GST_talin1融合蛋白的原核表达及纯化.pdf

收稿日期:2007-12-22;修回日期:2008-01-11作者简介:吴 爽(1979-),女,硕士,助教,教学和研究方向,细胞生物学,E2mail:;通迅作者:耿建国(1955-),男,博士,研究员,研究方向,细胞粘连与迁移。GST2talin1融合蛋白的原核表达及纯化吴 爽1,2,耿建国2(1广东药学院基础学院组织胚胎教研室,广州 510006;2中科院生化细胞研究所分子细胞生物学实验室,上海 200031)摘 要:应用PCR方法扩增talin1的cDNA,并将其重组入谷胱甘肽转硫酶融合基因表达载体pGEX24T21中,获取人源的GST2talin1融合蛋白,为下阶段深入的研究talin1的结构、功能、及其与之相互作用的蛋白打下基础。经酶切、序列鉴定,选择正确重组子,将其质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,用Glutathione Sepharose 4B柱纯化,western blot鉴定。克隆得到了一个2400bp的talin1的cDNA片断,重组质粒目的DNA测序正确,纯化出分子量约为12116kD的融合蛋白。用基因工程方法使GST2talin1重组质粒在原核细胞表达并成功纯化出GST2talin1融合蛋白。关键词:talin;P2 选凝素;GST2 融合蛋白;亲和层析中图分类号:Q51文献标识码:A文章编号:1008-9632(2008)03-0033-03P-选凝素(P-selectin)是一种由细胞产生的粘附分子(adhesion molecules),存在于细胞表面,能够介导细胞与细胞间或细胞与基质间相互接触和结合。其在炎症反应、凝血机制、甚至在某些肿瘤转移等方面发挥重要作用1。一直以来P2selectin受到许多研究者的青睐。P2selectin分子的特性到目前为止,人们已有较丰富的研究。本实验室以P2selectin的cytoplasmicdomain为饵从人白细胞cDNA文库中筛选到几个基因,经测序可知其中之一为talin1(从第1672个氨基酸残基到蛋白末端)。因此本试验利用重组DNA技术,获得talin1的cDNA,构建了GST2talin1融合蛋白表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化该融合蛋白,为进一研究talin1与P2selectin是否存在相互作用及相互作用机制,奠定了基础。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 菌株、质粒 人源talin1的cDNA及融合表达载体pGEX24T21为实验室保存。DH5及BL21大肠杆菌感受态购自上海申能博采生物公司。1.1.2 生化试剂和分子生物学试剂 引物由上海生工生物有限公司合成,限制性内切酶、T4DNA连接酶购自Promega公司,1kb DNA Marker、DNA片断快速纯化及回收试剂盒购自北京鼎国生物技术公司,PCR试剂购自日本TAKARA公司,氨苄青霉素为上海华舜生物公司产品。1.2 方法1.2.1目的基因的扩增及纯化 根据已公布的人源talin1的cDNA序列设计talin1的引物,上游引物T1的序列为5 23at cag tag gaa ttc atg cg gga cct aga cca gg;下游引物T2的序列为5 23ga agt cat ctc gag gtg ctc atctcg aag ctc tg,在上下游引物中分别加入EcoRI和XhoI酶切位点。PCR反应总体积为50L,包括ddH2O4015L、10buffer 5L、4dNTP 1L、上下游引物各1L、模板1L、La Taq酶015L。反应条件为:942min,9450s、5650s,722min,725min,共35个循环。所获得的PCR产物以1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。将目的条带切下,用DNA片断快速纯化回收试剂盒回收。1.2.2pGEX24T212talin1重组质粒的构建 将纯化的PCR产物和pGEX24T21载体用EcoRI和XhoI双酶切后,分别回收酶切产物。取回 收后的talin1片 断815L,载体片断015L,10T4DNA连接酶buffer1L,T4DNA连接酶013L,16 连接过夜。1.2.3重组质粒的筛选和鉴定 将连接产物全量转化入DH5感受态细菌,在含有氨苄青霉素(Amp)的LB上37 筛选培养过夜。次日挑取单个菌落,培养12h后小量抽取质粒,用EcoRI和XhoI双酶切,筛选阳性重组质粒并送上海英骏生物技术有限公司测序。33第25卷第3期2008年6月生 物 学 杂 志JOURNAL OF B I OLOGYVol125No13Jun,20081.2.4 融合蛋白的诱导表达 将测序正确的重组质粒转化入BL21感受态细菌,在含有氨苄青霉素(Amp)的LB上37筛选培养过夜后挑取单个菌落,经小抽酶切鉴定后保存菌液。将保存的pGEX24T212talin1菌液经37 过夜培养活化,以1200稀释接种于10mL的LB培养基中(含Amp 100g/mL),振荡培养3h至OD600016时,取出100L的菌液作为阴性对照,然后加入终浓度为015mmol/L的IPTG,诱导培养4h,取菌液收集菌体,超声破菌后离心,保存沉淀和上清,8%的SDS2PAGE电泳后考马思亮蓝染色鉴定。1.2.5表达产物的亲和层析及纯化 11214所述的方法诱导表达效果较好,按此方法诱导1L菌液,5000r/min,4 离心15min,将细菌沉淀重悬于20mL1PBS(pH值714)中,并加入终浓度为2mM/L的PMSF,超声破碎后加入终浓度为10%的Triton2100,冰上放置30min,然后12000r/min,4离心15min,取上清准备亲和层析。将2mL Glutathione Sepharose 4B加入柱子中,用250mL左右的1PBS(pH值714)洗去保护液至柱子平衡,然后加入上述上清,使蛋白充分吸附。用1PBS(pH值714)洗涤层析柱至重新平衡,最后用洗脱液将目的蛋白洗脱。按照分子克隆(第三版)常规方法进行透析。紫外分光光度计测蛋白浓度。1、DNA标准分子量;2、PCR扩增的人源talin1图1PCR结果Fig 1 Amplification result of PCR1.2.6Western blot检测 在两个EP管中各加入20L的Glutathione Sepharose 4B球珠,TBS彻底洗去保护液后,分别加入含有1g GST蛋白和1g GST2tal2in1融合蛋白的1mL的TBS,4翻滚结合215 h。4下1800r/min离心2min,收集GST2Sepharose 4B球珠,用TBS洗涤3次,彻底洗去未结合的杂蛋白,收集GST2Sepharose 4B球珠,球珠中即为纯化的GST2talin1融合蛋白和GST蛋白。按常规方法进行western blot检测。特异性抗GST蛋白的单克隆抗体为试验室保存。2 结果2.1 目的基因的扩增及纯化PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,在大小约为214Kb的位置有单一条带,与目的片断大小位置相符。2.2 重组质粒的鉴定结果pGEX24T212talin1重组质粒经EcoRI/XhoI双酶切后,有约214Kb和419Kb的两条酶切片断,分别与扩增的talin1目的片断和pGEX24T21载体片段大小相符。1、DNA标准分子量;2、酶切鉴定后的pGEX24T212talin1图2 重组质粒鉴定结果Fig 2 Results of recombinant plamid2.3 测序结果对pGEX24T212talin1重组质粒进行测序,结果显示与人源talin1 cDNA阅读框序列一致。2.4 大肠杆菌的talin12GST蛋白表达及纯化结果SDS2PAGE电泳显示在细菌裂解液中有一条120kD的较粗的蛋白条带,经IPTG诱导表达后有所增加,结果见图3。经亲和层析后,western2blot检测到在120kD处有唯一条带,结果见图4。1、蛋白分子量;2、阴性对照;3、菌体中表达的蛋白;4、上清中表达的蛋白图3pGEX24T212talin1的SDS2PAGE的电泳结果Fig 3 Analysis of pGEX24T212talin1 SDS2PAGE3 讨论Talin属于“band 411”蛋白超家族,是一种重要的细胞骨架肌动蛋白结合蛋白2。能够将成纤维细胞上的细胞表面受体蛋白(如:整合素蛋白)偶联到肌动蛋白细胞骨架上3。由calpain酶解而产生的talin头部区域可以结合并活化整合素蛋白(integrins)2。在成43第25卷第3期2008年6月生 物 学 杂 志JOURNAL OF B I OLOGYVol125No13Jun,2008纤维细胞中通过RNA干涉技术降低talin的表达,可以减弱整合素的活化和其介导的粘附3。分子内荧光能量共振转移实验表明:talin头部区域诱导了LFA21胞内区的活化和分布4。在淋巴细胞中,整合素 2 亚基胞内区与talin的结合同样对整合素吸引力(通过构象的变化)和亲合力(通过横向的扩散和形成簇)起到调控作用5。1、pGEX24T212talin1蛋白;2、GST蛋白图4pGEX24T212talin1蛋白Western blot分析结果Fig 4 Analysis of pGEX24T212talin1 Western blotP2selectin隶属选凝素家族(一类细胞粘附分子),表达于血小板-颗粒的膜上和内皮细胞韦伯氏小体的膜上。在炎症信号及血栓形成信号刺激下,P2selec2tin通过胞吐作用迅速转移至细胞膜表面,从而介导了白细胞、血小板和肿瘤细胞的粘附。用免疫胶体金电镜技术发现在肿瘤坏死因子和凝血酶分别刺激HU2VECs细胞后,P2selectin在细胞表面成簇分布,从而提高了对其结合配基的亲合力的效价。实验室通过酵母双杂交试验,以P2selectin的cytoplasmic domain为饵筛选出talin1可以与P2selectin cytoplasmic domain相结合。既然talin1被认为介导了白细胞上整合素的成簇分布,我们推测也许它也介导了血管内皮细胞上的P2selectin成簇分布。为了具体研究该蛋白质是否能够真正的与P2selectin cytoplasmic domain相结合;它与P2selectin的结合后如何来调控P2selectin的分选或参与哪些信号通路,我们表达了GST2talin1的融合蛋白。本试验根据Genebank提供的人源talin1的cDNA序列以及pGEX24T21的序列设计的PCR扩增引物,上游引物含有EcoRI酶切位点,下游引物含有XhoI酶切位点。扩增产物经序列分析后,定向克隆入pGEX24T21,并在IPTG的诱导下在大肠杆菌中获得表达,经Glu2tathione Sepharose 4B亲和层析后获得了GST2talin1的融合蛋白。我们构建的GST2Talin融合蛋白表达载体,可以有效的表达GST2talin1融合蛋白。为进一步研究p2selectin与talin1的相互作用打下坚实的基础。参考文献:1Ley K1The role of selectins in inflammation and diseaseJ 1TrendsMolMed 2003;9:263812Calder wood D A,GinsbergM H1Talin forges the links be2tween integrins and actinJ 1Nat Cell Biol12003.5,69469713 Kim M,Carman C V,Springer T A1Bidirectional trans2membrane signaling by cytoplasmic domain separation in in2tegrinsJ 1Science 20031301,1720172514Carman C V,Springer TA1Integrin avidity regulation:arechanges in affinity and conformation underemphasized J Curr,Opin CellBiol12003115,54755615Geng J G,Bevilacqua M P,Moore K L,et al.Rapid neu2trophil adhesion to activated endothelium mediated by G MP2140J 1Nature 1990 343,7577601The expression and purification of fusion protein GST2talin 1WU Shuang1,2,GENG Jian2guo2(11Department of Histology and Embryology,School ofBasic Courses of GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou 510006;21Laboratory ofMolecular CellBiology,Institute ofBiochemistryand CellBiology,Shanghai 200031,China)Abstract:To obtain the human GST2talin1 fusion protein for further studying the structure and biogical function of a humannovel talin1 protein and the protein which interactwith talin,Talin1 cDNA was amplified by PCR and recombined into pGEX24T21 vector1The accuracy ofDNA sequence was identified by the assay of restrictional enzyme and sequencing.The recombinantclone was transformed into competent expressive cellsofE1coliBL21(DE3).The protein expressionwas induced by IPTG.The fu2sion protein was purified by Glutathione Sepharose 4B,and identified bywestern blot1Result showed that GST2talin1 fusion pro2tein could be expressed in prokaryotic cells byway of gene engineering and purified successfully1Keywords:talin;P2selectin;GST fusion protein;affinity chromatography53第25卷第3期2008年6月生 物 学 杂 志JOURNAL OF B I OLOGYVol125No13Jun,2008