小鼠HSV22阴道炎粘膜上皮细胞凋亡和Fas.pdf

小鼠HSV22阴道炎粘膜上皮细胞凋亡和Fas?FasL异常表达关系的研究3湖北省孝感学院(孝感432000)唐省三董长垣3 3王立华陈晓3 3郭淑芳3 3陈保平3 3 3苏越刘红云摘要目的:探讨HSV22在体内诱导细胞凋亡的效果、形态学特点和Fas蛋白的表达。方法:用HSV22 333株感染小鼠阴道,光镜下进行原位观察,TUN EL末端标记染色显示凋亡的细胞,免疫组化技术检测Fas蛋白的表达。结果:感染后的第1天粘膜上皮内即出现大量的凋亡细胞,第36天凋亡细胞的数量及在上皮内的分布范围达最高水平。凋亡细胞被TUN EL标记染成棕褐色,经免疫组化技术证实凋亡细胞有Fas蛋白的表达。结论:HSV22 333株阴道感染可同时诱导细胞坏死及凋亡,Fas蛋白的表达参与了细胞凋亡的发生。细胞凋亡可能在限制病毒产生子代及限制感染区域扩展中起重要作用。主题词疱疹病毒2型,人阴道炎上皮细胞细胞凋亡Fas蛋白小鼠The relation between the vagina epithelia apoptosis and theexpression of Fas Protein in m iceXiaogan U niversity(Xiaogan 432000)Tang XingsanDong ChangyuanW ang L ihuaet alABSTRACTObjective:To explore the effect of HSV22 strain 333 on induction of apoptosis and itsmorphological characters and the expression of Fas protein in vaginal epithelia in m ice infected w ith thevirus intravaginally.M ethods:M ice were killed day 1212 days after infection(P.I.).The vaginas weretaken and fixed in 10%neutral formalin for paraffinembeding section and TUN ELstaining andi mmunohistochem itry technique to demonstrate apoptosis.Results:N umerous apoptotic cells appeared inthe epithelia on the first day of infection,the number of the apoptotic cells reached to a high levelon day 326 P.I.Apoptosis cells are stained by TUN EL staining and had the expression of Fas protein.A t the sameti me,the necrotic areas and herpetic vesicles in the epithelia could be found to be restricted only in someareas and were surrounded by the apoptotic areas.Conclusion:The results showed that the HSV22 strain333 could induce apoptosis and necrosis of vaginalmucosal epithelia at the same ti me in m ice.There is theexpression of Fas protein in apoptosis cell.The apoptosism ight play an i mportant role in li m iting both therange of viral spreading and the production of progeny virus.KEY WORDSHerpesvirus2,humanV aginitisEpithelial cellsApoptosisFasproteinM ice细胞凋亡(Apoptosis)是指在活组织中,单个细胞受其内在基因的编程调控,通过主动的生化过程而“自杀”死亡的现象,是一种正常生理性3湖北省教育厅基金资助(2002B2001)3 3武汉大学医学院病毒所3 3 3武汉大学医学院中心实验室行为。近年来研究发现:凋亡失常(凋亡不足或凋亡过度)参与多种疾病的发生与发展。细胞凋亡除了对机体体形的形成和保持起重要作用外,为保护机体不受损害,对清除含有突变基因或经病毒感染的细胞也很重要。目前对病毒感染与细胞凋亡之间的关系很重541陕西医学杂志2005年2月第34卷第2期视,并将凋亡视作一种对病毒的防御机制1,2。由于HSV22是常见的感染阴道的病毒,被视作性病毒,对其阴道感染诱导的凋亡及抗凋亡(溶解性感染)特点进行研究有助于临床诊断、治疗及预防。因此我们就HSV22 333株的阴道感染诱导的凋亡及其限制感染的形态学进行了原位研究,并且采用了免疫组化技术检测HSV22 333株感染小鼠阴道上皮凋亡细胞Fas蛋白的表达,探讨Fas?FasL系统与HSV22 333株感染小鼠阴道炎的关系。材料与方法1动物及分组Balb?c小鼠,4周龄,雌性,重1315g,100只,购自湖北省医学实验动物中心,严格按兄妹交配繁殖传代。随机分为5组,每组20只。分组后,测量体重,经统计,组间体重差别无意义。TN F2购自武汉博士德生物工程有限公司。实验分组及处理,组1:接种HSV22 333的同时应用TN F2;组2:接种HSV22 333后第3天应用TN F2;组3:小鼠阴道内应用TN F2;组4:小鼠阴道内接种HSV22 333野生株。组5:小鼠阴道内用无病毒感染V ero细胞悬液接种,作对照。2病毒和细胞HSV22 333株购自中科院武汉病毒所中国普通病毒保藏中心。V ero细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。培养用DM EM培养基+10%小牛血清,常规加入青、链霉素。病毒的滴定方法:将单纯疱疹病毒放在V ero细胞中培养48h,当有50%V ero细胞产生变大、变圆或融合性病变时,收集病毒测定该病毒滴度为TC I D501025。3方法3.1动物接种动物室保持空气新鲜,维持相对湿度60%,温度204。根据毒性试验,将病毒液稀释6倍,用0.03m l,稀释液吸入明胶小块,然后塞入小鼠阴道,直抵宫颈,每鼠感染1次。组3和组5小鼠分别以TN F2和V ero细胞悬液用同法塞入小鼠阴道。各组动物分别于处理后不同天数(1、3、6、12d)连同对照动物断颈致死,每组每次5只,取其阴道,固定于中性福尔马林,石蜡包埋切片,供HE染色、未端标记染色和免疫组化法之用。3.2电镜检查取阴道组织于0 4条件下用2.5%戊二醛固定,常规制备超薄切片,醋酸铀、柠檬酸铅染色后,进行电镜检查。3.3原位末端标记法(TUN EL)检测凋亡细胞试剂盒由美国Oncon公司生产,操作按说明书进行。结果判定:正常细胞核呈绿色,凋亡细胞核呈棕褐色(甲基绿复染)。3.4凋亡细胞半定量分析显微镜下观察,根据凋亡阳性细胞分布情况,每张切片计数5个阳性视野,每个视野计数300个心肌细胞中阳性细胞数,以平均计算阳性细胞数所占的百分比作为凋亡细胞阳性指数(A I)3。3.5免疫组化法检测Fas、FasL免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。免疫组化检测阴道粘膜上皮组织Fas和FasL表达,采用石蜡切片酶消化程序:4m厚阴道粘膜上皮组织切片,脱蜡、水化、3%H2O2灭活、复合消化液消化、正常山羊血清封闭。分别加入兔抗小鼠Fas或FasL单克隆抗体(稀释度为150)4过夜,然后加入即用型生物素化羊抗兔IgG,PBS洗涤,加SABC,DAB显色,光镜观察阳性信号。用PBS代替一抗作阴性对照。每张切片在200倍视野下随机选择10个视野,用I DA22000高清晰度数码显微图像分析系统进行Fas和FasL平均吸光度。结果1光学显微镜检查组1、组2、组3和组4小鼠阴道粘膜上皮细胞坏死及细胞凋亡。固有膜内有以淋巴细胞为主的炎性细胞浸润。这些改变从病毒接种的第1天开始持续到实验结束时(感染后12d)仍未消失。在病毒感染的第36天,病变最为明显。组5小鼠未发现这些变化。组1、组2、组3和组4小鼠阴道炎检出率分别为80.00%、90.00%、0.00%和100.00%,见附表;组5小鼠阴道粘膜上皮细胞未见异常(见附表)。2电镜检查电镜下可见组1、组2、组3和组4小鼠阴道粘膜上皮细胞有细胞变性、坏死,表现为线粒体肿胀,嵴断裂,有的呈空泡样变,肌浆网扩张,肌丝稀疏、溶解,细胞核异形变。从病毒感染的第112天均可见上皮内有凋亡细胞,它们以群体出现,彼此连接,很少孤立、散在。在细胞凋亡的早期,细胞核并不固缩,呈正常核的外观,染色质细丝均匀地分布于核内。随后凋亡细胞核明显固缩,染色较深,染色质细丝不能分辩,641陕西医学杂志2005年2月第34卷第2期染色质在核周边集聚,核中心呈空白透明区,形似面窝状。在凋亡区内可见一些核固缩的凋亡细胞从上皮表面脱落,很少见到凋亡小体的形成和吞噬现象。附表5组小鼠阴道炎的检出、细胞凋亡及Fas蛋白表达情况组别n阴道炎的检出率例数百分数(%)细胞凋亡(+)例数百分数(%)Fas蛋白(+)例数百分数(%)1201680.001680.001575.002201890.001470.001260.0032000.001155.00945.0042020100.00945.00735.0052000.0000.0000.003TUN EL法检测凋亡细胞凋亡细胞的核经TUN EL染色(末端标记染色)呈棕褐色,正常细胞核呈绿色。组1、组2、组3和组4小鼠阴道粘膜上皮细胞凋亡率分别为80.00%、70.00%、55.00%和45.00%。阴道粘膜上皮系复层扁平上皮,一般可分表层、中层及底层(包括基底层和傍基底层)。在病毒感染第1天的标本上,可见到凋亡细胞与非凋亡细胞混合存在于上皮各层之中,数目较少。第3天开始即可见成群的凋亡细胞分布于上皮的所有细胞层中,彼此相连接,很少孤立存在。仅有少数标本可见凋亡细胞只在表层或只在基层,与感染天数无明显关系。组5小鼠阴道粘膜上皮细胞未发现凋亡细胞(见附表)。凋亡细胞阳性指数(A I)范围在34.1411.5626.4110.2之间,其中组1A I 组2A I 组3A I 组4 A I。4免疫组化技术检测Fas蛋白组1、组2、组3和组4小鼠阴道粘膜上皮细胞Fas蛋白表达率分别为75.00%、60.0%、45.00%和35.00%,分布区域与凋亡细胞一致。组5小鼠阴道粘膜上皮细胞无Fas蛋白表达(见附表)。讨论本实验显示当HSV22 333株感染小鼠阴道时同时诱导了阴道粘膜上皮细胞广泛的凋亡及局灶性上皮细胞坏死,即溶解性感染。研究表明凋亡是宿主细胞对各类野生型病毒感染的反应,由于感染细胞的主动地提前死亡(凋亡)可以限制病毒子代的产生。本实验报道的由HSV22阴道感染同时诱导的上皮细胞的凋亡与坏死,及前者限制后者的原位观察结果,加强了这一观点。本实验结果与Hata等4报道的有关野生型HSV22能诱导HEP22细胞凋亡的结果相似,但与A sano等的实验结果不同,该实验显示野生型HSV22 186感染小鼠角膜不诱导凋亡,其U S3缺陷突变株才可诱导。本实验应用的是HSV22 333株感染阴道。这可能与HSV22病毒株和感染器官不同有关。又有报道5野生型HSV22虽有抑制凋亡的基因,但不能抑制由紫外线照射或fas抗体诱导的V ero和Jurkat细胞凋亡。这一事实启示人们若应用某些诱导凋亡剂来限制阴道HSV22感染将成为可能。根据本实验观察,由HSV22诱导的小鼠阴道粘膜上皮经TUN EL染色显示在凋亡细胞早期,胞核无固缩现象,形如正常,随后发生核固缩,染色质边集,核中心空化,形似面窝,最后单个或成片的从上皮脱落到至阴道,而末见凋亡小体及吞噬现象。据此特点,经TUN EL染色的人阴道刮片,根据凋亡细胞的发现可能会有助于HSV22或其它病毒感染的诊断。当然要与生理或其它刺激所诱导的凋亡相区别。细胞凋亡是多细胞有机体为控制机体发育、维护内环境稳定由基因控制的细胞主动死亡过程。细胞内外的凋亡诱导因素通过多种信号转导机制来控制凋亡,其中Fas和FasL系统是重要的凋亡信号转导系统之一。Fas和FasL分别是细胞表面?、型跨膜蛋白,两者相互结合后可介导细胞凋亡,HSV22 333株感染小鼠阴道粘膜上皮细胞可检测到Fas?FasL蛋白表达。本实验证实(下转第187页)741陕西医学杂志2005年2月第34卷第2期切除术和巨大肺大泡切除等手术4,能使常规手术器械和内镜器械相配使用,同时也便于切除标本从切口取出。辅助小切口的胸腔镜手术接近VA TS手术的创伤,同样具备胸腔镜手术的优点,并可以减少手术材料消耗,降低手术费用,更适合基层医院。此外在胸腔镜的引导下,根据病变位置选择小切口部位,切口就能选在最佳暴露位置,既便于操作,切口又不太大,同时肋骨撑开也是有限的,所以并不明显增加术后创伤。与单纯小切口开胸手术比较,除了定位准、切口更小、肋间撑开有限等优点外,还有胸腔镜辅助下视野大、光线好,并有放大病灶作用,更容易发现细小病灶和消除肉眼死角。本组有2例患者就加用了VAM S顺利完成手术,术后次日即下地活动,未见损伤加重。所以我们体会VAM S是胸腔镜的延伸和补充,能进一步扩大胸腔镜的适用范围。4外伤性血气胸VA TS对于胸部复杂外伤的诊断和各脏器损伤情况的评估具有重要意义。血胸可由肺组织破裂出血、肋间血管或胸廓内血管、心脏和大血管受损破裂引起。VA TS手术可在直视下探查出血原因,给于缝扎处理。本组3例外伤性血气胸均行血胸清除、肺修补术,胸腔镜监视下内镜钳控制肋间出血,电凝棒或钩状电刀电灼止血,避免了开胸手术,充分发挥了胸腔镜的优势。参考文献1Jaklitsch M T,Decamp MM,L iptay M J,et al.V ideo2assisted thoracic surgery in the elderly:a review of307 cases.Chest,1996;1107512Freixinet J,Canalis E,R ivas JJ,et al.Surgicaltreatment ofpri maryspontaneous pneumothoraxw ith video2assisted thoracic surgery.Eur Respir J,1997;10(2)4093Yi m A P,W an S,L ee TW,et al.VA TS lobectomyreducescytokineresponsescomparedw ithconventional surgery.A nn Thorac Surg,2000;70(1)2434王正,李标,杨超,等.老年人电视胸腔镜手术73例分析.中华老年医学杂志,2000;19(4)79(收稿:2004208201)(上接第147页)Fas?FasL系统参与了HSV22 333株病毒性阴道炎阴道粘膜上皮细胞凋亡的发生。其详细信号转导机制有待进一步研究。本实验证实HSV22 333株病毒性阴道炎阴道粘膜上皮中可见细胞凋亡现象,揭示细胞凋亡参与了发病机制,细胞凋亡可限制病毒的进一步繁殖和传播,是一种自身保护机制,以牺牲少数细胞为代价从而保护了大多数细胞。同时也证实了TN F2可促进阴道粘膜上皮细胞凋亡的发生。这为TN F2在临床上应用于治疗HSV22 333株病毒性阴道炎提供了理论基础。参考文献1OBrien V.V irus and apoptosis.J Gen V irol,1998;79(7)18332A sano S,Honda T,Goshi ma F,et al.U S3 proteinkinase of herpes si mplex virus type 2 play a role inprotecting corneal epithelia cells fromapoptosis inaffected m ice.J Gen V irol,1999;80(9)513赵明中,陈运贞,李媛媛.大鼠心肌再灌注时心肌细胞凋亡、Fas基因表达及缺血预处理对其影响.中华内科杂志,1999;38(11)7534Hata S,Koyama A H,Shiota H,et al.Apoptoticactivity of herpes si mplex virus type 2:the role ofU S3 protein kinase gene.M icrobes Infect,1999;1(8)6015Jerome K R,Fox R,Chen Z,et al.Herpes si mplexvirus inhibits apoptosis through the action of twogenes,U S5 and U S3.J V irol,1999;73(11)8950(收稿:2004207201)781陕西医学杂志2005年2月第34卷第2期