自噬和雷帕霉素靶蛋白复合物I(mTORC1)调控体细胞重编程的随机阶段pdf.pdf

中科院研究发现细胞“返老还童”关键机制2015 年 05 月 21 日 08:16来源：中国科学报原标题：研究发现细胞“返老还童”关键机制（记者朱汉斌、丁佳 通讯员黄博纯）（记者朱汉斌、丁佳 通讯员黄博纯）记者从中科院广州生物医药与健康研究院获悉，该院裴端卿和秦宝明实验组发现了细胞在结构上“返老还童”的关键机制，有望为寻找新的治疗手段提供有力依据。5 月 18 日，相关成果在线发表于自然细胞生物学杂志。据裴端卿介绍，细胞在饥饿等胁迫条件下会主动降解自身细胞质组分，这一过程被称为“自噬”。此前有研究认为，自噬在重编程早期发挥关键作用。但最新研究发现，自噬对重编程非但不是必须，反而起阻碍作用。重编程在自噬缺失的细胞中不仅效率更高，而且获得的诱导多能干细胞（iPS 细胞）具有正常的多能性。据了解，2006 年，日本科学家建立的 iPS 细胞技术，实现了成体细胞逆转为具有多种分化潜能的类似胚胎干细胞状态的 iPS 细胞，从而叩开了再生医学的大门。不过，该技术在获得大规模应用前仍存在很多问题。什么是细胞重塑？科研人员介绍说，成体细胞犹如一个具有特定功用的房间，房间里的器具构造决定了它是居家、办公还是商铺；而胚胎干细胞更像是一个空房间，根据需要可把它改造做任何用途。成体细胞重编程为胚胎干细胞的过程，如同把原有房间里的器具构造清空，只留下一些水电等最基本的设施。这就是细胞在结构上“返老还童”的关键过程。最新发现将拓展对糖尿病、癌症以及神经退行性疾病等代谢疾病中细胞重塑如何影响细胞命运的认识，从而为寻找新的治疗手段提供有力依据。研究人员进一步发现，细胞重塑的发生实际上来自雷帕霉素靶蛋白复合物 1（mTORC1）的关闭，其持续开启则阻断细胞重塑、线粒体代谢转变以及重编程的发生。自噬和雷帕霉素靶蛋白复合物I(mTORC1)调控体细胞重编程的随机阶段自噬和雷帕霉素靶蛋白复合物I(mTORC1)调控体细胞重编程的随机阶段我们发现在小鼠的成纤维细胞在 4 个重组因子(Sox2,Oct4,Klf4 and c-Myc)（此后就用 4F 表示）的作用下重编程诱导成为多能干细胞的过程中，自噬被强烈激活。该过程的发生独立于 p53 的激活，并且由雷帕霉素复合体 1(mTORC1)机械目标的协同下调所介导，同时还有自噬相关基因的诱导表达。4F 协同抑制mTORC1，它们对于自噬相关基因的调控有一个分歧作用，Klf4 和 c-Myc 起到诱导作用，Sox2 和 Oct4 起到抑制作用。一方面，mTORC1 的抑制可以通过细胞重塑来促进重新编程（线粒体改造和细胞体积减小）。另一方面，mTORC1 会自相矛盾地因为引发细胞自噬而破坏重编程。自噬不参与细胞重编程但是会降解p62，p62 在自噬缺陷细胞中的积聚中则会起到促进重编程的作用。我们的研究结果揭示了，在重编程的早期阶段，mTORC1 抑制和自噬诱导之间存在一个复杂的信号网络，两者之间微妙的平衡关系最终决定重编程的效率。体细胞重编程的限定因子展示了细胞的可塑性以及转录因子能够指定其命运的能力（1）。尽管在再生医学方面，生成特定的诱导性多能干细胞有前景（2，3），但是限定因子在体细胞重编程实践中的效率和质量是冗长而具有高变异性的（4）。这些缺点也强调说明需要更好地理解基本机制从而进一步提高技术水平（5）。就这一点而言，近段时间的研究使用了基于人群研究和单细胞分析两种方式表明了重编程可以被分为三个阶段：起始，成熟和稳定（6，7）。起始阶段是随机的，起始阶段的大多数细胞并不能激活后两个阶段的基因。这表明了一些起始阶段的变化是消极的，并且会破坏整个进程。一种更为优秀的描述方法或许需求的是能够使起始阶段的重组过程处于一种稳定的方式。这将确保不止在没有额外基因操作的情况下达到近 100%的重编程效率（8，9），还具有可以达到更高精准度的转化的潜力。自噬是一种负责维护细胞内稳态的异化的机制（10）。通过封存进入自噬体的细胞组件（例如，细胞膜，细胞器，细胞骨架组件或者蛋白质络合物），并且通过溶酶体进行降解，自噬允许细胞储存能量传代，细胞生存在代谢性应激条件下，如饥饿状态；或者改善基因毒性压力，如 DNA 损伤。作为一个集成应激反应,自噬参与各种生理和病理过程,如胚胎发育、衰老和癌症（11）。值得注意的是,一系列自噬相关基因已确定可以控制膜动力学在自噬小体形成期间和与溶酶体融合顺序方式(启动、成核、伸长和扩张)。在自噬的起始阶段是被 mTORC1 抑制的，其可以整合不同的上行营养与压力信号，也可以促进生物合成（12，13）。值得注意的是,通过它在生物合成中的作用,mTORC1 独立调节自噬中的细胞结构(包括细胞大小和细胞器组成)。在这里，我们证明了 mTORC1 介导的线粒体调控和自噬之间良好的相互作用是小鼠成纤维细胞通过 4F 进行重编程的基础。结果结果自噬在重编程的早期被诱导自噬在重编程的早期被诱导多能干细胞,例如鼠的多能干细胞或胚胎干细胞的细胞与体细胞相比具有较少的,相对不成熟的细胞内的细胞器如线粒体、ER（内质网）和高尔基体。我们一直想知道体细胞是如何重编程为多能干细胞，来解决这个细胞生物学问题，并且假设在体细胞重编程期间自噬的激活有助于重建改变细胞内细胞器。为了验证这个想法，我们用逆转录病毒酶产生 4F 在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）重编程期间测试自噬活动，其表达则用定量 PCR 技术进行确认(qPCR,补充图.1a)。我们使用微管相关蛋白轻链 3（LC3），酵母的哺乳动物同系物 Atg8，来辨识自噬小体的形成（14）。蛋白免疫印迹技术展示出来的结果显示与对照型的相比，4F 转导的 LC3B的活性形式(LC3B-II)在 4F 中表达更为明显(图 1a,上面的板块)。使用巴菲霉素 A1 进行干预，这是一种溶酶体酸化和自噬体与溶酶体融合的抑制剂，显示了在 4F 中 LC3B-II 进一步增加。这证明了在 4F 重编程中自噬通量是上涨的（15）。进一步对比 MEFs 和 ESCs 发现，尽管 iPSCs/ESCs 比 ESCs 拥有更高的自噬基础水平，在第 6 天和第 9 天时 4F 重编程在 ESCs 中减少更多的自噬通量。为了进一步描绘 ESCs 中的基底自噬活动，我们用免疫蛋白印迹技术测量不同培养条件下的LC3B-II 水平(2iCLIF on gelatin 16;serumCLIF on feeder;low or high celldensity;补充图.1b 左侧和中间的版面)。这个结果证明了 ESCs 中的自噬通量水平比 MEFs 中要高，尽管我们观察到 2i+LIF（16）条件下的数值比 serum+LIF 条件下高，同样的情况发生在高细胞密度与低细胞密度中。同样地，我们发现在ESC 分化期间自噬通量会下降(withdrawal of 2i and LIF for 3 days,补充图1b 右侧板块,1e-g).。除此之外，使用荧光显微法转换逆转病毒酶的 4F 感染细胞产生 EGFP-LC3B 显示除了典型的虚线胞质结构（自噬小体），与对照组的相比早了 3 天，并且他们会在接下来几天持续增加。这已经用电子显微镜证实，它也可以让我们检查自体吞泡的内容物。这些液泡以双层膜结构出现，在第 5 天的时候尤其显著，其体积为直径 0.5-1 微米并且和其他人报道的一样包含电子密度（17）（图 1g）。与控制组的相比，在第三天和第五天的时候自噬区域的量化有显著提高(图 1h)。值得注意的是,我们没有在液泡内观察到明显的细胞器，暗示他们主要包含膜和细胞骨架结构或蛋白质复合物(图 1g)。此外，自噬细胞没有凋亡，是以正常的核形态学显示出来(图 1g)。排除这种可能性，自噬是由逆转录病毒酶专一诱导的，而不是由于其它外源性因素，我们使用了多顺反子慢病毒系统。4F 的表达也许就是用了这种方法，（18）自噬的强烈诱导可能在有或者没有 Baf 的情况下(/CBaf;Supplementary Fig.1g,h)。排除自噬是只被腺病毒转导诱导的原因，我们转向使用小鼠的二次可重复编程的 MEFs 携带多西环素插入到 Col1a locus（Col1a 基因）中（19）。多西环素的增加可以激活 4F 的表达(补充图.1i)，也伴随着自噬的增强，表现为LC3B-II 的积累(图.1g 和 补充图.1j)。基于这些结果，我们总结出在小鼠成纤维细胞重编程期间 4F 诱导自噬发生，并且是在进程的早期发生的。图 1：图 1：自噬在重编程的早期被诱导自噬在重编程的早期被诱导(a)WB 结果：对照组及 4F 转导的成纤维细胞中 LC3B 蛋白及内参蛋白的表达情况。首次转导标记为 0 天。内参蛋白作为加载控制。Baf,巴菲霉素A1.Baf 干预：10nM，2h(以后试验中亦如此)(b)图 a 中 LC3B-II 蛋白 与 actin 蛋白相比较的量化情况(c)WB 结果：小鼠胚胎干细胞与 4F 重编程的成纤维细胞在 3，6，9，15 天时，LC3B蛋白及内参蛋白的表达情况(d)图c中LC3B-II蛋白 与actin蛋白相比较的量化情况(e)第3，5天时4F转导及对照转导的成纤维细胞中增强型绿色荧光染色的LC3B的共聚焦图像；比例尺：10 微米(f)e 的量化图(g)第 3，5 天时 4F 转导及对照转导的成纤维细胞中自噬空泡的透射电子显微镜图像（突出部分用红色箭头表示）比例尺：1 微米(h)g 图中自噬空泡的形态学量化(i)WB 结果：Baf 干预下二次可重复编程的成纤维细胞中 LC3B 与 actin 的表达。DOX,多西环素.干预用量 2 微克/ml.首次 DOX 干预标记为 D0(相似实验亦是如此).补充图 4 提供的信息的来源.原始数据在补充图 6 中。4F 因子以非 p53 依赖的方式反向调节自噬4F 因子以非 p53 依赖的方式反向调节自噬为了更全面的了解 4F 因子诱导自噬的分子机制，我们运用 qPCR 检测了以逆转录病毒为基础的重编程过程中不同时间点自噬相关基因的表达情况。结果表明，与对照组相比，在 4F 因子诱导过程中，基因诱导全面而早期，并且参与自噬的各个阶段（起始，成核，伸长，膨胀和溶酶体途径）（如图 2a 和补充图 2a）。我们在重新编程实验及小鼠胚胎干细胞与小鼠胚胎成纤维细胞的对比中运用蛋白印迹法验证选择的目标（图 2b）(补充图 2b)。为了证实重新编程过程中自噬相关基因对于自噬的诱导作用，我们设计了 Atg5,Becn1，Vps34 的短发夹 RNA逆转录病毒载体。我们选择了每个基因及其组合中的各自两个 shRNAs，其结果表明了明显的击倒效果在 4F 因子干预的重组中（补充图 2c）。WB 法检测 LC3B-II显示：与 shRNA control(/+Baf)相比，这些组合的 shRNA 也有效的抑制了自噬。（图 3c）接下来，我们研究了在重新编程 4f 因子如何配合诱导自噬基因。先前的研究已经表明，原癌基因 c-myc 引发大鼠细胞自噬（20），同时更多报道表明胚胎干细胞关键蛋白 Sox2 诱导结肠癌细胞自噬（21）。因此，我们使用转录病毒以单独或组合的形式过度表达 4F 因子。qPCR 分析表明 c-myc 和 Klf4 诱导多个自噬基因（ULK1，Atg5，BECN1 和 Vps34 由 c-myc 诱导；Atg5，ATG7，LC3B 和 BECN1 由KLF4 诱导），而单独或组合的 SOX2 和 OCT4 则不能（图 2D）。对于 LC3B-II 和其他选定的自噬通路成分的免疫印迹分析证实了自噬（/+Baf）和自噬基因Klf4+c-Myc 的诱导（图 2e 和补充图 2d），除了 ULK1，这可能是由于翻译后修饰。相反，Oct4 和 Sox2 抑制自噬及自噬基因的表达（图 2e 和补充图 2d）（22）。我们也发现，Klf4+c-Myc 对于自噬基因的作用与 p53 的表达增加相关。（图2e）在这方面，p53 通过直接激活 Ulk1 而诱导自噬是大家所共知的。为了研究p53 是否调解重新编程过程中自噬的诱导，我们用 4F 逆转录病毒(/+Baf)转染了 p53 敲除尾尖成纤维细胞(TTFs)。WB 结果显示，与 p53 野生型小鼠胚胎成纤维细胞峰值出现在第 7 天相比(图 2a)，尽管本结果峰值出现在第三天，p53 敲除细胞 LC3B-II 也表现出了明显的诱导作用（图 2f）。这也许可以通过 p53 敲除尾尖成纤维细胞的快速增殖和重新编程动力学来解释。同样，qPCR 和 WB 结果都表明在 p53 敲除尾尖成纤维细胞中 Ulk1,Atg5,Becn1 and Vps34 都被诱导（补充图 2e 和 2g）。此外在这一背景下，Klf4+c-Myc 诱导 LC3B-II 和其他自噬基因，而 Sox2+Oct4 则起到抑制作用(图 2h 和补充图 2f)。为了证实两对重新编程因子的效果差别，我们在一个特殊的培养基(iCD1+BMP4)中重新编程小鼠胚胎成纤维细胞，这种培养基可以在只使用 Sox2+Oct4 的情况下形成 iPSC（由一个基因 Oct4GFP reporter26激活评估）（图 2i）。重要的是，Sox2+Oct4 作用的重新编程表现为一个逐渐的自噬下降过程而不是上升（见图 2j）。这似乎不是一个在 iCD1+BMP4 培养基中的直接抑制作用，因为 4F 因子在相同的培养基中可以很强烈的诱导自噬（见补充图 2g）。我们还观察到，在标准培养基中使用一个多顺反子慢病毒（3F DT）3 因子重编程（Oct4，Sox2 和 Klf4；3F）不诱导自噬（补充图 2h）。综上，我们的数据表明，4f 因子在重新编程过程中通过 ATG 基因的调节和 p53 非依赖的方式拮抗调节自噬。图 2：(a)qPCR 检测:在小鼠胚胎干细胞早期重新编程中，主要自噬相关基因在自噬各个阶段的表达情况。(b)在重新编程过程中，ULK1,ATG5ATG12(ATG5-12),beclin 1 and VPS34几个蛋白的 WB 结果。(c)4F 因子干预的转染小鼠胚胎成纤维细胞中 LC3B 及第五天显示的组 shRNAs（/+Baf）的 WB 结果(d)qPCR：外部因素单独或者联合干扰转导小鼠胚胎成纤维细胞后第五天指示基因的表达情况。(e)外部因素组合介导小鼠胚胎成纤维细胞转导过程中 LC3B 及相关指示基因的 WB 分析结果，Sox2+Oct4;KM,Klf4+c-Myc。(f)p53 敲除小鼠4F 介导转染尾尖成纤维细胞中 LC3B 的 WB 结果。(g)4F 介导转染 p53 敲除小鼠尾尖成纤维细胞中相关基因的 WB 结果。(h)组合重新编程因素干扰下 p53 敲除小鼠尾尖成纤维细胞中相关基因的 WB 结果。(i)典型绿色荧光蛋白克隆在重新编程细胞（iCD1+BMP4 培养基）中，第十二天。比例尺:00 m.(j)iCD1+BMP4 培养基培养的 SO-转染小鼠胚胎成纤维细胞中LC3B 的 WB 结果。数据显示的是三次技术复制的主要结果，数据来自两次代表性数据中的一次（a,d），在补充表 4 中提供了源数据，未被加工的原始扫描印记被提供在补充图 6 中。图 3 自噬损伤重新编程(a)Atg 基因敲除对 4F 逆转录病转导的 OG2 MEFs 重编程效率的影响(b)WB 结果：在用 DOX 对成纤维细胞二次转导的第五天时 indicated shRNAs LC3B 的表达.(c)shRNA对重编程系统中重编程效率的影响(d)WB结果 4F逆转录病毒转导的第三天，LC3B 和 beclin 蛋白 1 在 Flag 和 BECN1 的表达.(e)BECN1 对重编程的影响.(f)WB 结果：二次编程的成纤维细胞的第三天，LC3B 和 beclin 蛋白 1 在 Flag 和 BECN1 的表达.(g)BECN1 对二次编程系统中重编程的影响.(h)WB 结果：4F-dT lentivirus 转导的 Atg5 敲除小鼠成纤维细胞中，ATG512 和 LC3B 在 Flag 和 Atg5 的表达情.成纤维细胞来源于 3 只Atg5 野生型和同窝敲除型的胚胎.(i)与野生型相比，重编程在 Atg5 敲除型中被提高 Atg5复苏的自噬使重编程效率降低(j)WB结果：retroviral 4F和inducible-Atg5转导的OG2-Atg5敲除型成纤维细胞中，ATG512 和 LC3B 在 DOX 干扰和非干扰组的表达情况(k)Atg5对不同时间点 4F retroviral 重新编程的 OG2-Atg5 敲除型成纤维细胞的影响。数据是 3 次重复实验的结果来源于 2(c,g,i,k)的 1 和 3(a,e)代表性实验。补充图 4 提供的信息的来源.原始数据在补充图 6 中图图 4.自噬不负责重新编程过程中线粒体的改造自噬不负责重新编程过程中线粒体的改造.(a)MEFs,Ctrl(4XFlag)D5,4F D5,2 Atg5WT iPSCs,2 Atg5 敲除 iPSCs and mouse ESCs 细胞体积的流式分析.(b)a 中同样细胞的线粒体流式分析(c)qPCR 结果：中同样细胞的 mtDNA 拷贝数.(d)a 中同样细胞的活性氧流式分析.(e)对照组和 4F 转导组第三天，自噬小体、线粒体、细胞核的荧光图像（-/+Baf）。比例尺,10 微米.(f)WB 结果：在重编程早期线粒体蛋白 VDAC1 和 TIM23 的表达（-/+Baf.(g)用用 4F 和 Luc shRNA 或者上述 shRNAs 转导 MEFs 第 5 天线粒体流式分析。(h)用用 4F 和 LucshRNA 或者上述 shRNAs 转导 MEFs 第 5 天 ROS 流式分析。(i)qPCR 结果：4F 转导的 Atg5野生型和敲除型 mtDNA 拷贝数.(j)在在 Flag 或 ATG5 复苏情况下 4F 转导的 ATG5 敲除型MEFs细胞体积流式分析(g)和4(i,j)三次重复实验.补充图4提供的信息的来源.原始数据在补充图 6 中图 5：抑制抑制 mTORC1 介导了线粒体重塑介导了线粒体重塑.(a)WB 结果：在 MEFs 重新编程早期 mTORC1 信号通路的变化。对照组是 4XFlag.(b)结合重编程因子在第 5 天对 mTORC1 信号通路的影响。对照,2XFlag(c)敲出 Tsc2 shRNAs 第 5 天 qPCR 分析(d,e)WB 结果：mTORC1 信号通路成分(d)和 LC3B(e)在细胞中用 4F 和 2 shRNAs 对 Tsc2 转导(-/+Baf).(f)Tsc2 shRNAs 对重编程的作用(g)qPCR 结果：4F 和 Tsc2-shRNA-转导细胞中 mtDNA 拷贝数.(h)Tsc2 shRNAs 对线粒体的影响的流式分析(i)Tsc2 shRNAs 对 ROS 的影响的流式分析.(j)qPCR 结果：4F 和对照或上述基因第5天mtDNA拷贝数(k)4F和对照或t上述基因第5天线粒体流式分析(l)4F和对照或上述基因第 5 天 ROS 流式分析(m)上述基因过表达对 4F 重新编程效率的影响(n)qPCR 结果：上述基因转导 MEFs 的第五天 mtDNA 拷贝数。Tsc2 shRNA 是 Tsc2 shRNA1和 shRNA2 的结合(o)上述基因转导 MEFs 的第五天线粒体流式分析(p)上述基因转导MEFs的第五天 ROS 流式分析(i)来源于 n=3 的(c,g,h,j,o,p)和的两次独立重复实验(n)三次独立重复实验。补充图 4 提供的信息的来源.原始数据在补充图 6 中。图 6：p62 是重新编程中自噬靶点是重新编程中自噬靶点.(a)WB 结果：forin 在 4F-dT-转导的 Atg5 野生型和敲除型中 MEFs 中，p62 和 NBR1 在 Flag 和 ATG5 中的表达.MEFs 来源于 1 号和 2 号野生型小鼠胚胎，1XLenti-FlagCpMXs-Flag 作为对照。星号是非特异性标识.(b)WB 结果：4F-转导的 Atg5 野生型 MEFs(-/+Baf)中 p62 和 NBR1 的表达(c)第 5 天时，P62 在 4F 转导和图中作用于 Atg 基因的 shRNA 的蓄积(d)第 5 天时，P62 在 4F 转导和图中基因突变体的 shRNA 的蓄积(e)第 5 天时，p62 在 4F 重编程 MEF 中的减少使 BECN1 蛋白过表达(f)qPCR 结果：p62 shRNAs 在 4F-dT-t 转导的 Atg5 敲除 MEFs 中的低效率.(g)p62 shRNAs 对 Atg5 敲除的MEFs 重新编程的影响(h)图中所示的是外源性重编程因子调节自噬和 mTORC1，以及对重新编程后两个过程的作用。示意图表示的外源性重组因子调节自噬和 mTORC1 和最后 2 对重组的影响。随机早期阶段,4F 抑制 mTORC1 影响线粒体改造和诱导自噬影响重组效率。在随机相位的早期，4F 抑制 mTORC1 来影响线粒体重塑以及诱导自噬，这能够影响重新编程的速率。数据是三次重复的平均值。自噬抑制重新编程自噬抑制重新编程我们通常认为自噬诱导对重新编程起到了保护和促进的作用，为了对此进行探究，我们采用（图 2c）.中的有效的 shRNA 来证实减少自噬对重新编程的影响。出乎意料地，与 shRNA 对照组（图 3a）相比较，敲除 4F 重新编程的 Atg5、Becnl、Vps34，诱导多功能肝细胞的效率并没有降低，反而增加了 2-4 倍。但这并不是由于凋亡的减少(补充图 3a)而造成的，在重新编程中凋亡与自噬诱导相一致，不受 P53 的支配。这些 shRNA 在二代成纤维细胞中也抑制自噬，增加重编程的效率(图 3b,c)。此外我们让 ULK1、ATG5、VPS34、Atg16l 这些基因的显性位点失活突变（补充图 3b），使自噬诱导受到抑制，重新编程的速率增加了2 倍。相反地，相应的野生型反转录的 DNA 对自噬和重编程效率并没有影响。在shRNA 抑制 Becn1 和 Vps34 产生的诱导多功能干细胞以及 Atg16l-M 的过表达是包括种系传递嵌合小鼠在内的标准描述程序所展示的完全重新编程(补充图4a,b,e-i)。最近，苄氯素 1 被认为是自噬通路中的速度限制成分（27），我们发现在重新编码早期，它的蛋白在逐渐增加（图 2b,g），因此我们使 BECN1（一种自噬基因）过表达，它的过表达使自噬增强，同时使受损的 GFP+的形成增多(图 3d,e)。在二代成纤维细胞中，BECN1 对自噬与重新编程的作用也同样被证实(图 3f,g)。上述提到的 shRNA 以及使显性位点失活突变并不能够完全的阻断自噬诱导(图 2c，3b，补充图 3c)，我们又采用了 Atg5 基因敲出的成纤维细胞。这样的成纤维细胞是有自噬诱导缺陷的（28）。与同窝野生型小鼠的成纤维细胞相比较，WB 结果分析显示出基因敲出小鼠的成纤维细胞缺乏 ATG5-ATG12 结合以及LC3B-II(图 3h,right panel)。使 ATG5 基因在敲除小鼠中重构，ATG5-ATG12结合以及 LC3B-II得到了恢复。我们接着用 4F-dT转导ATG5敲除的成纤维细胞，腺病毒转导以及转基因表达都没有受到自噬缺陷的影响(补充图 3g,h)。4F-dT转导的第 12 天，我们计算诱导多功能干细胞集落发现重组完成，SSEA-1 染色阳性(补充图 3i)。与野生组相比较，ATG5 基因敲出的小鼠重编程效率连续提高了2-3 倍(图 3i,black columns)。显而易见地，将野生型的 ATG5 在基因敲除的成纤维细胞中过表达，会使重新编程速率降低到野生成纤维细胞的基本水平(图3i,white columns)，重要的是，在野生型和 ATG5 基因敲除小鼠之间，凋亡没有差异(补充图 3j)。此外，ATG5 基因敲除小鼠产生的诱导多功能干细胞是全能干细胞(补充图 4c-e,g,i)。ATG5 基因敲除小鼠能够提高重编程效率被产生OG2-Atg5 敲除小鼠及其成纤维细胞的重新编程所证实(补充图 3k)。为了研究自噬诱导对重新编程的时间效应，我们实用阿霉素诱导 ATG5，并且使它在 OG2-Atg5敲除小鼠中过表达，(图 3j)。在 ATG5 诱导自噬的处事及中期阶段(不包括晚期)，4F 对 OG2-Atg5 敲除小鼠重新编程受到抑制。为了进一步阐明自噬诱导与重新编程效率之间的负相关关系，我们也采用了 3F 对 Atg5 敲出成纤维细胞进行重新编程，我们发现将 3F-dT 转录到 Atg5 基因敲除的小鼠中无论伴有或者不伴有Atg5 基因，都对重新编程的效率没有影响，这与采用 3F 后低水平或近乎没有自噬的情况相一致(补充图 2h)。总的来说，这些结果说明了在重新编程中自噬的负调节作用(补充图 3l)。mTORC1 抑制是线粒体改造的基础以非自噬依赖的方式mTORC1 抑制是线粒体改造的基础以非自噬依赖的方式在 4F 的重新编程中，一个最明显的细胞改变是细胞大小的减小(图 4a)。在亚细胞水平，存在着线粒体质量的减少伴随着氧化磷酸化的减少(图 4b,c)。尤其是这影响着活性氧（ROS）的生成，表现为 ROS 的减少(图 4d)。最近，有人提出在线粒体的改造重新编程中自噬发挥着重要的作用。然而，我们的实验表明在重新编程中自噬是有害的。同样的，我们的透射电镜分析显示在重新编程细胞自噬泡的液泡的中没有任何明显的线粒体结构(see above 图 1e)。而且，在鼠胚胎成纤维细胞与 4F 重新编程的第三天中我们不能找到明显的线粒体(labelledby MT-DsRed)和自噬(labelled by EGFP-LC3)之间的共定位(图 4e)。此外，蛋白免疫印迹技术（western blotting）测定的线粒体蛋白 VDAC1 和 TIM23 在 Baf-处理和未处理细胞组之间没有区别(图 4f)。为了进一步证实这一结果，我们用shRNAsforAtg5,Becn1orVps34 抑制自噬，并观察到线粒体质量和 ROS 水平都没有改变。同时，当比较 Atg5 敲除型（KO）和野生型（WT）鼠胚胎成纤维细胞和4F 重新编程中我们没有发现在线粒体数量上的任何明显的改变（通过 qPCR 测定线粒体 DNA）(图 4i)，我们也没有发现任何细胞大小的改变(图 4j)。这些观察表明自噬对线粒体改造和重新编程中细胞大小的减小的影响较小。为了确定在重新编程的早起阶段线粒体改造是如何发生的，除了抑制凋亡、通过 YY1-PGC1(ref.32)和 TFAM(ref.33)积极调节线粒体生物起源和功能，我们还转向了 mTORC1 的研究。利用磷酸化的 S6K，即最具特征的 mTORC1 的下游基片，作为一个读出数据，在之前的报导中，我们证实了在重新编程过程和胚胎干细胞中 mTORC1 是被抑制的(图 5a 和补充图 5a,b)。通过蛋白免疫印迹技术（western blotting）测定其磷酸化形式发现这与激活其中一个主要的上游阻遏物 TSC2 密切相关。最近研究发现，在基因毒性应激中 p53 抑制 mTORC1 的活性。然而，正如我们在重新编程中观察自噬和 mTORC1 的抑制是独立于 p53 的，通过重新编程 p53 KO TTFs 和 4F 反转录病毒也得到了证明(补充图 5c)。然后，我们测定 2-因子-转导细胞鼠胚胎成纤维细胞中的磷酸化的 TSC2 和 S6K。我们观察到虽然 Klf4+c-Myc 和 Sox2+Oct4 抑制 S6K 活性，只有 Klf4+c-Myc 激活 TSC2的活性(图 5b)。这种影响不是由于 mTOR 表达的直接调节作用(补充图 5d,e)，这表明 2-因子组合通过不相关的机制使 mTORC1 失去活性。为了研究是否是mTORC1 调节在重新编程过程中的线粒体改造和细胞大小的的减小，我们使用 2specific shRNAs for Tsc2(图 5c)。这些 2 shRNAs 显著地再活化 mTORC1 活性、抑制凋亡(图 5e)。然而，这导致编程的效率降低而不是提高(图 5f)，这和以前的报导是一致的。显而易见的是利用 Tsc2 shRNAs 再活化的 mTORC1 增加了线粒体的质量(图 5g,h)和 ROS 的生成。这与增加线粒体生物起源的调节因子的信使 RNA 的表达、Pgc1和其下游的靶点密切相关(补充图 5f)，并伴随着大的细胞(补充图 5g)。然后我们在 4F 重新编程中超表达了 Pgc1和另外两个线粒体生物起源调节蛋白(Pgc1 和 Tfam)(补充图 5h)。Pgc1和 1,而不是Tfam，减少线粒体基因的表达、生物起源、ROS 的生成(补充图 5i 和 图 5jl)和阻止重新编程(图 5m)。为了进一步证实在 4F 重新编程中线粒体生物起源的mTORC1 激活的因果效应，我们也再鼠胚胎成纤维细胞中引入了 Tsc2 shRNA,Pgc1,1和 Tfam。正如所预计的一样，Tsc2 shRNA,Pgc1和在较小程度上 Pgc1激活线粒体生物起源和增加细胞的大小(图 5np 和补充图 5j)。这些改变连同减少细胞增殖(补充图 5k)让人想起 Tsc2/MEFs 的早衰观察(39)。因此，在重新编程过程中 mTORC1 不依赖自噬，对调节线粒体改造和细胞大小发挥着重要作用。p62，被自噬降解，促进重新编程p62，被自噬降解，促进重新编程为了探究自噬如何影响重新编程，我们专注于选择自噬降解的信号介质。我们具体分析了调节不同信号通路的多功能调节介质 NBR1 和 p62/SQSTM1（以下称为 p62），有趣的是，通过蛋白免疫印迹技术（western blotting）测定发现与WT 鼠胚胎成纤维细胞比较，是 p62 而不是 NBR1 在 Atg5 KO 鼠胚胎成纤维细胞和 4F 逆转录病毒重新编程的积累。同样的，当自噬被 Baf 或者一个遗传学方法所阻止，p62 就会在 WT 鼠胚胎成纤维细胞中积累(图 6bd)，当自噬由于 BECN1的超表达而被进一步激活 p62 就会减少(图 6e)。接下来，我们利用特定的 shRNAs敲除 p62(图 6f)，并观察到重新编程效率的降低(图 6g)。这些结果证明自噬反应抑制重新编程至少有部分原因是通过降解 p62。讨论讨论我们提出的证据表明，自噬早期是被重编程因子诱导的。然而，与我们预期的相反，自噬抑制而不是促进诱导多功能干细胞的生成。这与人们认为的自噬是一种应激反应，不但可以增加细胞的适应性而且同时对细胞也能造成损伤的想法是符合的（42）。与此相关的，我们和其他人已经表明重组早期阶段的特点是通过呼吸爆发产生应激反应进而导致细胞衰老（26,43,44）。4 种干细胞转录因子（SOX2，KLF4，OCT4，c-Myc）诱导自噬至少通过两种途径的协同作用。首先，SOX2，KLF4，OCT4，c-Myc 基因抑制 mTORC1，引起 ULK1介导的起始复合物激活。第二，Klf4 和 c-Myc 在转录水平诱导多种自噬相关基因。KLF4 和 c-myc 的影响是独立于 p53 基因（在其他环境里以参与触发自噬为大家所知23）和直接转录效应，如先前报道的芯片测序资料45（补充表 1）。相反，Oct4 和 Sox2 往往抵消由 Klf4 和 c-Myc 介导的自噬相关基因的增加，加强在重编程早期阶段过程中由外源性因素引发的相互矛盾信号的观点46。然而，出乎意料的是，在重编程过程中激活 mTORC1（通过消耗它的负调节物 TSC2）和抑制自噬相关基因的功能会有相反的功能改变。这种矛盾现象可以通过有促进作用的 mTORC1 对细胞结构的抑制效应来解释，包括线粒体重塑和细胞的大小，这可能是与 mTORC1 在 PGC1 活动32、全球蛋白质合成33和衰老39的作用有关。因此，在重编程过程中自噬的初活化是 mTORC1 活性的下调一个副产品，这将有利于细胞和代谢的重构。另一方面，在重编程中抑制自噬作用至少部分是通过对 p62的信号复合物的降解介导的（图 6）。mTORC1 是如何通过重组因子调节的,它是如何连接到其他相关应激信号通路的。如 AMPK（47），p38 和 JNK（48）（49,50），以及如何将这些信号集成到核心转录网络编程的值得进一步研究参考文献（51,52）。我们还应探讨 p62 是如何调节 4F（4 种干细胞转录因子）重新编程的，也希望这能为阐明 P62 在肿瘤发生发展中行之有效的作用提供新的视角。此外，它将有益于确定自噬是否以及如何影响人类的重新编程。在这方面，中间体，即所需的用于胞质分裂且在干细胞中含量特别丰富的细胞器，已被证明是由在人类体细胞重编程中的 NBR1（但不是 P62）介导的细胞自噬所降解的（53）。我们的工作还表明，胚胎干细胞比小鼠胚胎成纤维细胞和分化细胞有较高的自噬活性。这与最近一篇报道上提出的自噬通过维持最优水平的多能性转录因子从而在人类胚胎干细胞中起着关键的作用观点相一致（54）。未来的工作将需要进一步阐明自噬在与体细胞相比的多能干细胞中所起到的作用。在这个手稿的准备期间，据报道，在重编程早期阶段的受限自噬的突然爆发（引起线粒体自噬）对诱导多功能干细胞生成是至关重要，这主要是由 SOX2 通过对 mTOR 的瞬态直接转录抑制实现的（30）。两个研究之间的差异性很难通过使用类似的实验模型来调和，包括 ATG5（自噬相关基因）KO 小鼠以及小鼠胚胎成纤维细胞。然而，重编程的动力学和效率对包括转录因子计量（55,56），试剂和协议等试验参数是非常敏感的，这也许能对两种研究之间的差异性作出解释。进一步对 mTORC1 和自噬对重编程机制的了解以及如何由外源性因素引起的变化可以帮助我们解决两个研究间的差异性，也会对其它研究领域有影响，比如在癌症的发展过程。方法方法动物和细胞培养动物和细胞培养p53/和 Atg5+/老鼠从南京大学的模式动物研究中心购得，后者获得RIKEN BRC and Y.Chen（清华大学 生物膜与膜生物工程 国家重点实验室，北京，中国）的许可。药物诱导的二级重新编程的小鼠从Jackson实验室购买。Atg5/小鼠胚胎成纤维细胞由E13.5胚胎和Atg5+/小鼠杂交而成。OG2 成纤维细胞和OG2 二级成纤维细胞由携带Oct4-GFP转基因的等位基因的E13.5胚胎单独获得，或分别由可诱导的OSKM和rtTA转基因获得。Atg5+/OG2+/小鼠是由Atg5+/、OG2+/+小鼠杂交而获得。.Atg5/OG2+/成纤维细胞是由E13.5胚胎和Atg5+/OG2+/杂交获得。所有的成纤维细胞在高糖的DEME(ThermoHyclone)补充10%胎牛血清（FBS、PAA）、GlutaMax(Invitrogen)、非必需氨基酸（NEAA,Invitrogen）、青霉素/链霉素(Thermo Hyclone)。P53敲除的小鼠尾成纤维细胞按上述的标准分离培养的。诱导型多能性干细胞克隆体由在KSR-based mouse ESC medium饲养层细胞培养，也就是去除DMEM，用15敲除血清替代品（KSR，Invitrogen），Glutamax，非必需氨基酸，丙酮酸钠，青霉素/链霉素，巯基乙醇（全来自Invitrogen）和1,000Uml-1，LIF（Millipore）。诱 导 型 多 能 性 干 细 胞 产 生诱 导 型 多 能 性 干 细 胞 产 生pMXs 逆 病 毒 载 体 质 粒 for4F(Addgene,www.addgene.org)使用改良的磷酸钙转染方法转染到Plat-E细胞。将培养基转染8-12小时后改变。48小时后，该病毒通过过滤收集。通路2或3 OG2成纤维细胞以4-5千细胞每平方厘米接种与逆转录病毒结合，第0天被指定为第一感染的时间点。慢病毒用包装载体包装在HEK293T细胞。经过2轮24小时的逆转录病毒感染或1轮8小时的慢病毒感染,培养基改为以标准15%的PBS 为基础(GIBCO,Invi