通道,每次MEKC循环的运行时间是10s。通过从一维SDS2CGE和MEKC实验提取二维分离参数,用该二维分离系统成功分离了麦胚凝集素等10种蛋白质组成混合物。实验数据表明该二维分离系统正交性为77%,理论峰容量为1 121(SDS2CGE贡献19,MEKC贡献59),实际峰容量约897。该二维分离系统采用了基于时间的进样方式,由于第一维中使用的筛分网络物大大降低了蛋白质的扩散系数,在第二维分离进行的过程中,停滞在第一维通道中的样品区带的扩展大大降低。该方式对蛋白质二维芯片电泳分离分析具有非常重要的意义。4.2.7 其它耦联模式单通道二维分离。Tabuchi等49对芯片上慢速中等增压技术进行了研究,并提出了在同一芯片分离管道中依据蛋白质尺寸和等电点的不同而实现的二维分离模式。实验采用电驱动或压力驱动使样品溶液充满进样通道,再利用压力驱动将样品节注入分离通道,然后在分离通道两端施加电压使得样品分离。当酸性样品溶液(pH=510)进入碱性缓冲溶液(pH=917)时,在慢速中等压力的条件下产生一个pH梯度,一种分子量为18kDa的磷蛋白(PI=519)及其磷酸化产物(PI=516)实现c IEF分离。由于运行缓冲含有3%聚二甲基丙烯酰胺,随后进行毛细管无胶筛分电泳,进而实现了这两种蛋白质的完全分离。ITP与GE耦联。Huang等50以ITP在线预富集技术为第一维,凝胶电泳(GE)分离为第二维,采用玻璃材质制作芯片构建了二维芯片分离系统。用该二维芯片分离系统对包括碳酸酐酶、卵清蛋白、牛血清白蛋白、伴清蛋白在内的4种SDS2蛋白质样品实现了预浓缩和分离,并使检测限提高了40倍。这种耦联模式对蛋白组学中低含量组分的分离分析具有重要的潜在应用价值。ITP或CZE与CZE耦联。采用ITP2CZE以及CZE2CZE耦联模式,结合电导检测方式,Silvertand等51将PMMA材质电泳芯片(IonChipTM)用于蛋白质二维分离分析。在ITP2CZE耦联模式的二维分离分析中,第一维ITP将肌球素样品浓缩约65倍,并将蛋白质混合物中迁移速度快的高浓度盐引入废液通道而达到脱盐作用。在CZE2CZE耦联模式的二维分离分析中,第一维CZE被用于移除蛋白质 肽混合物中的蛋白质,适于电泳分离前的样品纯化。4.3 接口和采样方式目前二维电泳芯片接口设计主要有两种方式:一种采用时间上的多维分离方式;另一种采用空间上的多维分离方式。时间上的多维分离方式是将第一维分离的样品通过反复多次进样转移到二维分离通道。这种方式是在第一维进样完成以后,在切换接口处采用门式进样将部分第一维流出物每隔几秒周期性地引入第二维管道,进行下一步分离。一种改进的采样控制方式48是首先检测出第一维分离中迁移速度最快的样品结到达切换接口的时间(T1),在T1之后再进行第二维的循环进样分离过程。在进行第二维循环分离的过程中,由于第一维通道中的样品处于停滞状态,将引起第一维分离效率的损失;实际应用中,可在第一维分离通道中使用高黏度介质以降低这种不利影响。空间上的多维分离方式是将第一维分离的样品一次性转移到第二维阵列分离通道。这种设计方式可以通过增加阵列中微通道的密度来增加二维分离系统的峰容量,但是该方式下的检测及对样品的定量分析相对困难。4.4 检测技术激光诱导荧光单点检测及荧光成像技术是目前用于微流控二维电泳芯片检测的主流技术。对于时间上的多维分离方式,采用激光诱导荧光检测技术即能满足要求。但是采用激光诱导荧光进行二维芯片电泳的单点检测,不利于样品迁移行为的全面在线观测,也可能遗漏或掩盖二维分离过程中的有效信息。对于空间多维分离方式,目前是采用荧光成像技术来实现,采用该方式进行微流控二维芯片电泳分离分析的定量测试尚有待完善。5 展望 微流控二维芯片电泳分离分析系统在蛋白组学中的应用研究还处于起步阶段,由于其高效、高分辨率,高峰容量和易于实现自动化等优点,在蛋白质组研究中具有良好的发展前景。目前蛋白质二维芯片电泳研究的着眼点在于接口设计,而对二维电泳芯片本身结构参数的优化,芯片本身性能的研究尚没有引起足够重视,在各种耦联模式正交性评价方面的研究尚不够完善。同时,将第一维分离之后的样品引入平行阵列管道进行二维分离具有高通量的特点,开发与之匹配的检测器非常必要。在具体应用方面,以微流控二维电泳芯片作为样品的前处理工067化 学 进 展第20卷 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/具,实现其与质谱检测的结合,也是蛋白质组研究解决方案的重要方法之一。参 考 文 献 1 Hille J M,Freed A L,Watzig H.Electrophoresis,2001,22(19):40354052 2 T olley L,JorgensonJ W,Moseley MA.Anal.Chem.,2001,73(13):29852991 3 Shen Y,Jacobs J M,Camp D G.Anal.Chem.,2004,76(4):11341144 4 Shen Y,Berger SJ,Smith R D.J.Chromatogr.A,2001,914(122):257264 5 Lemmo A V,Jorgenson J W.Anal.Chem.,1993,65(11):15761581 6 Wagner K,Racaityte K,Unger K K,et al.J.Chromatogr.A,2000,893(2):293305 7 He Y,Yeung E S,Chan K 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