实验性肝损伤动物模型制备及指标测定的评价.pdf

!总第#$期大理医学院学报%&年第&卷第#期作者简介：彭芳()$*+,，女，湖南衡阳人，副教授，主要从事药理学研究-主诉发热、咳嗽.，曾用青霉素、先锋霉素等西药治疗，发热不退，咳嗽加剧。症见：发热，咳嗽微喘，痰多，无汗/口渴，大便三日未解，小便黄，舌质红苔微黄，脉浮数。体查；急性病容，精神疲软，0#)-12，呼吸%1 次 3 456，心率%&次 3 456。左肺呼吸音粗，右肺可闻及中、细湿罗音。实验室检查：血常规：789&-*:&)3;，其中 光摄片示：右下肺肺炎。西医诊断；病毒性肺炎。中医诊断：风温肺热。治则：辛凉解表、宣肺止咳。方药：解表止咳饮加大黄。处方：银花 1?连翘 1?杏仁%?桔梗%?百部 1?荆芥 1?薄荷 1?甘草$?大黄 1?，一剂后，大便通，发热退(0#!-12,，咳嗽减轻，痰量减少，精神好转。表邪已解，余热未尽，原方去大黄继服%剂，第*A 体温降至正常，食欲增进，有轻咳，舌苔薄白，脉象平和。原方继续服#剂，诸症悉平，肺部呼吸音清晰，饮食睡眠、大小便正常，病愈出院。*体会风温肺热病是一多发病，常见病，一年四季可见，尤以冬春季节为多见，具有一定的传染性或流行性，无论男女老幼均可罹患。研究对本病的防治，提高治愈率具有一定的临床意义。风温邪袭肺卫的症冶，清叶天士 温病论 提出：“邪尚在肺，肺主气，其合皮毛，故云在表，在表初用辛凉轻剂。”陈平伯 外感温病篇 中：“风温症邪在表者，当用薄荷、前胡、杏仁、桔梗、桑叶、川贝之属，凉解表邪。”对于本病的治疗，叶、陈二氏仅只提出治法，未形成系统化、规范化的特定方剂。吴鞠通在叶、陈二氏基础上提出：“治上焦如羽，非轻不举”的原则，首创银翘散、桑菊饮。“太阴风温恶热，不恶寒而渴者，辛凉平剂银翘散主之”。(温病条辩 上焦篇第 条,。太阴风温、但咳，身不甚热，微渴者，辛凉轻剂桑菊饮主之”。(温病条辩 上焦篇第$条,。但临床上每每出现风邪既袭表，又客肺络，导致邪正相争、卫阳被遏、肺气不宣的病理机制，临床表现为发热、恶寒、咳嗽。对此类证型，后代医家尚无行之有效的方药治疗。据此，李老医师在遵古训的前提下继承发扬自拟解表止咳饮。该方为银翘散、桑菊饮二者并治之方，因上二方均可用于风温邪袭肺卫症治。银翘散用于风温客表，以发热、恶寒为主，表症重而咳嗽轻者；桑菊饮用于风邪袭肺，以咳嗽为主，表症轻而咳嗽重者。解表止咳饮用于风邪既客表又伤肺络，表症与咳嗽并重者，充实了历代医家对此病的认识与治疗上的不足。方中银花、连翘清热解毒，杏仁、桔梗、百部、甘草清宣肺气以止咳，荆芥、薄荷解表发汗，祛邪外出，诸药配伍，共凑辛凉解表、宣肺止咳之功，临床疗效确切，丰富了风温邪在肺卫证治的内容。收稿日期：%&B&1 B#肝炎的发病机制常涉及到病毒、炎症介质释放、免疫功能紊乱、自由基损伤等多种环节。研究肝炎的发病机制和保肝药物的作用原理需要建立合适的实验性肝损伤动物模型。因此，在抗肝炎药物研究中可采取损伤机制不同的多个模型上观察药物的保护作用，以综合判断药物疗效和作用机制。现就实验性肝损伤多种动物模型制备及指标的测定等方面进行综述。实验性肝损伤动物模型制备及指标测定的评价彭芳，翟培红%，王雷达%(-大理医学院药理教研室，大理$!&；%-)$级药学系实习生,C摘要D目的：综合实验性肝损伤的动物模型及指标测定的特征，以评价他们的优缺点。方法：对国内外文献进行归纳、分析及总结。结果：系统阐述该领域在国内外的研究现状，为今后的研究起到指导作用。结论：实验性肝损伤的模型及测定的指标很多，各有其特点。C关键词D实验性肝损伤；动物模型；指标评价中图分类号：E)$!文献标识码：F文章编号：&B%(%&,B&#B&!B&#!彭芳等实验性肝损伤动物模型制备及指标测定的评价总第#$期第%&卷%各种模型的机理%体内肝损伤模型%化学性肝损伤模型该模型主要是由四氯化碳()*+,、-.半乳糖胺(-./0*,、扑热息痛(1212,、醋氨酚(112,、硫代乙酰胺(311,、磷、乙硫氨酸(-4.5,、氯化镉()6)*7,、0.萘异硫酸酯(1893,、致黄素、乙醇等引起的小鼠或大鼠急慢性化学性肝损伤。)*+进入体内后，经肝细胞色素 2+&激活，生成三氯甲基自由基()*#,，通过氢吸附而攻击内质网膜的磷脂分子，引起膜的脂质过氧化，)*#继而与膜脂质和蛋白质大分子进行共价结合，引起膜结构和功能完整性的破坏，)*#还可以抑制细胞膜和微粒体膜上钙泵的活性，使)07:内流增加，从而引起细胞中毒死亡。311、112 也经肝2+&代谢激活为有毒代谢物引起肝损害。大剂量使用 1212 时，因葡萄糖醛酸和硫酸结合反应的解毒途径趋于饱和，过剩的 1212 经肝脏2+&酶系代谢成半醌类中间产物，同时，氧分子也经2+&活化成活性氧(;7.,两者引起肝脏/-2结合而形成复合物，使 32 耗竭，尿苷类化合物环化不能进行，致使?81 和蛋白质合成受阻，质膜结构蛋白质合成减少，使-2/.焦磷酸转移酶活性和数量下降，引起糖(包括糖原和多糖,和磷脂代谢障碍，膜损伤加重，)07:内流增加，最后细胞中毒死亡%A。致黄素、1893 曾广泛地应用于研究肝内胆汁淤滞及实验性胆汁性肝硬化7A。%7免疫性肝损伤模型免 疫 性 肝 损 伤 模 型 多 采 用 刀 豆 蛋 白 1()BC1,、卡介苗:脂多糖(D)/:42,造模。辅助性 3 细胞(3=,和巨噬细胞是)BC1 型肝损伤模型的效应细胞。当)BC1 活化 3=细胞后刺激巨噬细胞和肝细胞共同产生大量 38E.0 等因子。38E.0 已被证实为细胞因子网络中介导肝损伤的终末介质，它既是细胞凋亡的正性触发因子(当38E.0 过量生成即充当肝细胞凋亡刺激因子,，又直接损伤血管内皮细胞，还可活化中性粒细胞促进其趋化以聚集于肝脏，释放蛋白酶或氧自由基引起肝细胞凋亡或坏死#A。38E.0、94 及内毒素可诱导非)07:依赖性的 F8;产生大量 8;+A。8;是一种新型的细胞信使分子和细胞毒性因子，高水平的 8;导致细胞毒作用，介导免疫损伤A。D)/:42 所致肝损伤机制为巨噬细胞介导的免疫性肝损伤，激活的巨噬细胞释放多种免疫效应分子如活性氮、活性氧和细胞因子等$A，最终导致组织严重的过氧化损伤。%7体外肝脏损伤模型体外肝损伤模型通过分离肝细胞，然后进行肝细胞的原代培养，检测其存活率在 G&H 以上方可加入致毒物质(如)*+、D)/:42,用于实验，机理同上。7模型的制备7%化学性肝损伤模型常用小鼠或大鼠。在给化学毒物前&.*I 给药一次或数次，正常对照组及损伤组给予相应的溶剂，阳性对照组可给相当剂量的已知药。化学毒物参考剂量：FJ&%H)*+%&KL M NL；FJ 1212%&.%#&KL M NL；FJ 112%!KL M NL BO&KL M NL FL；FJ-./0*$&.P&KL M NL；-4.57&KL M NLFL；1893&.%&KL M NL FL；FJ 311&KL M NL；尾 FQ)6)*7#KL MNL；FL+H乙醇%&K*M NL；FJ 磷 R%&KL M NL。以上药物随给药时间的延长均可造成化学性慢性肝损伤模型。如：磷以%KL M NL 给兔或豚鼠连续口服+R$个月可引起肝硬化。&H-4.5 连续饲养动物二个月可引起胆管增殖及结节性肝硬化，若持续给药 P RG 个月，有些动物可发生肝癌。1893 连续应用+个月，可引起胆管上皮增生，若用至!个月，可出现胆汁性肝硬化。ST%H)*+KL M NL，连续#个月，可造成慢性肝损伤模型。7 7免疫性肝损伤模型常用小鼠或大鼠。正常对照组及损伤对照组给予同体积的溶剂，阳性对照组给相当剂量的已知药。每只小鼠尾 FQD)/%R 7 KL 一次，可于注射前&.%I 给待测药物一次或数次，注射 D)/%76 后每只小鼠再尾 FQ42 7 R+!L 一次，于注射 42 后%7I，处死动物，测定生化指标及做病理检查!A。另一种方法是给小鼠尾 FQ)BC17&KL M NL 制作肝损伤模型PA。7#体外肝损伤模型将大鼠乙醚麻醉，开腹，肝门脉插管。先用#!U无钙液灌流，然后用含有!总第#期大理医学院学报$%&年第&%卷第#期胶原酶的含钙灌流液灌流，分散肝细胞，得到初始肝细胞悬液，检定细胞存活率和产量后，将培养液适当稀释，分装于培养皿内，置()*$的培养箱内培养，或置于试管内作振荡培养。若制成四氯化碳肝细胞损伤模型，则肝细胞培养$+,后换入含 有&%-.四 氯 化 碳 的 培 养 液，继 续 培 养%-/0。若用 1)2 致敏小鼠肝细胞，同时加待测药及 345，继续培养，分别于#、&$、$+,的时间点收集细胞及细胞上清，置 6!%7 冰箱保存待用8!9。#测定的指标#:&一般生化指标肝脏受损时会导致血清24;、2*;、3=、.、;2、)?、;A 6!、;1B3、*等升高，血清和肝组织 25=、5*C 2 可反映肝脏纤微化程度。为反映肝脏损伤的程度可测定以上指标。#:$免疫学指标除以上指标外，可测定巨噬细胞吞噬功能，溶血素的生成，25;，B3 6$，)#D 受体花环率，B)花环率及脾、胸腺指数等。#:#形态学改变及病理切片检查)E+致肝脏外观呈土黄色，病理切片检查可见肝脏炎症细胞浸润，指肪性变和肝细胞坏死。44、6 2FE 所致肝损伤模型的病理检查同)E+，形态学改变分别为肝脏肉眼可见大片暗紫色坏死灶、弥漫性病变。磷在给药&$,后即可见小叶周围性肝细胞坏死，而后扩展到小叶中央乃至全叶。B;给药+H!J 可见门静脉区胆管上皮细胞发生水肿，空泡变性乃至坏死，胆管为脱落的细胞的屑等堵塞，坏死区周围有炎性细胞浸润，肝实质细胞变化甚轻。免疫性肝损伤模型肝脏病理检查以肉芽肿炎症浸润为主，如水肿样变性，嗜酸性坏死，肉芽肿样病灶，胆管上皮增生及淋巴细胞和嗜伊红细胞浸润。+评价体外肝损伤模型具有个体差异较小，稳定性、重现性较体内模型好等优点，随着实验水平的不断提高也逐渐被广泛应用。体内模型操作简便，模型病理模拟性、重现形较好，也广泛应用。其中化学性肝损伤模型是目前国际上常用的肝炎模型，中毒机制研究也较为深入，常用)E+，K44、4、鳞、B;所致肝损伤模型除 B;仍用于淤胆型肝炎的研究外，已较少应用。此外，免疫系统功能紊乱在慢性肝炎、肝硬化、酒精中毒性和药物性肝损伤中发挥着重要的作用，因此，免疫性肝损伤模型也越来越多地应用于抗肝炎药物的研究。如何正确判断肝纤维化的程度，仍是实验研究中尚未完全解决的问题8L9。人类肝病的发病机制较为复杂，应用可控的动物模型可正确分析其各种发病机制，严格的组织病理、生化和生理观察均可正确判断药物疗效。不同的动物模型应选择合适的测定指标。随着实验动物科学的不断发展，将建立更符合临床发病机理、更经济、重复率高的模型，从而推动各类肝病发病机制及有效防治的研究。参考文献：8&9张均田:现代药理实验方法M下册N 8.9:北京：北京医 科 大 学、中 国 协 和 医 科 大 学 联 合 出 版，&LLI:&#L!6&+%!:8$9朱愉，多秀瀛:实验动物疾病模型 8.9:天津：天津科技翻译出版公司出版，&LL，I%6 I+:8#9唐望先，李小纲，王天才，等:抗肿瘤坏死因子 6 F 单克隆抗体对肝细胞凋亡和坏死的影响 8O9:胃肠病和肝病杂志，&LL!，M&NP+$6+:8+9F,F0 QR S/T UV:/W?/Q XS/JT YZ0EFYTY：?XETYR WEXEEY F0JQX0W?XEY8O9:)TEER&LL+R!IP L&:89张亚兵，李之清，张亦志:蛇葡萄根对)X0 诱导小鼠肝损伤的防护作用 8O9:中西医结合肝病杂志，$%，&%M&NP$6$L:89李颖，彭仁绣:阿魏酸钠当归醇沉物对免疫性肝损伤的干预作用8O9:中草药，$%，#&M+NP$!+6$!:8!9王明宇，林志彬:灵芝三萜类成分在体内外对小鼠免疫性肝损伤的影响 8O9:中国药学杂志，$%，#M&$NP I%L 6 I&$:8I9李小刚，王天才，李绍白，等:地塞米松对刀豆蛋白 引起肝损伤小鼠的保护作用 8O9:基础医学与临床，&LLI，&IM#NP+6+!:8L95Q,TT?4O:)EFYY/QFW/X0 X Q,?X0/Q/?FE,T_FW/W/Y：F0TTJ X?TFYYTYY-T0W:O=T_FW,XER&LLR&#MNP#!$6#!:收稿日期：$%&6%$6$!总第#期彭芳等实验性肝损伤动物模型制备及指标测定的评价第$%卷作者简介：阿周存&$#()，男，云南弥渡人，讲师，主要从事高分子生物学研究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摘要P目的：介绍短串联重复序列在医学中的应用。方法：查阅国内外有关文献加以综述。结果：短串联重复序列已广泛应用于医学临床和研究。结论：短串联重复序列是目前医学中应用的主要遗传标记。O关键词P短串联重复序列；遗传标记；基因中图分类号：Q$R*%S文献标识码：N文章编号：$%S(SSST&T%$)(%(%!(%短串联重复序列在医学中的应用阿周存，马志敏，陈玲&大理医学院生化分子生物学教研室，云南大理#!$%)人类基因组中存在大量的+UN 多态标记，这些遗传标记的发现和应用，极大地推动了人类遗传学和医学遗传的研究。+UN 多态标记已应用于遗传制图、基因定位、遗传病的诊断及产前诊断、法医学鉴定等。迄今为止，发现和应用的+UN 多态标记包括限制酶片段长度多态性&QVW5)、数目可变的串联重复序列&XUQ)、N8C 序列、线立体+UN&10+UN)、短串联重复序列&YQ)、单核苷酸多态性&YU5)等。在这些+UN 多态标记中，YQ是目前最广泛应用的遗传标记。$短串联重复序列&YQ)短串联重复序列&B63/0 0.2,1/,-,.0，YQ)亦称微卫星+UN，是一类广泛分布在人和动物基因组中的+UN 重复序列片段，一般为$Z#核苷酸呈串联重复排列而成，片段长度为$%Z%E-，多位于基因编码区附近、基因内含子和非翻译区。常见的 YQ 形式有二核苷酸重复的&?N)2、&N)2、&NN)2、&)2，三核苷重复的&?N)2、&?)2 和四核苷酸重复的&NN)2、&NN)2等。据估计，人类基因组约有%万个 YQ 位点，其中以&?N)2 重复序列最多，约有%($%个，即平均每%(#%E+UN 就存在一个O$(TP；三、四核苷酸重复序列位点约有#%($%个。$R 年两个研究小组用 5?Q 证明&?N)2 的二核苷酸串联重复序列具有高度的多态性O(SP；随后又发现三核苷酸和四核苷酸串联重复序列也具有多态性OP。近些年来的研究表明，人类基因组的 YQ 位点有一半具有多态性，因此，YQ 作为一类丰富的遗传标记而受到广泛的重视。目前，法国的,2,0632 筛选收集了%多个二核苷酸重复的 YQ，美国人类连锁合作中心&?W?)筛选收集了$%多个 Z S 核苷酸重复的 YQ。这些筛选收集的 YQ 遗传标记均有统一的登记号，位点名称，详细的染色体定位，侧翼引物序列，扩增片段长度，等位基因数目及频率，位点的杂合度等资