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土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选与鉴定及淀粉酶活的测定

摘 要：从饭堂门口和生化楼楼下的土壤中分离、纯化、培养获得七个菌株，其中五个为能分泌淀粉的芽孢杆菌，通过一系列生理生化实验，对其中两个菌株的种属进行了初步鉴定，并对其中一株菌所产的淀粉酶活力进行了测定。
关键字：土壤 芽孢杆菌 淀粉酶 鉴定 活力

土壤微生物类群在全球自然生态系统中具有不可替代的作用,它推动着生态系统的能量流动和物质循环,维持生态系统的正常运转,是生态系统中的重要组成部分,在土壤中的分布既反映土壤、植物和气候等综合因素对微生物的影响和作用,同时其生命活动也反映出土壤肥力、土壤改良与植物营养的密切关系。芽孢杆菌是土壤细菌中最具活力的部分之一,也是土壤细菌的主要种群之一。
本实验通过小组合作，由老师指导，小组自行设计、进行实验，对土壤微生物进行分离、纯化及鉴定，发酵及产物测定，对学生的实验能力进行一个比较全方面的锻炼和培养。
（1）了解微生物分离纯化的原理及微生物分离纯化常用方法和技术；
（2）掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理及方法；
（3）掌握微生物的摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理及方法；
（4）培养学生自行设计实验流程、综合分析解决问题及判断实验结果的能力；
（5）对所学习过的微生物实验方法进行综合技能训练；
（6）从不同环境土壤样品中筛选出能产淀粉酶的芽孢杆菌，并分析比较各产淀粉酶菌株的产淀粉酶活力及总结各芽孢杆菌在土壤中的分布情况。
1.原理及方法概述
1.1原理
1.1.1芽孢杆菌
1.1.1.1形态学特性：芽孢杆菌细胞呈直杆状，0.5-2.5μm×1.2-10μm，常以成对或链状排列，具圆端或方端。细胞染色大多数在幼龄培养时呈现革兰氏阳性，以周生鞭毛运动。芽孢椭圆、卵圆、柱状、圆形，能抗许多不良环境。
1.1.1.2生理学特性：芽孢杆菌属，革兰氏阳性，严格需氧或兼性厌氧的有荚膜的杆菌。多数为腐生菌,主要分布于土壤、动植物体表及水体中。该属细菌的重要生理特性是能够产生对对热、pH和盐各种多样性的不利条件具有特殊抵抗力的芽孢。生孢不被氧所抑制。发现于不同的生境，少数种对脊椎动物和非脊椎动物致病。）
1.1.2淀粉酶 淀粉酶是催化淀粉水解的一类酶的总称，广泛存在于动物、植物和微生物中。目前生产应用的淀粉酶主要来源于微生物，并集中在几种细菌和真菌中，尤其以芽孢杆菌所产的淀粉酶较多。其原因首先芽孢杆菌属中能产生淀粉酶的菌种较多；其次，芽孢杆菌属产的淀粉酶有较好的应用价值。土壤中可利用的微生物很多，因此从土壤中筛选产淀粉酶的芽孢杆菌，分离纯化，并进行酶活测定，能获得有经济价值比较高的菌株。
1.1.4生理生化鉴定 由于各种细菌具有不同的酶系统，所以它们能利用的底物（如糖、醇及各种含氮物质等）不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不相同，因此可利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌。根据《伯杰氏细菌学手册》，在芽孢杆菌属中，我们鉴定用的生理生化实验有：（1）革兰氏染色试验（2）芽孢染色试验(3)淀粉水解试验（4）吲哚试验（5）VP试验（6）细菌糖发酵试验（葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇）（7）耐盐试验（8）温度实验（9）PH试验(10)柠檬酸盐利用试验(11)硝酸盐还原试验(12)明胶液化试验(13)酪氨酸水解试验(14)酪素水解试验(15)运动性试验（鞭毛穿刺试验）(16)接触酶试验(17)溶菌酶试验(18)卵磷脂试验 (19) 马尿酸盐实验（不做）（20）苯丙氨酸实验（不做）（21）精氨酸水解实验（不做）
1.2方法
1.2.1分离纯化方法 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。由于芽孢具有较强抗热能力，分离纯化时可采用热处理的方法，高温加热处理，杀死样品中所有不含芽孢的菌类，在培养过程中得到很好的富集。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。
1.2.2单染色 用一种染色剂对涂片进行染色，简便易行，适于进行微生物的形态观察。在一般情况下，细菌菌体多带负电荷，易于和带正电荷的碱性染料结合而被染色。因此，常用碱性染料进行单染色，如美蓝、孔雀绿、碱性复红、结晶紫和中性红等。若使用酸性染料，多用刚果红、伊红、藻红和酸性品红等。使用酸性染料时，必须降低染液的PH值，使其呈现强酸性（低于细菌菌体等电点），让菌体带正电荷，才易于被酸性染料染色。
1.2.3芽孢染色 细菌的芽孢的形状、大小和着生位置是鉴定的重要依据。芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般的染色法只能使菌体着色而芽孢不着色。其方法就是根据芽孢既难以染色而一旦着色后又难以脱色这一特点而设计的。
1.2.4革兰氏染色 它可以将所有细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法，可以把它归到生理生化鉴定上。其方法是先用结晶紫初染，再加媒染剂碘液以增加染料与细胞的亲和力，使结晶紫和碘在细胞膜上形成相对分子质量较大的复合物，然后进行脱色（乙醇），最后用沙黄液复染。凡细菌不被脱色而保留初染剂的颜色者为阳性；如被脱色后又染上复染剂颜色（红色）者则为阴性。
1.2.5淀粉水解试验 有些细菌具有合成淀粉酶的能力，可以分泌胞外淀粉酶。淀粉酶可以使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，淀粉水解后遇碘不再变蓝色。因此可用于筛选产淀粉酶的芽孢杆菌。
1.2.6摇瓶发酵的测定原理
（1）淀粉—水解（淀粉酶）—生成麦芽糖（还原糖）
（2）在碱性条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸共热，3,5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质)，还原糖则被氧化成糖酸及其它产物。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度量呈一定的比例关系，在540nm波长下测定棕红色物质的吸光值，查对标准曲线可求出样品中还原糖的含量。
（3）40℃时在5min内水解淀粉释放1mg麦芽糖所需的酶量为1个酶活力单位（U）
计算公式:酶活力单位（U）=C酶×V酶×n
（C酶—酶液中麦芽糖的浓度 V酶—提取液的总体积 n—酶液的稀释倍数）
2.实验材料与用具
2.1材料 土样2种
样品1：生化楼楼下河道边
样品2：菊苑饭堂后门附近
2.2培养基
2.2.1牛肉膏蛋白胨培养基
牛肉膏 （3g） 蛋白胨（10g）
氯化钠 （5g） 琼脂（15g）
蒸馏水 （1000ml）
pH 7.2-7.4
2.2.2淀粉水解试验培养基（淀粉牛肉膏蛋白胨琼脂培养基）
可溶性淀粉（2g） 牛肉膏（3g）
蛋白胨（10g） 氯化钠（5g ） 琼脂（15g）
蒸馏水（1000ml）
pH 7.2-7.4
2.2.3硝酸盐培养基
甲液（对氨基苯磺酸0.8g+5mol/L醋酸100mL
乙液（α-奈胺0.5g + 5mol/醋酸100mL）
硝酸钾(0.2g) 蛋白胨 (5g)
蒸馏水(1000ml)
pH 7.2-7.4
2.2.4卵黄试验培养基
营养琼脂 (3.3g) 葡萄糖(1g)
配成100ml培养基
卵黄盐水(5ml)
卵黄、盐水分别灭菌，按1:1制取培养基与卵黄盐水混合倒平板
2.2.5吲哚实验培养基
蛋白胨 (10g) 氯化钠 (5g)
蒸馏水 (1000ml)
pH 7.2-7.4
2.2.6 VP实验培养基
蛋白胨(10g) 氯化钠 (5g)
葡萄糖 (5g) 蒸馏水 (1000ml)
pH 7.2-7.4
2.2.7糖发酵实验培养基
葡萄糖/木糖/甘露醇/阿拉伯糖 （10g）
蛋白胨(10g) 氯化钠 (5g)
K2HP04(0.2g) 1％溴甲酚紫(3ml)
蒸馏水 (1000ml)
pH 7.2-7.4
2.2.8酪氨酸水解试验培养基
酪氨酸(0.5g稀释到10ml)
营养琼脂(3.3g稀释到100ml)
（分开灭菌，酪氨酸溶液110℃，营养琼脂121℃，用时再混合，）
2.2.9酪素分解试验培养基
脱脂奶粉（5g，稀释到50ml）
琼脂（1.5稀释到50ml）
（分开灭菌，酪素110℃，营养琼脂121℃，现用现倒）
2.2.10运动性试验培养基
可溶性淀粉（2g） 牛肉膏(3g)
蛋白胨(10g) 氯化钠(5g)琼脂 (5g)
蒸馏水 (1000ml)
pH 7.2-7.4
2.2.11柠檬酸盐试验培养基(制斜面）
氯化钠(5g)　 硫酸镁(MgSO4·7H2O)(0.2g) 磷酸二氢铵(1g) 磷酸氢二钾 (1g)
0.2%溴麝香草酚蓝溶液 (40mL)
柠檬酸钠(5g)
蒸馏水(1000mL)
pH 6.8
2.2.12牛肉汤培养基
牛肉膏(3g) 蛋白胨(10g) 氯化钠(5g)
蒸馏水(1000ml) 琼脂(20g)
pH 7.2-7.4和pH 5.2
2.2.13种子培养基
可溶性淀粉（2.0%） 酵母膏（0.5%）
蛋白胨（0.5%） NaCl（0.5%） KH2PO4（0.1%）蒸馏水（100mL）
pH=6.0
2.2.14发酵培养基：
可溶性淀粉（2.0%）酵母膏（0.5%）
蛋白胨（0.5%） NaCl（0.5%） KH2PO4（0.1%）CaCl2·2H2O（0.05%）MgSO4·7H2O(0.05%)
FeSO4·H2O(0.05%) 蒸馏水100mL pH=6.0
（培养基高压蒸汽灭菌：利用水的沸点随水蒸气压力的增加而上升，以达到100 ℃以上高温（121 ℃）灭菌的方法。）
2.3试剂
1％HCl、蒸馏水、结晶紫染色液、草酸铵结晶紫染液、番红染液、5％孔雀绿染色、碘液、95％乙醇、乙醚、40％NaOH、ɑ-酚萘、3,5-二硝基水杨酸（DNS试剂配制）、1mg/ml麦芽糖溶液
2.4仪器
钥匙、锥形瓶、水浴锅、胶头滴管、移液枪、试管、培养皿、接种环、玻璃涂棒、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、锥形瓶4个（2个种子培养、2个发酵培养）、试管
2.5其他用品
无菌防水纸袋、记号笔、标签、报纸、橡皮筋
3实验方法与步骤
3.1土样采集
样品1：生化楼楼下河道边
样品2：菊苑饭堂后门附近近
3.1.1以1㎡为单位采用五点取样法在各点采样，距表层5---15㎝，用钥匙在五点处各取1的土壤，装入无菌防水纸袋，封口。称重，编号1、2.
3.1.2记录所取2个样品周围的环境状况。
3.2筛选菌株
3.2.1初步筛选：
3.2.1.1称取各土壤样品10g于90ml无菌水的锥形瓶(锥形瓶中放有玻璃珠)1、2中(即为稀释的土壤悬浮液)，塞好棉塞，充分振荡20min，使土壤中菌体或芽孢子均匀分散，并置于80℃恒温水浴中保持20min，/100℃恒温水浴中保持10min，以杀死非芽孢的菌体。
3.2.1.2取各装有9ml无菌水的试管5支，编号为10-2,10-3,10-4用移液枪吸取1号锥形瓶内土壤悬浮液1ml加入编号为10-2的试管中，并在试管内轻轻反复吹洗数次，即成为10-2的土壤稀释液；同法从编号10-2试管内取1ml加入编号为10-3的试管中，并在试管内轻轻反复吹洗数次，即成为10-3的土壤稀释液；依次连续稀释为10-4的土壤稀释液。并同法完成另一份样品的稀释。
3.2.2进一步筛选纯化：
3.2.2.1制备牛肉膏蛋白胨培养基，并在无菌操作下倒平板(共13个，19=2×3×2＋1其中2个土样，3个稀释度，每种2个平行对照，,1个为空白对照)。
3.2.2.2取各土样稀释度为10-2,10-3,10-4的悬浮液进行涂布平板(每种样品的每个稀释度涂布3个平板)。用移液枪吸取各土样各个稀释度的土壤悬浮液100ul，放入平板中，用灼烧后的玻璃涂棒沿一个方向涂匀。并置于37℃温箱中培养24h。（第一天）
3.2.2.3取出所有平板，观察三个稀释度下的平板的菌落数目，选取菌落数在30~300的平板，舍弃不符合的平板。在所选平板中选取形态大小颜色等不同的菌落6~8种，分别用接种环以无菌操作挑起，分别进行分区划线(3个区)并做标记。(按每种土样选取5种菌计算，约10=2×5个平板)。将接种过的平板倒置于37℃温箱中培养24h。继续分区划线，重复3次。（第二三四天）
3.2.3镜检
将第四次划线得到的单个菌落进行单染色。检查获得的菌种是否单一，是否为杆状菌。若出现不同菌种则说明并未纯化，则继续划线培养直至镜检菌落单一。
单染色法 涂片（1％HCl清洁，滴加1DH2O于载玻片，挑菌与水混匀）----干燥----固定（涂面朝上，微火，2-3次）----染色（冷却，加结晶紫1-2d，染色1-2min）----水洗（倒去染色液冲洗至无色）----干燥----镜检。
3.2.4筛选产淀粉酶菌株：
将分离的单个菌落接种至淀粉水解培养基上，每个培养基接种3个菌落，每种菌接种一个平板。37℃温箱中培养24h。记录并编号。30-48h后，观察培养基中是否有透明圈产生，挑选有透明圈的聚落则为能产淀粉酶的芽孢杆菌。（第五天）
3.2.5再次镜检：
挑选有透明圈的菌落，再进行革兰氏染色和芽孢染色，验证菌落为紫色，革兰氏阳性菌且有绿色芽孢出现。以致确定其具有芽孢，为芽孢杆菌。
3.2.5.1革兰氏染色 涂片----干燥----固定----初染（加草酸铵结晶紫染液1-2min后，倒去冲洗至无色）----媒染（碘液冲去涂面1min，水洗）----脱色（95％酒精，25s，立即冲洗）----复染（番红染液1min，水洗吸干）----镜检。
3.2.5.2芽孢染色 涂片----干燥----固定----加温染色（加5％孔雀绿染色，微火加热至冒蒸汽维持5min）----冷却水洗（至无色）----复染（加番红染色2min，水洗吸干）----油镜镜检。
(芽孢染色要培养30h，我们直接从鉴定淀粉水解酶的培养基中挑出菌进行了芽孢染色)。
在不同培养基中挑选所得满足条件的菌种并编号A、B、C......假设一共n种菌。接种至斜面培养基上进行扩增培养，每种菌接种两支试管，一支保存，一支进行各项生化鉴定。37℃温箱中培养24h。标明菌种产地。
3.3菌种鉴定：
3.3.1形态学鉴定：
3.3.1.1群体：从各试管斜面培养基上取菌种重新接种到新的平板上，37℃温箱中培养24h。观察其形态特征（大小、颜色、干湿、边缘、质地、气味、是否易被挑起）
3.3.1.2个体 单染色（杆状，排列方式，大小） 革兰氏染色（阳性）芽孢染色（菌体染成紫色，芽孢为绿色，产孢位置，大小等）
3.3.2生理生化鉴定
3.3.2.1 pH=5.7的耐酸性试验：
A.将获得的菌种分别接种到pH=5.7和pH=7.2的肉汤中(其中pH=7.2的肉汤做对照）
B.置37℃温箱中培养24h
C.若培养基出现浑浊则用“＋”表示，代表该菌能耐酸，反之“-”。
3.3.2.1吲哚试验
A.将获得的菌种和空白对照分别接种到蛋白胨水培养液中
B.置37℃温箱中培养24h
C.在各管内加入乙醚1ml，充分振荡，使吲哚萃取到乙醚中，静置分层，然后沿管壁加入10d吲哚试剂，若有吲哚存在，则乙醚层显玫瑰红色，为阳性，用“＋”表示，反之用“-”。
3.3.2.3 VP试验
A.将获得的菌种和空白对照分别接种到葡萄糖蛋白胨水培养液中
B.置37℃温箱中培养24h
C.加入40％NaOH溶液10-20d，再加入等量ɑ-酚萘在37℃温箱中保留15min，若培养液变红，则为阳性，用“＋”表示，反之。
3.3.2.4糖发酵试验（产酸产气）
A.将获得的菌种分别接种到葡萄糖、木糖、甘露醇、阿拉伯糖发酵水培养液中（杜氏小管)(各糖含量为1％）
B.置37℃温箱中培养24h
C.若培养液变成黄色，则产酸，若杜氏小管中有气泡，则产气
(整个过程中不能人为制造气泡)
3.3.2.5酪氨酸水解试验
A.将营养琼脂融化，冷却至室温，与酪氨酸混匀制成平板
B.将获得菌种接种到点接到培养基上，置37℃温箱中培养24h
C.记录菌落周围和下面的酪氨酸是否被分解而成透明
3.3.2.6酪素水解试验
A.将获得菌种接种到点接到培养基上
B.置37℃温箱中培养24h
C.记录菌落周围和下面的酪素是否被分解而成透明
3.3.2.7运动性试验
A.使用半固体营养琼脂试管， 将接种针从直立柱培养基中央自 上而下直刺到离管底 1-1.5cm 处，沿原穿刺线拔出接种针
B.置于 37℃恒温箱培养 24h。
C.观察是否产生树根状生长，若有，则菌株有鞭毛，但是如果是需氧型的话会在培养基表面上形成一薄膜；若是不会运动的细菌，培养基中的穿刺线很清晰，直立生长，则无鞭毛。
3.3.2.8柠檬酸盐试验
A.将获得菌种接种到点接到培养基上
B.置37℃温箱中培养24h
C.若培养基为蓝色，则表明能利用柠檬酸盐作为碳源生长，以“+”表示。若培养基为绿色则为阴性，以“—”表示。（连续培养观察大约一星期左右为宜）
3.3.2.9耐盐性试验
A.设置2％,5％,7％,10％盐浓度梯度的培养基(用营养琼脂再加氯化钠即可)
B.将菌种接种在培养基上
C.置37℃温箱中培养24h，观察并比较菌落长势
3.3.2.10温度试验
A.设置5℃,25℃,45℃,37℃,60℃的温度梯度
B.将菌种接种到各个培养基上
C.置不同温度下培养24h
3.3.2.11明胶液化试验
A.穿刺接种，深度至明胶层2/3处，
B.于37度温箱培养24h
C.取出静置冰箱中待其凝固后，观察是否被细菌液化，如被液化，则为阳性，能产生蛋白酶
3.3.2.12硝酸盐还原试验
A.将菌种接到液体培养基中

0
1
2
3
4
5
6
麦芽糖标准溶液（ml）
0
0.2
0.6
1.0
1.4
1.8
2.0
蒸馏水（mL）
2.0
1.8
1.4
1.0
0.6
0.2
0
B.37度温箱保持24h
C.将甲、乙液等量混合后（约0.1 mL）加入培养基内，立即观察结果若呈现红色则为阳性“+”，若无红色出现则为阴性“-”
3.3.2.13卵黄试验
A.点解卵黄试验培养基
B.37度温箱培养24h
C.观察分解情况，产生白色圆圈表示卵磷脂分解生成脂肪，说明有卵磷脂酶。用“＋”表示有透明圈，反之“-”。
3.3.2.14溶菌酶试验
A.先配制0.1％的无菌溶菌酶母液
B.与肉汤培养基混合成0.01％的培养基
C.接种并37℃温箱24h培养，观察若肉汤澄清则被溶菌酶抑制，用“-”表示，浑浊则不被溶菌酶抑制，用“+”表示
3.3.2.15过氧化氢酶试验
A.挑选菌种于玻片上，并固定干燥
C.滴加过氧化氢观察是否产生起泡，能够产生起泡的菌种能够产过氧化氢酶，用“+”表示，反之则用“-”。
3.3.3定种
根据《伯杰氏细菌学手册》及各个鉴定项目的结果，给所挑选的菌株鉴定到种
3.4酶活测定
3.4.1标准曲线制作
3.4.1.1麦芽糖标准溶液配制 0.1g麦芽糖+100mL蒸馏水
3.4.1.2按照下表配制麦芽糖梯度溶液
3.4.1.3各加3，5－二硝基水杨酸试剂2ml,沸水浴准确煮沸5min，取出冷却，用蒸馏水稀释至20ml
3.4.1.4在分光光度计在波长520nm进行比色，记录吸光值
3.4.1.5以吸光值为纵坐标，麦芽糖含量为横坐标绘制标准曲线。
3.4.2样液的测定
3.4.2.1 发酵液的制备，选择一个菌株，接三环菌种于发酵培养基中，摇床培养，160 rpm/min , 37 ℃，48 h后，取1ml发酵液于离心管中，4000 rpm/min离心10 min，收集上清液
3.4.2.2取上清液，加1%淀粉溶液1mL、缓冲液3mL，于60℃水浴中预热5min
3.4.2.3加柠檬酸缓冲液1mL，于60℃水浴中保温30min
3.4.2.4加入1.5mLDNS，沸水浴5min，迅速冷却，加蒸馏水定容至20 mL。
3.4.2.5空白对照 加发酵液后加浓盐酸至pH=3.6以下钝化淀粉酶，使酶失活，其余步骤同上
3.4.2.6定容后，摇匀，用分光光度计在波长520nm处进行比色，记录吸光值，从麦芽糖标准曲线中查出麦芽糖含量，然后进行结果计算结果计算。
4.实验结果
4.1取样结果
4.1.1镜检
从土样1中分离出3个菌株，经过镜检判断均已纯化，分别标记为1A,1B,1C
从土样2中分离出4个菌株，经过镜检判断均已纯化，分别标记为2A,2B,2C,2D
4.1.2淀粉培养基筛选及产孢情况

1A
1B
1C
2A
2B
2C
2D
淀粉酶
+
+
-
+
+
+
-
革兰氏
+
+

+
+
+

芽孢
+
+

+
+
+

“+”表示产淀粉酶/芽孢/阳性，反之“-”，无淀粉酶的菌株不做芽孢染色观察
4.1.3形态学结果
编号
1A
个体
较小，短杆状，排列散落，单个或短链状
菌落
白色略透明，菌落中等，表面光滑，非常湿润，有光泽，边缘整齐，易挑起
产孢情况
孢子端生，多游离，不膨大
编号
1B
个体
较小，短杆或近椭圆，多短链状排列
菌落
浅黄色不透明，菌落较小，表面粗糙，有明显褶皱，较干燥，边缘整齐，易挑起
产孢情况
孢子端生，膨大明显
编号
2A
个体
较细，长杆状，链状排列
菌落
黄色不透明，菌落较大，表面光滑湿润，边缘整齐，易挑起
产孢情况
孢子偏端，不膨大
编号
2B
个体
杆状，中等长度，长链状排列
菌落
白色不透明，菌落较大，表面粗糙，略干燥，边缘不平整呈绒毛状，难挑起
产孢情况
中生，不膨大，多游离
编号
2C
个体
较小，长杆状，多短链状排列
菌落
白色不透明，菌落较大，表面湿润光滑有光泽，边缘平整，易挑起
产孢情况
孢子偏端生，轻微膨大

4.2生理生化鉴定结果
选取1B、2C进行生理生化鉴定
项目
1B
2C
1
2
1
2
VP
+
-
+
+
吲哚
+
-
+
+
糖 发 酵
葡萄糖
+
+
+
+
木糖
-
-
-
-
阿拉伯糖
-
-
-
-
甘露醇
-
-
-
-
温 度
5℃
-
-
-
-
25℃
+
+
+
+
37℃
+
+
+
+
45℃
++
++
++
++
60℃
-
-
-
-
耐 盐
2％
+
+
+++
+++
5％
-
-
-
-
7％
++
++
++
++
10％
+
+
+
+
硝酸盐还原
-
-
+
+
酪素分解
-
-
+
+
酪氨酸分解
-
-
-
-
卵磷脂酶
-
-
+
+
接触酶
+
+
+
+
溶菌酶
-
-
+
+
PH5.7
-
-
-
-
运动性
+
+
+
+
明胶液化
-
-
-
-
柠檬酸盐
+
+
-
-
根据《伯杰氏细菌学手册》
1C应为凝结芽孢杆菌,2C为蜂房芽孢杆菌
4.3酶活测定情况
选择编号2C的菌株作为酶活测定对象
4.3.1标准曲线的测定
第一组（我们组）
麦芽糖g/L
0
0.2
0.6
1.0
1.4
1.8
2.0
吸光度
0
0.035
0.278
0.527
0.629
1.065
1.229
第三组（其他组）
麦芽糖g/L
0
0.2
0.6
1.0
1.4
1.8
2.0
吸光度
0
0.055
0.286
0.663
0.967
1.177
1.394
由于第三组所测得的标准曲线拟合情况较好，因此将第三组的标准曲线作为标准来进行测定和计算
4.3.2所选菌株的酶活测定

空白
样品1
样品2
吸光度
0
0.180
0.166
0.183
0.179
麦芽糖g/L

0.34
0.32
0.35
0.34
经计算
样品1的酶活=（0.34+0.32）/2×1×8=2.64
样品2的酶活=（0.35+0.34）/2×1×8=2.76
编号2C的菌株在该发酵配方的培养下
酶活U=（2.64+2.76）/2=2.7
5.结果分析与讨论
5.S实验准备和总体操作上 这个实验对于我们来说是一个较为长时间的实验，加之实验设备器材有限，需要排队轮候，因此在实验过程中，对整个实验流程的整体规划和安排，以及各个实验环节的严谨操作，都有利于减少实验时间和等待。例如①这个实验需要我们从土壤中提取的芽孢杆菌，因此在操作需要进行严格的无菌控制防止杂菌污染，实验器具在操作前的灭菌，培养基使用前的灭菌，无菌室的消毒和无菌操作等等，这些操作都需要一个比较长的时间等待，我们在等待的时间里可以提前做好下一个步骤的准备工作，例如培养基的配制、接种、清洗器具等，有助于我们缩短整个实验的用时②在由土壤制备菌悬液时，需要加入玻璃珠使细胞离散有利于形成单菌落，在实验前需要将玻璃珠放入锥形瓶中一同高压蒸汽灭菌，有组别事先忘记加入玻璃珠，需要重新加入玻璃珠再次灭菌，增加了多余的环节，延长了实验时间；③我们小组在进行VP实验过程中，由于使用了错误的试剂，无法得到准确正常的实验结果，需要重新配置培养基和接种，造成了时间和材料的浪费
5.2菌株分离纯化时，三次划线后，只有一个平板出现明显单菌落，大多数呈现为菌苔，镜检结果表明所选菌株均已纯化；说明我们所选择的时间周期（24h）对多数菌株的来说培养过长，在后续的实验中，无论是接种培养还是留种，都应当适当缩短培养时间，防止培养时间过长导致菌种老化或者活性降低
5.3在革兰氏染色中，所有产淀粉酶的菌株结果都为阳性，但是在该实验中缺乏阴性对照，难以判断是否因为染色、脱色的操作或者时间问题导致观测出现偏差或者个人对颜色深浅判断一定的主观影响，因此在进行类似实验操作时，建议与革兰氏阴性菌例如大肠杆菌混合，形成对照，使观测更易判断和描述，结果更准确和有说服力
5.4芽孢染色操作较为困难，操作不当可能导致染色效果不明显或者洗脱时菌体容易被冲掉，需要耐心操作；小组操作过程中发现，可以在滴入3-5滴孔雀绿溶液后，置于火焰上方较高处直接烘烤，冒白烟（不沸腾）至干之后直接洗脱，比较简便，且可以达到较好的观察效果；但该操作缺乏重复和对照，不能判断是巧合造成的仅对我们所选取的菌株有效还是有推广的可行性
5.5淀粉酶检验的时候，有两株菌落形态相似的菌株出现相反的情况，说明这两株菌株很大可能是不同的，有些菌株菌落看起来相似，但实际上可能是不同的菌株，也反映了生理生化鉴定和基因检测的必要性
5.6耐盐性试验中，两种菌在2％、7％、10％盐浓度培养基上培养24h后都能正常生长，说明这两种菌对于高浓度的盐环境具有一定的抗逆性；但是在5％盐浓度的两个平行培养基上两种菌株总共4个接种点都不生长，其中编号1B的菌株在常温下放置5天后又出现生长的迹象，除去接种操作过程中存在的问题，推测可能为配置耐盐过程中出现错误，盐的用量不准确或者倒平板时对各个平板对应的盐浓度标示错误，因此该实验的结果可能存在不准确和偏差；在时间条件允许的情况下，应该对该实验进行重复
5.7温度实验中，两种菌在在5℃和60℃的极端环境中不生长，在25℃和45℃中生长，且在45℃中长势较好，说明这两种菌的生长最适温度都偏高，其中编号1B的菌落出现扩散的现象，可能原因是接种过程中沾到斜面上的冷凝水，使得菌体扩散；结合纯化培养时该菌株也出现类似的情况和培养时间应该缩短的判断，猜测此菌株培养时间过长，开始出现老化的迹象，在45℃的条件下1B菌株的可能的最适培养时间应该远远低于24h.而用于条件所限制，本次实验只选择了4个温度梯度，中间间隔过大，不能很好地反应这两种菌对环境的抗逆性情况
5.8糖发酵实验中，培养基配制后基本为紫色，但是部分培养基在高压蒸汽灭菌后变为酒红色，查询资料后知道该实验使用的酸碱指示剂溴甲酚紫是作为酸碱指示剂加入在，变色范围pH5.2（黄）-6.8（紫），通过询问老师得知使用高压蒸汽灭菌在升温和降温的过程较长，在这个过程中，可能某些物质发生变化，使得溶液的酸碱度发生变化；思考：是否可以用pH试纸直接检测培养后的培养基的酸碱度；或者培养后再加入酸碱指示剂；可能结果较不为直观，但应该可达到相同的目的，即产酸产气的检测
5.9 VP实验中，在加入ɑ-酚萘后上层溶液变为不透明的乳白色，保温后无任何明显变化，询问老师后得知，可能为加入药品错误，碱性不足，发生了其他的反应；之后发现其他组别也出现类似的情况，基本确定为加入的碱性物质浓度不足，没有形成强碱环境，具体变化不明；重复试验，其中编号1B出现一个阳性一个阴性结果，由于接种时种子培养基内存在较多冷凝水，可能没取到菌种或者数量较少，不排除受污染的情况；由于时间关系未再进行重复，该实验也提醒我们在实验过程中应该保持小心、仔细，药品的选用和用量都可能对结果造成干扰，并且也再次提醒我们重复实验和平行对照的重要性
5.10在酪素水解、酪氨酸水解和卵磷脂酶实验中，由于酪素、酪氨酸和卵黄中含有蛋白质等物质在高温条件下变性，因此不能直接高温（121℃）蒸汽灭菌，应当根据材料的不用采取不同的方法，例如酪素和酪氨酸在110℃灭菌，蛋黄在无菌条件下取用即可
5.11 pH5.7的耐酸性实验表明，两种菌对偏酸性的抗逆性较低；溶菌酶试验表明编号2C的菌株对溶菌酶具有一定的抗逆性；这两个实验应该使用肉汤培养基同pH7.0的肉汤作对比，通过浑浊度可以直观地对比出菌株生长或者不生长，但是对于菌株的生长情况比较难以把握，在溶菌酶试验中可以使用固体培养基，用小滤纸片浸没在溶菌酶中，通过透明圈的大小来判断抑制情况
5.12柠檬酸盐实验中，编号1B的菌种能对柠檬酸盐进行利用，但该实验一直到第五天才出现轻微现象，第六天才出现明显现象，说明芽孢杆菌对柠檬酸盐的利用能力较低，需要长时间培养观察才能做出判定
5.13我们通过生理生化实验鉴定得出来的结果并非十分准确，仅是初步鉴定，缺乏比较严格的重复和对照，部分项目可能存在误差，部分项目由于条件限制没有实施，实际操作中对微生物的种的鉴定还应该进行基因检测和鉴定才能最终判断
5.14 我们选取淀粉检验时透明圈较大的2C作为酶活检测对象，实际结果酶活力较并不高；通过课堂知识和老师讲解，我们知道种子培养基和发酵培养基的配方不同是由于微生物的最适生长条件和最适产物条件的不同，对于我们选用的菌株，要得出最适的发酵配方是需要建立大量的实验基础上的，我们通过查询资料得带的配方只能作为参考使用，实际上可能并非该菌株的最优配方；因此测得的酶活力相应的只能作为一个参考量，并非该菌株的酶活的最优结果
6．综合讨论
通过本次实验，我们对于一个实验，从开始查阅资料、设计实验到实验操作、记录和总结有一个比较清晰的了解，同时也确实体会到了做实验的辛苦。对于实验设计上，我们还存在一些不足，例如对于查阅资料的整理和使用，以及项目的选择，都存在一些不清晰和不合理，有的时候知其然而不知其所以然，所以导致我们小组在实验过程中会出现分歧和争端，例如对于pH5.7培养基的对照培养基应为Ph7.0培养基而非不接种的pH5.7的培养基，出现这样的分歧说明我们对实验的认识和了解还不足够深入和透彻；对于实验的步骤安排不太恰当和操作失误导致重新进行某个项目的实验都无形中增加了时间和负担，对于实验的统筹安排应该在实验开始前就做好的工作，而操作的不熟练和小心严谨、实验记录的准确和严密则有赖于我们自身素质提升。
这个实验是小组通力合作，小组成员的分工配合、团结协作是我们完成这个实验的关键之一；良好的配合使得我们在配制培养基和实验操作上快人一步，而对于某个项目的不清楚的地方的讨论也有助于加深小组成员对实验的理解，小组有分歧，有争论，最终通过讨论或者查阅资料询问老师而得出结果，既有利于实验的进行，也加强了成员间的沟通和交流。同其他组进行交流和结果参照也是学习的方式之一。
对芽孢杆菌的形态学和生理生化鉴定基本情况良好。形态学由于此前有做过类似的操作，因此本次实验进行的情况比较有效率，较大的问题主要存在于小组成员对观察现象的描述和芽孢染色的操作和观察问题上；在形态学鉴定的时候，出现两株菌株的菌落看起来一样但是产淀粉酶情况相反的情况，菌株的个体形态和群体形态只是鉴定的一个方面，要对菌株进行准确的鉴定应该进行更详细的生理生化鉴定和基因检测。而生理生化鉴定由于条件限制我们只能进行部分项目，总体情况良好，对于某些项目，例如卵黄实验、溶菌酶试验、酪素、酪氨酸、pH5.7等的操作上，还存在一些不同，在老师讲解过来，还需要经过讨论、理解后才开始实施，实验操作也存在一些差错导致项目重来的情况，造成时间和材料的浪费，说明实验预习和设计的时候在这方面做还存在不足，对项目的了解和认识还不够深入。因此，对于实验的学习和熟悉仍然是我们的一个需要重点把握的方面，而是作为一个学习生物学的学生应当掌握的技能。
通过鉴定可以得知，两种菌株的耐盐情况较好，但是对极度温度的抗逆性不是很明显，而由于试验条件、没有选择合适的温度梯度也是一个重要因素；而由于芽孢杆菌在不良环境下具有一定的抗逆性的这种良好的性状使得其在生产应用中有广泛的应用。而我们本次实验中着重检测其产淀粉酶的情况，检测结果酶活偏低，但不能因此说明此菌的淀粉酶缺乏应用价值，对于某种菌的最适生长培养条件和最适培养条件都是需要我们通过大量的实验来得到，我们在这个实验中采用的发酵培养基配方只是作为一个参考，而需要判断该菌所产淀粉酶是否可以具有生产应用价值，还需要进一步的实验来说明。

7.参考文献
[1]周德庆，徐德强．微生物学实验教程（第3版）．高等教育出版社．2013
[2]孙建义，许梓荣．芽孢杆菌的分离鉴定及应用研究．浙江农业学报11（1） 47~50，1999
[3]R.E.布坎南，N.E吉本斯，等．伯杰式细菌学鉴定手册（第八版）．科学出版社．1984：729~759．
[4]邹伟，赵玉军等．土壤中芽孢杆菌的分离及初步鉴定．[J]四川畜牧兽医.2008，02期
[5]傅冰，王东明．土壤中产淀粉酶菌株的分离、鉴定及提高产酶能力的研究．[J]绿色科技，2012，03．3
[6] 杨慧，王振华等.芽孢杆菌产淀粉酶活性的研究.现代农业科技 2007,2
8.附录