食品化学与分析实验指导书.pdf

食品化学与分析 实实 验验 指指 导导 书书 北京农学院食品科学系 食品化学课程组编写 二 0 0 七年九月 1 目 录 目 录.3 第一部分 样品预处理方法实验一 湿法消化.3.3 实验二 蒸馏实验三 色层分离.4.6 第二部分 实验数据处理基础知识.8 第三部分 食品化学实验.8 实验一 淀粉糊化及酶法制备淀粉糖浆及其葡萄糖值的测定实验二 脂肪过氧化值、酸价的测定(滴定法).9 实验三 蛋白质的功能性质.10 实验四 番茄红素直接测定法.12 实验五 酚酶提取及活力测定.12实验六 脂溶性维生素的测定 13 .18 实验七 水果皮颜色和淀粉白度的测量 测色色差计的使用实验八 绿色果蔬分离叶绿素及其含量测定.20.22 第四部分 食品分析实验实验一 用物理方法测定食品中相关组分.22 实验二 食品中水分的测定方法.22 实验三 总酸的测定.23.24 实验四 脂肪含量的测定.25 实验五 食品中淀粉的测定方法.26 实验六 食品中蛋白质的测定方法.27 实验七 抗坏血酸（维生素C）的测定.32 实验八 食品中亚硝酸盐的测定方法.33 实验九 钙含量的测定.35 实验十 果胶的测定.37 实验十一 总灰分的测定.37 实验十二 纤维素测定.40 实验十三 食品中还原糖的测定方法.41 实验十四 食品中蔗糖的测定.42 实验十五 pH值的测定.43 实验十六 可溶性蛋白质的测定(考马斯亮蓝法).44 实验十七 食品中山梨酸、苯甲酸的测定方法.47 实验十八 肉制品中食盐的测定 2第一部分 样品预处理方法 实验一 湿法消化实验【实验目的】用湿法消化前处理测定蛋白质样品【实验原理】加入强氧化剂（如浓硝酸、高氯酸、高锰酸钾等），使蛋白质样品消化，而被测定含氮物质呈离子状态保存在溶液中。【实验试剂】硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸（所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制）【实验步骤】（1）精密称取 2.0g 玉米粉样品，移入干燥的消化管中。（2）加入 0.2g 硫酸铜，3g 硫酸钾及 20m1 浓硫酸（或直接加入消化片 1 片）。（3）将消化管分别放入消化架的孔内，置于消化炉上。（4）接好排污管，打开抽气三通，使之处于吸气状态（注意三通接法）。（5）再接电源，打开各控制开关，使其消化。（6）在初始阶段，须注意观察防止试样飞溅（缓解方法可在消化至飞溅时关机 5 分钟，再开机继续加热）。（7）至液体呈蓝绿色澄清透明后（加消化片的液体最后呈无色），再继续消化 15min。【注意事项】（1）消化不要用强火，应保持和缓沸腾，利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全。（2）样品中若含有脂肪或糖较多时，消化过程易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并不断摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。（3）若样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，缓缓加入 30%过氧化氢 23ml 后再继续加热。实验二 蒸馏实验【实验目的】用蒸馏法测定水分含量【实验原理】两种互不溶解的液体的二元体系的沸点低于各组分的沸点，加入与水互不混合的试剂于样品中，使水分与试剂共同蒸出，由水分的容量而得到样品的水分含量。【实验试剂】甲苯或二甲苯【实验步骤】（1）准确称取 2.005.00g 香料于 250ml 的烧瓶中。（2）加入 5075ml 的甲苯浸没样品。（3）连接蒸馏装置。（4）从冷凝管顶加入试剂（甲苯或二甲苯），使装满接受器的刻度为止。（5）徐徐加热蒸馏，使水分大部分蒸出后，加快蒸馏速度。（6）当接受器刻度的水量不再增加，关闭热源。（7）从冷凝管顶端注入少量甲苯洗净，使蒸馏器和冷凝管壁上没有水滴。（8）读取刻度管中的水量。33、计算 100wv 水分（%）=式中 v-刻度管中水层的容量（ml）W-样品的重量（g）实验三 色层分离实验【实验目的】用柱层析和薄层层析法从番茄中提取番茄红素和胡萝卜素。【实验原理】类胡萝卜素为多烯类色素，不溶于水而溶于脂溶性有机溶剂。本实验先用乙醇将番茄中的水脱去，再用二氯甲烷萃取类胡萝卜素。因为二氯甲烷不与水混溶，故只有除去水分后才能有效地从组织中萃取出类胡萝卜素。根据番茄红素与-胡萝卜素极性的差别，用柱层析可以将它们分离。分离效果可以用薄层层析进行检验。【实验步骤】1、实验材料和试剂（1）新鲜番茄（或番茄酱）。（2）95%乙醇；二氯甲烷；石油醚（6090）；氯仿；中性或酸性氧化铝（柱层析用）；环已烷；硅胶 G；饱和氯化钠溶液；无水硫酸钠。1、操作方法（1）原料处理与色素提取 称取新鲜番茄浆 20g 于 100ml 圆底烧瓶中，加 95%乙醇 40ml，摇匀，装上回流冷凝管，在水浴上加热回流 5 分钟，趁热抽滤，滤液备用。向圆底烧瓶内，加入 30ml 二氯甲烷，水浴上加热回流 5分钟，冷却，滤液备用，向圆底烧瓶内，再加 10ml 二氯甲烷重复萃取一次。合并乙醇和两次二氯甲烷提取液，倒入分液漏斗中，加 5ml 饱和氯化钠溶液（有利分层），振摇，静置分层。分出橙黄色有机相，使其流经一个在颈部塞有疏松棉花且在棉花上铺一层 1cm 厚的无水硫酸钠的三角漏斗，以除去微量水份。将此溶液储存于干燥的有塞子的锥形瓶中。层析之前，将此溶液在通风橱中用热水浴蒸发至干。（2）柱层析分离 取一支长 15cm 左右内径为 11.2cm 的层析柱，柱内装有用石油醚调制的氧化铝。将粗制的类胡萝卜素溶解于 4ml 苯中，用滴管在氧化铝表面附近沿柱壁缓缓加入柱中（留 1-2 滴供以后的薄层层析用），打开活塞，至有色物料在柱顶刚流干时即关闭活塞。用滴管取几毫升石油醚，沿柱壁洗下色素，并通过放出溶剂至柱顶刚流干，从而使色素吸附在柱上。然后加大量的石油醚洗脱。黄色的-胡萝卜素在柱中移动较快，红色的番茄红素移动较慢。收集洗脱液至黄色的-胡萝卜素从柱上完全除去，然后用极性较大的氯仿作洗脱剂洗脱番茄红素（注意更换接收瓶）。将收集到的两个部分在通风橱内用热水浴蒸发至干。将样品分别溶于尽可能少的二氯甲烷中，尽快进行薄层层析。（3）薄层层析检验 在用硅胶G铺成的薄板上距离底边约 1cm处，分别用毛细管点上三个样品，中间点为未分离的混合物，两边分别点上分离得到的-胡萝卜素和番茄红素。可以多次点样，即点完一次，待溶剂挥发后再在原来的位置上点样。但要注意，必须在同一位置上点，而且样品斑点尽量小。点样时毛细管只要轻轻接触板面即可，切不可划破硅胶层。样品之间的距离为 1-1.5cm。将此板放入装有环已烷作展开剂的层析缸中，盖上盖子。切勿让展开剂浸没样品斑点。待溶剂展开至 10cm左右时，取出层析板。因斑点会氧化而迅速消失，故要用铅笔立即圈出。计算不同样品的Rf值，比较不同样品Rf值大小的原因以及分离效果。4 溶质最高浓度中心至原点中心的距离 Rf=溶剂前沿至原点中心的距离（4）注意 1、新鲜番茄浆的制备：将新鲜番茄洗净，用捣碎机捣碎或用市售的番茄酱。2、氧化铝层析柱的装填方法：将层析柱垂直固定于铁架上，铺上一层薄薄的石英砂，关闭活塞。称取 15g 氧化铝置于 50ml 锥形瓶中，加入 15ml 石油醚（顺序不能反）边加边搅，且不断旋摇直至成均匀浆液（稠厚但能流动），向柱内加入溶剂（石油醚）至半满，然后开启活塞让溶剂以每秒一滴的速度流入小锥形瓶中，摇动浆液，不断地逐渐倾入正在流出溶剂的柱子中，不断用木棒或带橡皮管的玻璃棒轻轻敲击柱身，使顶部成水面，将收集到的溶剂在柱内反复循环几次，以保证沉降完全和装紧柱。整个过程不能让柱流干。待溶剂刚好放至柱顶刚变干时即可上样。3、硅胶 G 薄层板的制备。将 4g 硅胶 G 置于一小烧杯中，加入 8ml 蒸馏水不断搅拌至浆糊状，倾倒在洗净的玻板上（186cm），流平，或用涂布器铺板，并轻轻敲打均匀，在室温放置半小时凉干，然后移入烘箱，缓慢升温至 105-110恒温活化半小时，取出放入干燥器中备用。5第二部分 实验数据处理基础知识 一、数据取舍 wxx12Q-试验：Q=式中：X1为可疑值，X2为最接近X1的那一个值，W为一组值中最大与最小的差值。表 2-6 结合取舍的 Q 值表 观察数目 Q 值舍取（90%水平）3 0.94 4 0.76 5 0.64 6 0.56 7 0.51 8 0.47 9 0.44 10 0.41 Q-试验就是拿 Q 值与表中的数据比较，如果计算值大于表中的值，则可以舍弃该值，这时置信水平为 90%。例如：测定汉堡包的水分含量，平行做了 4 次，数据分别为 64.53、64.45、64.78、55.31，明显 55.31 看起来很低，但能否舍弃呢？X1=55.31 X2=64.45 W=64.78-55.31 则 Q=0.96，通过查表：0.96 大于 0.76，这样可以舍弃这个值。二、有效数据处理 有效数据处理是分析中一个重要的问题。处理不好，直接影响分析结果的正确性。正确的有效数字将给出分析结果的灵敏度和可靠性，因此，实验报告应保留一个有效数字。例如，一个多位数字58.97，前几位 58.9 应该是真实值，最后一位不确定。原则上说，我们得到的一个有效数字，这个数字与小数点的位置是无关的。真实值可以包括若干个 0。关于 0 是否为有效数字，应遵循以下原则：1、小数点后面的 0 通常是有效数字：如 56.90 2、小数点前面的 0 如果没有其他的数，这个 0 就不是有效数字。0.45 3、如果小数点前面没有数字，那么紧接小数点后面的数字就不是有效数字，如 0.0072，有效数字是两个。而 1.0043，有效数字是 5 个。4、除非特别指出，最后的 0 不是有效数字，如 60000，一位有效数字，但 6000.0，是 5位有效数字。5、无法用上述原则判断，可以将该数字写成幂的形式，如果 0 可以省略，就不是有效数字，如 7000 可写成 7103的形式，一位有效数字，但 7000.0 写成 7.0000103 ，因此是 5 位有效数字 6、计算过程中有效数字判断最简单的办法是在完成计算后根据算式中位数最少的有效数字来确定。如 36.542381.1=9566.172，因为 1.1 是 2 位有效数字，因此结果报告为 9600。但当加法和减法中带有小数点的数，最后结果由小数点后面最少那个数的位数决定。如 7.45+8.635=16.175，因为 7.45 小数点后有两位，因此，16.175 应写成 16.18。6二、实验结果的科学表示 1、平均值 X=（X1+X2+X3+X +Xn）/n 式中：X 为平均值 X1、X2、X3、Xn为单个测量值 n 为测定次数 2、标准偏差 SD=（X-X1）2+（X-X2）2+、+（X-Xn）2 3、置信度 nSDtXCI+=t 值：n=2，t=12.70 n=3，t=4.30 n=4，t=3.18 n=5，t=2.78 nSDtX4、可信程度：95%，在 95%的可信区间内，真实值在之间 7第三部分 食品化学实验第三部分 食品化学实验实验一 淀粉糊化及酶法制备淀粉糖浆及其葡萄糖值的测定【实验原理及目的】淀粉可用酶法、酸法和酸酶法使淀粉水解成糊精、低聚糖和葡萄糖。淀粉糖浆或称液体葡萄糖（DE3842），主要成分是葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖和糊精，是一种粘稠液体，甜味温和，极易为人体直接吸收，在饼干，糖果生产上广为应用。双酶法水解淀粉制淀粉糖浆，是先以-淀粉酶使淀粉中的-1,4 糖甙键水解生成小分子糊精、低聚糖和少量葡萄糖然后再用糖化酶将糊精、低聚糖中的-1,6 糖甙键和-1,4 糖甙键切断，最后生成葡萄糖。淀粉糖浆的分析方法是根据国家标准 GB12099-89，采用菲林滴定法测定淀粉水解产品的葡萄糖值（DE），例如 DE 值为 42，表示淀粉糖浆中含 42%的葡萄糖。本实验的目的（1）通过实验，了解淀粉糊化及酶法制备淀粉糖浆的基本原理。（2）掌握淀粉双酶法制备淀粉糖浆的实验方法，以及酶的使用。（3）熟悉淀粉水解产品的葡萄糖值测定方法。【实验材料、试剂与仪器】材料：马铃薯淀粉。试剂：液化型-淀粉酶（酶活力 6000 单位/g），糖化酶（酶活力为 45 万单位/g），菲林溶液 A、B，亚甲基兰指示剂，D-葡萄糖标准溶液。（1）碱性酒石酸铜甲液：称取 15g硫酸铜(CuS045H2O)及 0.05g亚甲基蓝，溶于水中并稀释至1000ml。（2）碱性酒石酸铜乙液：称取 50g 酒石酸钾钠及 75g 氢氧化钠，溶于水中，再加入 4g 亚铁氰化钾，完全溶解后，用水稀释至 1000ml，贮存于橡胶塞玻璃瓶内。（5）葡萄糖标准溶液：精密称取 l.000g 经过 98100干燥至恒量的纯葡萄糖，加水溶解后加入 5ml 盐酸，并以水稀释至 1000ml。此溶液每毫升相当于 1mg 葡萄糖。仪器：150ml 锥形瓶，容量瓶（100ml），移液管（1ml,5ml,20ml），25ml 酸滴定管，100ml量筒，搅拌棒，恒温水浴锅。【实验步骤】1、淀粉糖浆的制备 10g 淀粉置于 150ml 锥形瓶中，加水 50ml，搅拌均匀，配成淀粉浆，于 80水浴上加热，并不断搅拌，淀粉浆由开始糊化直到完全成糊，呈透明状，加入液化型-淀粉酶 8mg(先溶于 15ml 蒸馏水中，再倒入糊化的淀粉中),不断搅拌使其液化。并使温度保持在 80（水浴）温度，搅拌 20 分钟，然后将锥形瓶移至电炉（隔石棉网）加热至沸，灭酶活 2min，4000rpm 离心 10min，滤液冷却至 55，加入糖化酶 25mg，于 65恒温水浴中糖化 40min，加热至沸，沸腾灭酶 2min，即为淀粉糖浆,冷却后测定其体积为 V。冷却后再取 2ml，定容到 100ml（即稀释 50 倍），作为样品液待用。2、DE 值的测定（1）标定碱性酒石酸铜溶液：吸取 5.0ml 碱性酒石酸铜甲液及 5.0ml 乙液，置于 150ml 锥形瓶中，加水 l0ml,从滴定管滴加约 9ml 葡萄糖标准溶液，放置在电炉上，控制在 2min 内加热至沸，在电炉上趁沸以每两秒 l 滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积，同时平行操作三份，取其平均值，计算每10ml(甲、乙液各 5m1)碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量(mg)(样品始终放在电炉上 8沸腾滴定)。（2）样品溶液预测：吸取 5.0ml 碱性酒石酸铜甲液及 5.0ml 乙液，置于 150ml 锥形瓶中，加水10ml，在电炉上控制在 2min 内加热至沸，在电炉上趁沸以先快后慢的速度，从滴定管中滴加样品溶液，并保持溶液沸腾状态，待溶液颜色变浅时，以每两秒 1 滴的速度滴定，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录样液消耗体积(样品始终放在电炉上沸腾滴定)。（3）样品溶液测定：吸取 5.0ml 碱性酒石酸铜甲液及 5.0ml 乙液，置于 150ml 锥形瓶中，加水10ml，从滴定管滴加比预测体积少 1ml 的样品溶液，使在两分钟内加热至沸，趁沸继续以每两秒 1 滴的速度滴定，直至蓝色刚好褪去为终点，记录样液消耗体积，同法平行操作三份，得出平均消耗体积。(样品始终放在电炉上沸腾滴定)1000100121=VmNVVDE 式中：DE样品中葡萄糖的含量，；11ml 葡萄糖标准液相当于 1mg 葡萄糖，mg/ml V1标定碱性酒石酸铜溶液平均消耗葡萄糖标准液的体积，ml；V2测定时平均消耗样品液的体积，m1；V糖化后样品液的体积,ml;N稀释倍数（50）；m样品质量，g【思考题】为什么在测定 DE 值的整个滴定过程中，要保持沸腾，蒸汽始终充满烧瓶？实验二 脂肪过氧化值、酸价的测定(滴定法)【实验原理及目的】实验原理：脂肪氧化的初级产物是氢过氧化物 ROOH，因此通过测定脂肪中氢过氧化物的量，可以评价脂肪的氧化程度。同时脂肪氧化的初级产物 ROOH 可进步分解，产生小分子的醛、酮、酸等，因此酸价也是评价脂肪变质程度的一个重要指标。本实验通过油脂在不同条件下贮藏，并定期测定其过氧化值和酸价，了解影响油脂氧化的主要因素。实验中过氧化值的测定采用碘量法，即在酸性条件下，脂肪中的过氧化值与过量的KI反应生成I2，用Na2S2O3滴定生成的I2，求出 1 千克油中所含过氧化物的毫摩尔数，称为脂肪的过氧化值(POV)；酸价的测定是利用酸碱中和反应，测出脂肪中游离酸的含量。油脂的酸价以中和 1g脂肪中游离酸所需消耗的氢氧化钾或氢氧化钠的毫克数表示。实验目的：（1）测定油脂的过氧化值 （2）测定油脂的酸价【实验材料与试剂】(一)材料 油脂(二)实验试剂 1.0.0lmoLL 硫代硫酸钠（Na2S2O3）:称取 2.6gNa2S2O3和 0.02g碳酸钠，加适量新煮沸过的冷水溶解，并稀释至 1000 mL，放置一个月后过滤备用。2.氯仿-冰乙酸混合液：取氯仿 40mL 加冰乙酸 60mL，混匀。3.饱和碘化钾溶液：取碘化钾 14g，加水 10mL，稍加热溶解，贮于棕色瓶中，如发现溶液变黄，应重新配制。4.0.5淀粉指示剂：500mg 淀粉加少量冷水调匀，再加一定量热水煮沸，冷却(最后体积约为 9100mL),现用现配。5.0.01moL/L NaOH（或 KOH）标准溶液：0.4g NaOH 稀释至 1000mL。6中性乙醚-95%乙醇（2:1）混合溶剂：临用前用 0.1moL/L 碱液滴定至中性。71%酚酞乙醇溶液。【实验步骤】1、过氧化值的测定：称取 2g(准至 0.01g)油脂置于干燥的 250mL碘量瓶中，加入 20mL氯仿-冰乙酸混合液，轻轻摇动使油溶解，加入 1mL饱和碘化钾溶液，摇匀，加塞，置暗处放置 5min。取出立即加水 50mL，充分摇匀，用 0.0lmolL Na2S2O3滴定至水层呈淡黄，加入 1mL淀粉指示剂，继续滴定至蓝色消失，记下体积V。2、酸价的测定：称取油脂 2g(准确至 0.01g)于 250mL 的锥形瓶中,加入中性乙醚-乙醇混合液 25mL,小心旋转摇动烧瓶使试样溶解,加 3 滴酚酞指示剂,用 0.01moL/L 的碱液滴定至出现微红色在 30s 不消失,记下消耗碱液毫升数(V)。【结果计算】1、过氧化值()油kgmmolWVMPOV/1000=式中：MNa2S2O3溶液摩尔浓度(mol/L)V消耗Na2S2O3溶液体积(m1)W称取油脂重量(g)2、酸价 WVM40 酸价（mg NaOH/g 油）=式中：M NaOH 的摩尔浓度 V 消耗 NaOH 溶液的体积（mL）40 NaOH 的毫摩尔 W 称取油脂重量(g)【注意事项】1、滴定过氧化值时,应充分摇匀溶液,以保证I2被萃取至水相中。2、1%酚酞乙醇溶液在酸性条件下是无色，在碱性条件下是红色 实验三 蛋白质的功能性质【实验原理及目的】蛋白质的功能性质一般是指能使蛋白质成为人们所需要的食品特征而具有的物理化学性质，即对食品的加工、贮藏、销售过程中发生作用的那些性质。蛋白质的功能性质可分为水合性质，表面性质、蛋白质蛋白质相互作用的有关性质三个主要类型，主要包括有吸水性、溶解性、乳化性、起泡性、凝胶作用等。本实验的目的：以卵蛋白、大豆蛋白为代表，通过一些定性试验了解（1）蛋白质的水溶性（2）蛋白质的乳化性（3）蛋白质的起泡性（4）蛋白质的凝胶作用 10【实验材料】2%蛋清蛋白溶液（取 2g 蛋清加 98g 蒸馏水稀释，过滤取清液）、卵黄蛋白（鸡蛋除蛋清后剩下的蛋黄捣碎）、分离大豆蛋白粉。【实验试剂】1M 盐酸、1M 氢氧化钠、饱和氯化钠溶液、饱和硫酸铵溶液、酒石酸、硫酸铵、氯化钠、葡萄糖酸内酯、氯化钙饱和溶液、水溶性红色素、明胶。【实验步骤】1、蛋白质的水溶性（1）在 50ml 的小烧杯中加入 5 滴蛋清蛋白，加入 5ml 水，摇匀，观察其水溶性，有无沉淀产生。在溶液中逐滴加入饱和氯化钠溶液，摇匀，得到澄清的蛋白质的氯化钠溶液。取上述蛋白质的氯化钠溶液 3ml，加入 3ml 饱和的硫酸铵溶液，观察球蛋白的沉淀析出，再加入粉末硫酸铵至饱和，摇匀，观察清蛋白从溶液中析出，解释蛋清蛋白在水中及氯化钠溶液中的溶解度以及蛋白质沉淀的原因。（2）在四个试管中各加入 0.1g 大豆分离蛋白粉，分别加入 5ml 水，5ml 饱和食盐水，5ml 的 1M 氢氧化钠溶液，5ml 的 1M 盐酸溶液，摇匀，在温水浴中温热片刻，观察大豆蛋白在不同溶液中的溶解度。在第一、第二支试管中加入饱和硫酸铵溶液 3ml，析出大豆球蛋白沉淀。第三、四支试管中分别用 1M 盐酸及 1M 氢氧化钠中和至 pH 44.5（用 pH 试纸检测，观察沉淀的生成，解释大豆蛋白的溶解性以及 pH 值对大豆蛋白溶解性的影响。2、蛋白质的乳化性（1）取 5g 卵黄蛋白加入 250ml 的烧杯中，加入 95ml 水，0.5g 氯化钠，用电动搅拌器搅匀后，在不断搅拌下滴加植物油 10ml，滴加完后，强烈搅拌 5 分钟使其分散成均匀的乳状液，静置 10 分钟，待泡沫大部分消除后，取出 10ml，加入少量水溶性红色素染色，不断搅拌直至染色均匀，取一滴乳状液在显微镜下仔细观察，被染色部分为水相，未被染色部分为油相，根据显微镜下观察所得到的染料分布，确定该乳状液是属于水包油型还是油包水型并阐述现象。（2）配制 5%的大豆分离蛋白溶液 100ml，加 0.5g 氯化钠，在水浴上温热搅拌均匀，同上法加 10ml植物油进行乳化。静止 10 分钟后，观察其乳状液的稳定性，同样在显微镜下观察乳状液的类型，确定该乳状液是属于水包油型还是油包水型并阐述现象。3、蛋白质的起泡性（1）在三个 250ml 的烧杯中各加入 2%的蛋清蛋白溶液 50ml，一份用电动搅拌器连续搅拌 1-2 分钟；一份用玻棒不断搅打 1-2 分钟；另一份用玻管不断鼓入空气泡 1-2 分钟，观察泡沫的生成，估计泡沫的多少及泡沫稳定时间的长短。评价不同的搅打方式对蛋白质起泡性的影响并阐述现象。（2）取二个 250ml 的烧杯各加入 2%的蛋清蛋白溶液 50ml，1 份放入冷水或冰箱中冷至 10，1 份保持常温（3035），同时以相同的方式搅打 1-2 分钟，观察泡沫产生的数量及泡沫稳定性有何不同并阐述现象。（3）取三个 250ml 烧杯各加入 2%蛋清蛋白溶液 50ml，其中一份加入酒石酸 0.5g，一份加入氯化钠0.1g，以相同的方式搅拌 1-2 分钟，观察泡沫产生的多少及泡沫稳定性有何不同并阐述现象。用 2%的大豆蛋白溶液进行以上的同样实验，比较蛋清蛋白与大豆蛋白的起泡性。4、蛋白质的凝胶作用（1）在试管中取 1ml 蛋清蛋白，加 1ml 水和几滴饱和食盐水至溶解澄清，放入沸水浴中，加热片刻观察凝胶的形成并阐述现象。（2）在 100ml 烧杯中加入 2g 大豆分离蛋白粉，40ml 水，在沸水浴中加热不断搅拌均匀，稍冷，将其分成二份，一份加入 5 滴饱和氯化钙，另一份加入 0.1-0.2g 葡萄糖酸内酯，放置温水浴中数分钟，观察凝胶的生成并阐述现象。（3）在试管中加入 0.5g 明胶，5ml 水，水浴中温热溶解形成粘稠溶液，冷后，观察凝胶的生成。11解释在不同情况下凝胶形成的原因。实验四 番茄红素直接测定法 【实验原理】从水果蔬菜及其加工制品中提取类胡萝卜素时，先使用甲醇使试样脱水的同时，可以把叶黄素和胡萝卜素提取出来。提取的残留物用甲苯反复提取，番茄红素即可完全提取出来。适用于胡萝卜、玉米、番茄、西瓜、柑橘等水果蔬菜及其加工制品中番茄红素的测定。【仪器和装置】瓷研钵、均质器、溶剂过滤器、棕色容量瓶、刻度吸管、烧杯、玻璃棒、可见光分光光度计。【试剂】甲醇、甲苯、苏丹 I 号色素、无水乙醇【实验操作】1、制作标准曲线 准确称取标准苏丹 I 号色素 25.0 mg 溶于无水乙醇，定容至 50 mL，移取 0.26、0.52、0.78、1.04、1.30 mL 该溶液，分别注入 50 mL 容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度。混合后即相当于 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5g/mL 番茄红素的苏丹 I 号色素标准溶液，然后，用分光光度计在番茄红素最大吸收波长处(465 nm 左右)分别测定其消光值，测定光压 10V，光径 1cm。以番茄红素每毫升微克数为横坐标,以消光值为纵坐标，绘制番茄红素标准曲线。2、样品中番茄红素的抽提 称取一定量的番茄汁(精确到 0.01g)，注入小烧杯中，加入少量甲醇，用玻璃棒充分搅拌，以抽出其黄色素。再将该番茄汁移入溶剂过滤器中抽滤，并用少量甲醇洗涤烧杯。接着加甲醇于玻璃滤器中搅拌后抽滤，重复此操作，直至滤液无色为止。然后，另换一干燥抽滤瓶接受滤液，用甲苯重复上述操作抽提番茄红素，直到滤液无色为止。将抽提液移入 100mL 棕色容量瓶中，加甲苯定容、混合。吸取该溶液 1mL，加甲苯稀释至 20 mL，即为色素抽提液。3、样品中番茄红素的测定 将上述处理好的色素抽提液用分光光度计在与制作标准曲线相同的条件下，测其消光值，以蒸馏水作空白对照。经查标准曲线可知番茄红素含量，通过稀释倍数的折算可知样品中番茄红素的含量。实验五 酚酶提取及活力测定 【实验目的】从香蕉中提取酚酶并测定其活力【实验原理】儿茶酚在酚酶作用下发生氧化还原，生成的产物在 420nm 处有吸收，根据生成物的多少，判断酚酶的活力，【实验材料和试剂】香蕉、pH7.0 的 0.02M 的磷酸缓冲液、-15的冷丙酮、吐温 80、0.1M 儿茶酚溶液【实验步骤】（1）多酚氧化酶提取：a、取 100g 香蕉果肉，与 pH7.0 的 0.02M 的磷酸缓冲液混合,组织捣碎机混合（1000rpm,3min)b、然后冷冻离心(-4、18000rpm,15min),取上清液 1 c、沉淀再用与上述相同的方法处理，冷冻离心后，取上清液 2，清液 1 和 2 混合 d、缓慢加入-15的冷丙酮，搅拌，保持 15min，冷冻离心 e、取沉淀再与含 1%的吐温 80 的 pH7.0 的 0.02M 的磷酸缓冲液混合(1000rpm,3min)，冷冻离心 15min，12取上清液，即是多酚氧化酶。（2）酚酶活力测定：a、配置 0.1M 儿茶酚溶液,取 2ml,加 20l 的上述提取的酶液 b、25条件下,每隔 10s,测定在 420nm 下的吸光值 A,空白用蒸馏水代替酶液【计算方法】酶活力用每分钟吸光值 A 的变化表示，规定每分钟吸光值 A 变化 0.001 为一个活力单位。10006010112=AAu 实验六 脂溶性维生素的测定 一、维生素 A 的测定（一）三氯化锑比色法测定维生素 A 【原理】维生素 A 在三氯甲烷溶液中与三氯化锑作用，生成蓝色可溶性络合物，其深浅与溶液中所含维生素 A 的含量成正比。该蓝色物质在 620 nm 波长处有最大吸收峰，可进行比色测定。【试剂】无水硫酸钠。乙酸酐。无水乙醚：不含有过氧化物。A过氧化物检查方法：5mL 乙醚中加入 100gL 碘化钾溶液 1mL，振摇 1min，如有过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色，或加 4 滴 5gL 淀粉液，水层呈蓝色。该乙醚需处理后使用。B去除过氧化物的方法：重蒸乙醚时，瓶中放入纯铁丝或铁末少许。弃去 10初馏液和 10残馏液。无水乙醇：不得含有醛类物质。A检查方法：取 2mL 银氨溶液于试管中，加入少量乙醇，播匀，再加入 100g/L 氢氧化钠溶液，加热，放冷后，若有银镜反应则表示乙醇中有醛。B脱醛方法：取 2g 硝酸银，溶于少量水中。取 4g 氢氧化钠溶于温乙醇中。将两者倾入 1L 乙醇中，振摇后，放置暗处 2d（不时摇动，促进反应），经过滤，置蒸馏瓶中蒸馏，弃去初蒸出的 50mL。当乙醇中含醛较多时，硝酸银用量适当增加。三氯甲烷：应不含分解物，否则会破坏维生素 A。A检查方法：三氯甲烷不稳定，放置后易受空气中氧的作用生成氯化氢和光气。检查时可取少量三氯甲烷置试管中加水少许振摇，使氯化氢溶到水层。加入几滴硝酸银溶液，如有白色沉淀即说明三氯甲烷中有分解产物。B处理方法：试剂应先检验是否含有分解产物，如有，则应于分液漏斗中加水洗数次，加无水硫酸钠或氯化钙使之脱水，然后蒸馏。三氯化锑-氮甲烷溶液：250g 三氯化锑用三氯甲烷溶解，并用三氯甲烷定容至 1L，贮于棕色瓶内。1:1 氢氧化钾溶液：取 50g 氢氧化钾，用 50mL 水溶解。维生素 A 或视黄醇乙酸酯标准液：视黄醇(纯度 85)或视黄醇乙酸酯(纯度 90)经皂化处理后使用。用脱醛乙醇溶解维生素 A 标准品，使其浓度大约为 1mL 相当于 1mg 视黄醇。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度。标定方法见维生素 A 和维生素 E 的高效液相色谱法相关内容。酚酞指示剂：用 95乙醇配制成 10g/L 溶液。13【仪器】分光光度计。回流冷凝装置。【操作方法】样品处理：根据样品性质，可采用皂化法或研磨法。A.皂化法：适用于维生素 A 含量不高的样品，可减少脂溶性物质的干扰，但全部试验过程费时，且易导致维生素 A 损失。皂化：称取 0.55g 样品于三角瓶中，加入 500gL 氢氧化钾 10 mL 及 2040mL 乙醇，于电热板上回流 30min，至皂化完全为止。提取：将皂化瓶内混合物移至分液漏斗中，用 30mL 水洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗(如皂化液中有残渣，可经有脱脂棉的漏斗滤入分液漏斗内)。用 50mL 乙醚分 2 次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。振摇并注意放气，静置分层后，水层放入第二个分液漏斗内。皂化瓶再用约 30mL 乙醚分 2 次冲洗，洗液倾入第二个分液漏斗中。振摇后，静置分层，水层放入三角瓶中，醚层与第一个分液漏斗合并。重复至水液中无维生素 A 为止。洗涤：用约 30mL 水加入第一个分液漏斗中，轻轻振摇，静置片刻后，放去水层。加 0.5 mol/L氢氧化钾液 1520mL 于分液漏斗中，轻轻振摇后。弃去下层碱液，除去醚溶性酸皂。继续用水洗涤，每次用水约 30mL，直至洗涤液与酚酞指示剂呈无色为止(约 3 次)。醚层液静置 1020min，小心放出水层。浓缩：将醚层液经过无水硫酸钠滤入三角瓶中，再用约 25 mL 乙醚冲洗分液漏斗和硫酸钠两次，洗液并入三角瓶内。置水浴上蒸馏，回收乙醚。待瓶中剩约 5 mL 乙醚时取下，用减压抽气法至干，立即加入一定量的三氯甲烷使样液中维生素 A 含量在适宜浓度范围内。B研磨法：准确称取 25g 样品，放入盛有 35 倍样品质量的无水硫酸钠研钵中，研磨至样品中水分完全校吸收，并均质化，样品移入带盖的三角瓶内，加入 50100mL 乙醚，紧压盖子，用力振摇 2min，使样品中维生素 A 溶于乙醚中。静置澄清 1-2 h，或在冷水浴中离心澄清。取澄清乙醚液 25mL，放入比色管中，在 7080水浴上抽气蒸干，立即加入 1mL 三氯甲烷溶解残渣。测定：A，标准曲线绘制：准确称取一定量的维生素 A 标准液于 4 或 5 个容量瓶中，用三氯甲烷配制标准系列。再取相同数量比色管顺次取 lmL 三氧甲烷和标准系列使用液 1mL，各管加入乙酸酐 1 滴，制成标准比色列。于 620nm 波长处，以三氯甲烷作参比，将其他标准比色列按顺序移入光路前，迅速加入 9mL 三氯化锑-三氯甲烷溶液，于 6s 内测定吸光度。以吸光度为纵坐标，维生素 A 含量为横坐标绘制标准曲线图。样品测定：于一比色管中加入 10mL 三氯甲烷，加入 1 滴乙酸酐为空白液。另一比色管中加入 1mL三氯甲烷，其余比色管中分别加入 1mL 样品溶液及 1 滴乙酸酐。其余步骤同标准曲线的制备。【计算】1000100=VmcX 式中：X-样品中含维生素 A 的量，mg100 g；c-由标准曲线上查得样品中维生素 A 的含量，gmL；m-样品质量，g；V-提取后加三氯甲烷定容的体积，mL；100-以每 100 g 样品计。(二)荧光分析法【提要】样品经乙醚提取后，以薄层层析分离出样品中的维生素 A，其斑点溶于正丁醇中，用 14荧光分光法进行测定，求出样品中的维生素 A本法适用于动物组织中维生素 A 的测定。【试剂】无水硅酸钠、乙醚及氯仿、层析用硅胶、环己烷及石油醚。维生素 A 标准溶液：维生素 A 或视黄醇乙酸酯标准液：视黄醇(纯度 85)或视黄醇乙酸酯(纯度 90)经皂化处理后使用。用脱醛乙醇溶解维生素 A 标准品，使其浓度大约为 1mL 相当于 1mg 视黄醇。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度。标定方法见维生素 A 和维生素 E 的高效液相色谱法相关内容。【仪器】荧光分光光度计具有 340 nm 和 490 nm 波长、硅胶薄层板。【操作方法】(1)样品处理：称取含有维生素 A 约为 1g 的动物组织样品，用 4 倍重量的无水硅酸钠研磨后置于有色玻璃试管中，按每克样品中加入 20mL 乙醚，振摇提取，在低温下于高速离心机中离心 20min。将上清液转入另一试管中，以无水硫酸钠去除水分，再将有机相定量地转入另一试管中，通氮气或用真空挥发除去乙醚，残渣溶解于少量的氯仿中，取一定量的氯仿进行薄层层析分离。(2)薄层板制备：称取 38g 硅胶，加入 100mL 水，迅速搅拌 15min，调成糊状，再铺于一块 2020 cm的玻璃板上，厚度为 0.25mm，将其置于空气中干燥 20min，然后在 90下加热活化 1h，冷却后备用。(3)层析：用微量移液管移取上述样品氯仿液，点板于离层析板下沿 2cm 的位置上，然后将层析板置于密闭的层析槽中，用环己烷：石油醚：乙醚：=7:3:1(v/v)的混合液作为展开剂，置暗处展层50min。显层后在紫外线灯光下找出维生素 A 的斑点，连同硅胶一起从板上刮下，置于玻璃试管中，加入 5mL 正丁醇，振摇 2min，离心分离硅胶，取上层清液为样品测定液。(4)样品测定：先用硫酸奎宁溶液用 0.1N 硅酸溶液制备成每毫升含有硫酸奎宁 0.30.6g(视荧光计灵敏度而定)校正荧光计，然后取上层样品离心清液置于荧光比色皿中，于 340nm 处激发波长，在 490nm 处测定其荧光强度。同样取一定量的维生素 A 标准浓度系列在同样条件下进行测定，并绘制维生素 A 的标堆曲线。测得样液中荧光强度，从标准曲线中查出维生素 A 的含量【计算】WCVV10021每 100 g 动物组织中含维生素 A 的量=式中 C-从标准曲线中查得的维生素 A 的浓度(I.U.mL)，V1-用正丁醇定容的量(m L)，V2-样品测定时所取样液的量(mi)，W-样品的重量(g)。二、维生素 A 和维生素 E 的高效液相色谱法【原理】样品中的维生素A及维生素E经皂化提取处理后，将其从不可皂化部分提取至有机溶剂中。用高效液相色谱法C18反相柱将维生素A和维生素E分离，经紫外检测器检测，并用内标法定量测定。最小检出量分别为维生素A是 0.8 ng；-生育酚是 91.8 ng；-生育酚是 36.6 ng；-生育酚是20.6 ng。【试剂】1、无水乙醚：不含有过氧化物。检测方法和去除方法见三氯化锑比色法测定维生素 A。2、无水乙醇：不得含有醛类物质。检测方法和去除方法见三氯化锑比色法测定维生素 A。3、无水硫酸钠。4、甲醇：重蒸后使用。5、重蒸水：水中加少量高锰酸钾，临用前蒸馏。156、100g/L 抗坏血酸溶液：临用前进行配制。7、50氢氧化钾溶液：取 50g 氢氧化钾，溶于 50g 水中，混匀。8、100g/L 氢氧化钠溶液：100g 氢氧化钠，用水溶解并定容至 1L。9、50g/L 硝酸银溶液。10、银氨溶液：加氨水至 50 mL 硝酸银溶液中，直至生成的沉淀重新溶解为止，再加 100g/L 氢氧化钠溶液数滴，如发生沉淀，再加氨水直至溶解。11、维生素 A 标准液：视黄醇(纯度 85)或视黄醇乙酸酯(纯度 90)经皂化处理后使用。用脱醛乙醇溶解维生素 A 标准品，使其大约为每毫升相当于 1mg 3 种生育酚。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度。12、维生素 E 标准液：-生育酚(纯度 95)，-生育酚(纯度 95)，-生育酚(纯度 95)，用脱醛乙醇分别溶解以上 3 种维生素 E 标准品，使其浓度大约为每毫升相当于 1mg 三种生育酚。临用前用紫外分光光度法分别标定此 3 种维生素 E 的准确浓度。13、内标溶液：称取苯并芘(纯度 98)，用脱醛乙醇配制成每毫升相当于 10g 苯并芘的内标溶液。【仪器】高效液相色谱仪(带紫外分光检测器)、旋转蒸发器、恒