microRNA-125b在口腔鳞状细胞癌患者血浆中的表达及意义.pdf

上海 口腔医学2 0 1 5年 2月 第 2 4卷第 1期 S h a n g h a i J o u r n M o f S t o ma t o l o g y Vo 1 2 4 No 1 F e b r u a r y，2 0 1 5 71 文章编号 1 0 0 6 7 2 4 8(2 0 1 5)0 1-0 7 1-0 5 mic r o R N A 一 1 2 5 b在 1：3 鳞状细胞癌患者血浆中的表达及意义 顾 文莉，叶冬 霞，吴静 静(1 上海交通大学医学院附属第九人 民医院检验科，上海2 0 0 0 1 1；2 上海市 口腔医学研究所，上海市 口腔医学重点实验室，上海2 0 0 0 1 1)摘要】目的：探讨 mi c r o R N A一 1 2 5 b(m i R 一 1 2 5 b)在 口腔鳞状 细胞癌(O S C C)患者血浆 中的表达及 临床意义。方法：用茎环 法反转 录 f R T)一 实时荧光 P C R法检测 8 5例 O S C C患者 和 4 6例健 康人血 浆中 m i R 一 1 2 5 b的表达水平，评估 其作 为 O S C C诊 断标志 的检 测效能。采 用 S P S S 1 7 0软件包 中的单 因素方差 分析和 R O C曲线分析对结 果进行统计 学处理 结果：反转录 P C R法可 特异性扩增 血浆 中的 mi R 一 1 2 5 b，与 正常对照组 相 比，O S C C患者组血浆 m i R 一 1 2 5 b 表达水平 显著上 调 f P 0 0 5)；R O C曲线分析 显示，血浆 m i R 一 1 2 5 b水 平可有效 区分 O S C C患 者和正常人群，其 曲线 下面积(A U C)达到 0 9 6 6；当确定 最佳截 断值为 3 4 6(f 0 l d值)时，血浆 mi R 一 1 2 5 b对 O S C C的诊断敏感 度和特异 度 分别达到 8 9 4 和 9 3 5。结论：鉴于其 良好的诊断效 能，血浆 m i R 一 1 2 5 b有望 成为具有潜在应 用价值的 O S C C生 物学标志物。关键词】口腔鳞状 细胞癌；微 R N A 一 1 2 5 b；血浆检测；生物标志物 f 中图分类号1 R 7 3 9 8 文献标志码l A Ex p r e s s i o n a n d c l i n i c a l s i g n i fi c a n c e o f p l a s ma mi c r o RNA-1 2 5 b l e v e l i n p a ti e n t s wi t h o r a l s q u a mo u s c e l l c a r c i n o m a G U We n l i ，YE D o n g x i a 2，WU J i n g-j i n g (1 D e p a r t m e n t o f C l i n i c a l L a b o r a t o r y,N i n t h P e o p l e S H o s p i t al,S h a n g h a i J i a o T o n g U n i v e r s i t y S c h o o l of Me d i c i n e S h ang h a i 2 0 0 0 1 1；2 S h a n g h ai R e s e a r c h I n s t i t u t e of S t o m a t o l o g y S h ang h ai K e y L abo r at o r y o f S t o ma t o l o g y S h a n g h ai 2 0 0 0 1 j，C h i n a)【A b s t r a c t P UR P OS E：T o e x p l o r e t h e e x p r e s s i o n a n d c l i n i c a l s i g n i fi c a n c e o f p l a s m a mi c r o R N A-1 2 5 b m i R一 1 2 5 b)i n p a t i e n t s w i t h o r a l s q u a mo u s c e l l c a r c i n o m a(o s c c)ME T HODS：B y S t e m-l o o p R T r e a l t i m e P C R b a s e d o n t h e S Y B R Gr e e n，we i n v e s t i g a t e d t h e e x p r e s s i o n o f p l a s ma mi R-1 2 5 b i n 8 5 OS C C p a t i e n t s a n d 4 6 h e a l t h y c o n t r o l s，t h e n e v a l u a t e d i t s d i a g n o s t i c p e rf o r ma n c e a s O S C C b i o ma r k e r Da t a a n a l y s i s w a s p e r f o rm e d wi t h S P S S 1 7 0 s o f t wa r e p a c k a g e f o r o n e w a y A N O V A a n d r e c e i v e r o p e r a t i n g c h a r a c t e r i s t i c(R O C)c u I T e R E S U L T S：S t e m-l o o p R T-P C R c o u l d s p e c i fi c a l l y a m p l i f y mi R-1 2 5 b i n p l a s ma T h e e x p r e s s i o n o f p l a s ma mi R-1 2 5 b wa s s i g n i fic a n t l y i n c r e a s e d i n p a t i e n t s wi t h OS CC c o mp a r e d w i t h h e a l t h y c o n t r o l s f P O 0 5)R O C r e s u l t s s h o w e d t h a t mi R-1 2 5 b c o u l d d i f f e r e n t i a t e O S C C f r o m h e a l t h y c o n t r o l s(A U C=0 9 6 6 1 As f o l d c h a n g e 3 4 6 wa s c h o s e n for o p t i ma l c u t o ff v a l u e，t h e d i a g n o s t i c s e n s i t i v i t y a n d s p e c i fi c i t y wa s 8 9 4 a n d 9 3 5。r e s p e c t i v e l y CONCLUS I ONS：Du e t o t h e s a t i s f a c t o r y d i a g n o s t i c p e rfo r ma n c e，p l a s ma mi R一1 2 5 b c a n b e u s e d a s a p r o mi s i ng b i oma r k e r i n OSCC S u p p o s e d b y N a t i o n a l N a t u r a l S c i e n c e F o u n d a t i o n o f C h i n a(8 1 1 0 1 6 4 2，8 1 2 0 2 1 3 2)Ke y wo r d s】O r a l s q u a m o u s c e l l c a r c i n o m a；m i R-1 2 5 b；P l a s ma d e t e c t i o n；B i o m a r k e r S h a n g h a i J S t o ma t o l，2 0 1 5。2 4(1)：7 1 7 5 口腔鳞状细胞癌o r a l s q u a mo u s c e l l c a r c i n o ma,O S C C 1 为头颈部最常见的恶性肿瘤之一，严重危害 人类健康 和生活质量。目前其 主要治疗手段是手术【收稿日期】2 0 1 4 1 0 1 3；【修回日期】2 0 1 4 1 2 1 0 【基金项 目】国家 自然科学基金(8 1 1 0 1 6 4 2，8 1 2 0 2 1 3 2)【作者简介】顾文莉(1 9 7 2-)，女，博士，副主任技师【通信作者】顾文莉，E ma i l：g u w1 7 2 g m a i i c o rn Y 2 0 1 5年版权归 上海 口腔 医学 编辑部所有 切 除，但预后不佳，术后生存率较低，与其解剖结构 复杂，局部复发和区域性淋巴结转移多见等有关。而 患者就诊及 明确诊断较晚也是原因之一。往往就诊 时原发病灶 已经很大且有深层组织浸润和淋 巴结 转移 因此 O S C C的早期诊断和早期治疗是控制病 情、提高生存率的关键。7 2 顾文莉 等 mi c r o R N A 一 1 2 5 b在 口腔鳞状细胞癌患者血浆中的表达及 意义 GU We n-l i，e t a 1 E x p r e s o n a n d c l i n i c a l s i g n i fi c a n c e o f p l 姗mi c r o R N A-1 2 5 b l e v e l i n p a ti e n t wi t h o r a l s q u a mo u s c e l l c a r c i n o ma 近年 来，微 小 R N A(m i c r o R N A s mi R N A s)在肿 瘤发生及发展方面的研究受到广泛关注 mi R N A s 是长 1 9 2 4个核苷酸的单链小分子 R N A 通过降解 靶 mR N A和抑制靶基因 mR N A翻译I t-2 1 参与调控个 体发育、细胞增殖和分化等生命活动 以及肿瘤的 发生、转移等病理进程 5-6 1。研究17-9 1 发现，mi R N A s 不仅存在于组织细胞 中，在血浆和血清、尿液、唾液、乳 汁等体液中也可存在。体液中 m i R N A s 组分及含量稳定 主要 由细胞 以分 泌泡形式选择性分泌到胞外 一旦被周围细胞摄取，即可充当信使 发挥细胞间信息传递作用I 。已经证 实，许多循环 mi R N A s 可作为不同疾病 的潜在判 断 指标【，”。因为生理状况、疾病种类 和病程不 同，其种 类和数量也不相同。研究发现 m i R 一 1 2 5 b在多种肿瘤中具有特异性 表达 不仅作为“癌基因”或“抑癌基 因”参 与对肿瘤 细胞的增殖、迁移及耐药机制的调控作用。而且外周 循环 中的 mi R 一 1 2 5 b还与肿瘤的生长、临床分期及 化疗药物敏感性有关 目前有关循环 mi R 一 1 2 5 b在 O S C C的表达情况报道较少 本研究 旨在观察 O S C C 患者外周血中 mi R 一 1 2 5 b的表达 评价其作 为 O S C C 诊断用生物学标志物的检测效能。1材 料与 方法 1 1 样本选择 研 究设 立正 常 对 照组 和 口腔鳞 状 细 胞癌 组 后 者又分为 3个亚组：原发肿瘤组、复发肿瘤组以及早 期肿瘤组。肿瘤组样本共 8 5例，来 自上海交通大学 医学院附属第九人 民医院 2 0 1 2年 5月一2 0 1 2年 9 月问的住院患者 均由组织病理确诊，早期及原发肿 瘤患者未进行过化疗 和放疗；其 中 男 5 6例，女 2 9 例，平均年龄 6 0 5 9岁。对照组样本 4 6例，来 自同期 健康体检人群，均无 口腔、心、肝、肾以及其他慢性疾 病，无肿瘤家族史；其中，男 3 8例，女 8例，平均年龄 6 3 8 0岁 各肿瘤组与对照组 间年龄均无显著差异 f 尸 0 0 5)。具体病例资料见表 1。表 1 病例资料 总结 Ta b l e 1 S u mma r y o f c a s e s i n c l u de d i n t h e s t ud y 1-2 标本采集及保存 肿瘤组病例均于术前采血 所有病例均采集空 腹肘静脉血 2 mL E D T A抗凝 并尽快进行血浆分 离，即 1 0 0 0 g 离心 1 0 m i n，分离血浆，并按 4 0 0 I _ 管 分装，一 8 0 冷冻保存。注意避免反复冻融。所有标本 无溶血、无脂浊。1 3 材料 和试 剂 血清 m i c r o R N A提取纯化试剂、反转 录试剂、C 0 m S Y B R q P C R试剂购 自上海诺伦生物 医药技 术 有限公司：反转录及扩增所需特异引物由上海生工 生物公司合成。实时荧光定量 P C R仪 B i o r a d(I Q 5 1 购 自美 国伯乐公 司。1 4血浆样 品 R N A提取 每份血浆标本 2 0 0 L中加入 1 n m o l L外源 内 参 C e l m i R 一 3 9 1 0 1x L按照标本 5倍体积加入裂解 液 I J B。混合均匀，室温放置 2 3 mi n后 严格按照试 剂操作说 明提取 R N A，并置一 8 O c I=保存。1 5 反转 录及实时荧光定量 P C R 在 5 u L血浆 R N A 中加人 m i R一 1 2 5 b及 C e l mi R 一 3 9的特异引物进行反转录。其 中 C e l m i R 一 3 9 作为内参基因，反应条件：1 6、2 0 mi n，4 2、3 0 mi n，8 5、1 0 mi n。最后以反转录产物 2 L作为模板，采 用 C o mS Y B R q P C R试剂盒进行实时荧光定量 P C R 检测。反应条件：9 4、2 m i n，然后 9 4、1 5 s，6 2、4 0 s 4 0个循环 通过熔解曲线和琼脂糖凝胶电泳确 定 扩增 产物 的 特异 性 采 用 2 一 舳 相对 定量 法 比较 不同肿瘤组与正常对照组间血浆 m i R一 1 2 5 b的表达 差异 结果 以不 同组间目的基因拷贝数的比值(F o l d 值)表示。其中，C t=目的基因 C t 值一 内参基因 C t 值 aC t=肿瘤组 C t 一 正常组 C t。1 6 统计学分析 数据以面 s 表示 采用 S P S S 1 7 0软件包进行统 计学处理 组间比较采用单因素方差分析，均数之问 的两两比较采用 L S D检验 诊断性能评估采用 R O C 曲线分析 P 0 0 5为差异具有显著性。2结果 2 1 P C R产物分析 目的基 因 mi R 一 1 2 5 b和 内参基 因 C e l mi R一 3 9 的熔解 曲线均显示熔解温度均一，波形锐利，波峰对 应温度与预期产物 T m值一致(图 1 A、B)。琼脂糖凝 胶电泳显示 P C R产物条带与预期长度一致 f 带 1 为 上海 口腔 医学2 0 1 5年 2月第 2 4卷第 1 期 S h a n g h a i j o u ruo f S t o ma t o l o g y Vo 1 2 4 No 1 F e b r u a r y，2 0 1 5 75 有 望 成为 N S C L C特异 的 实验 室诊 断 指标 指 导 临床 分期。本研究发现 与正常对照组相比 O S C C患者血 浆 中 mi R 一 1 2 5 b含量显著增加 无论是原发或是复 发病例 甚至 9 0 早期癌变患者血浆 mi R 一 1 2 5 b水 平均不 同程度上调。R O C分析结果显示，曲线下面 积 A U C达到 0 9 6 6 表明血浆 m i R 一 1 2 5 b水平可有 效区分 O S C C患者和正常人 当确定最佳截断值为 3 4 6时 其诊断敏感度和特异度分别达到 8 9 4 和 9 3 5。因此 血浆 mi R 一 1 2 5 b是具有潜在应用价值 的 O S C C临床辅助诊断标志物 利益冲突声明：无【2 【3】【4 5 6】8】9 1 0】【参考文献】B a r t e l DP Mi c r o RNAs：t a r g e t r e c o g n i t i o n f u n c t i o n s J C e l l，2 0 0 9，1 3 6(2)：2 1 5-2 3 3 Ba r t e l DPMi c r o RNAs：g e n o mi c s，b i o g e n e s i s，f u n c t i o n J 1 C e l l，2 0 0 4，1 1 6(2)：2 8 1-2 9 7 a n d r e g u l a t o r y 【1 1 【1 2 【l 3 1 4 f 1 5 3 【1 6 me c h a n i s m，“d 1 7 Es q u e l a Ke r s c h e r A，S l a c k F J On e o mi 一 mi c r o RNAs wi t h a r o l e i n c a n c e r【J 1 N a t R e v C a n c e r，2 0 0 6，6)：2 5 9-2 6 9 J a c k s o n R J，S t a n d a NHo w d o mi c r o RNAs r e g u l a t e g e n e e x p r e s s i o n【J S c i S T K E，2 0 0 7，2 0 0 7(3 6 7)：r e 1 J a n n o t G，S i ma r d MJ Tu mo u r r e l a t e d mi e mRNAs f u n c t i o n s i n C a e n o r h a b d i t i s e l e g a n s f J】O n c o g e n e，2 0 0 6，2 5(4 6)：6 1 9 7 6 2 O 1 L u J，Ge t z G，Mi s ka EA，e t a1Mi c roRNA e x p r e s s i o n p r o fi l e s c l a s s i f y h u m a n c a n c e r s J N a t u r e，2 0 0 5，4 3 5(7 0 4 3)：8 3 4-8 3 8 C o e z MA，Cali n GAMi e r o RNA i d e n t i fic a t i o n i n p l a s ma a n d s e r u m：a n e w t o o l t o d i a g n o s e a n d mo n i t o r d i s e a s e s J _ E x p e a O p i n B i o l T h e r,2 0 0 9，9(6)：7 0 3 7 1 1 Pa r k NJ Z h o u H。El a s h o ff D e t a 1 S a l i v a r y mi c r o RNA：d i s c o v e ry，c h a r a c t e riz a t i o n，a n d c l i n i c a l u t i l i t y f o r o r a l c a n c e r d e t e c t i o n【J C l i n C a n c e r R e s，2 0 0 9，1 5(1 7)：5 4 7 3-5 4 7 7 Ha nk e M，Ho c h a m D，Wa me c k e J M，e t a 1 A r o b u s t me t h o d o l o g y t o s t u d y u r i n e mi e mRNA a s t u mo r ma r k e r：mi c r o RNA-1 2 6 a n d mi c r o R N A一 1 8 2 a r e r e l a t e d t o u r i n a ry b l a d d e r c a n c e r l J U r o l O n c o l，2 0 1 0，2 8(6)：6 5 5 6 6 1 Va l a d i H，Ek s t r o m K，B o s s i o s A，e t a 1 Ex o s o meme d i a t e d t r a n s f e r o f mRNAs a n d mi c r o RNAs i s a n o v e l me c ha n i s m o f g e n e t i c e x c h a n g e b e t w e e n c e i l s J N a t C e l l B i o l，2 0 0 7，9(6)：6 5 4 一 1 8 【1 9】2 0】2 1 2 2 6 5 9 Zh e n g D，Ha d d a d i n S，Wa n g Y，e t a 1 Pl a s ma mi c r o RNAs a s n o v e l b i o m a r k e r s f o r e a r l y d e t e c t i o n o f l u n g c a n c e r【J J I n t J C l i n E x p P a t h o l，2 0 1 1,4(6)：5 7 5-5 8 6 Croc e C MC a u s e s a n d c o ns e q u e n c e s o f mi c r o RNA d y s r e g u l a t i o n i n c a n c e r J 1 N a t R e v G e n e t，2 0 0 9，1 0(1 o)：7 0 4 7 1 4 P ark NJ，Zh o u H，El a s h o ff D，e t a1 S a l i v a r y mi c r o RNA：d i s c o v e ry，c h a r a c t e riz a t i o n，a n d c l i n i c al u t i l i t y for o r a l c a n c e r d e t e c t i o n J J C l i n C a n c e r R e s，2 0 0 9，1 5(1 7)：5 4 7 3-5 4 7 7 Mi t c h e l l P S，Pa r k i n RK，J(r 0 h EM，e t a 1 Ci r c u l a t i n g mi c r o RNAs a s s t a b l e b l o o d-b a s e d ma r k e r s for c a n c e r d e t e c t i o n J 1 P roc N a t l A c a d S c i U S A，2 0 0 8，1 0 5(3 o】：1 0 5 1 3-1 0 5 1 8 Ta y l o r DD，Ge r c e l-Ta y l o r CM i c r o RNA s i gn a t u r e s o f t u mo r d e ri v e d e x o s o m e s a s d i a g n o s t i c b i o m a r k e r s o f o v a r i a n c a n c e r叨 G y n e c o l O n c o l，2 0 0 8，1 1 0(1)：1 3-2 1 S e mp e r e L F，Fr e e ma n t l e S，P i t h a Ro we I，e t a 1 Ex p r e s s i o n p r o f i l i n g o f ma mma l i a n mi c r o RNAs u n c o v e r s a s u b s e t o f b r a i n e x pr e s s e d mi c r o RNAs wi t h po s s i b l e r o l e s i n mu r i n e a n d h u ma n n e u r o n a l d i f f e r e n t i a t i o n【J G e n o m e B i o l，2 0 0 4，5(3)：R1 3 L e e YS，Ki m HK，Ch u n g S，e t a 1 De p l e t i o n o f h u ma n mi c r o RNA mi R-1 2 5 b r e v e a l s t h a t i t i s c rit i c a l for t h e p r o l i f e r a t i o n o f d i f f e r e n t i a t e d c e l l s b u t n o t for t h e d o wn-r e g u l a t i o n o f p u t a t i v e t a r g e t s d u ri n g d i f f e r e n t i a t i o n J J B i o l C h e m，2 0 0 5，2 8 0(1 7)：l 6 6 3 5-1 6 6 4 1 S c h a e f e r A，J u n g M，Mo l l e n k o p f HJ，e t a1 Di a gno s t i c a n d p r o g n o s t i c i mp l i c a t i o n s o f mi c r o RNA p r o f i l i n g i n p r o s t a t e c a r c i n o ma J I n t J C a n c e r，2 0 1 0，1 2 6(5)：1 1 6 6 1 1 7 6 Ma t t i e MD，Be n z CC，B o we r s J，e t a1Op t i mi z e d h i g h t h r o u g h p u t mi c r o RNA e x p r e s s i o n p r o fil i n g p r o v i d e s n o v e l b i o ma r k e r a s s e s s me n t o f c l i n i c al p r o s t a t e a n d b r e a s t c a n c e r b i o p s i e s【J Mo l Can c e r 20 0 65：2 4 W a n g H，Ta n G，Do n g L，e t a 1 Ci r c u l a t i n g Mi R 一1 2 5 b a s a mark e r p r e d i c t i n g c h e mo r e s i s t a n c e i n b r e a s t c a n c e r J J P L o S O n e，2 0 1 2，7(4)：e 3 4 2 1 0 T a ng F，Zh a ng R，He Y，e t a 1 Mi c r o RNA-1 2 5 b i n d u c e s me t a s t a s i s b y t a r g e t i n g S TARD1 3 i n MC F-7 a n d MDA-MB一 2 3 1 b r e a s t c a n c e r c e l l s f J 1 P L o S O n e，2 0 1 2，7(5)：e 3 5 4 3 5 Ma Y，T i a n Z，Z a n g W C i r c u l a t i n g mi R-1 2 5 b i s a n o v e l b i o ma r k e r for s c r e e ni n g n o n-s ma l l c e l l l u n g c a n c e r a n d p r e d i c t s p o o r p r o g n o s i s J -J C a n c e r R e s C l i n O n c o l，2 0 1 2，1 3 8(1 2)：2 0 4 5 2 O5 O