细胞生物学实验细胞融合.pptx

概念概念概念概念促融合剂与融合技术促融合剂与融合技术促融合剂与融合技术促融合剂与融合技术应用与意义应用与意义应用与意义应用与意义 重点重点一一定义：定义：Cellfusionl细胞融合细胞融合：(Cellfusion)又称又称l体细胞杂交体细胞杂交（somatichybridization）是指将不同来源的原生质体是指将不同来源的原生质体(除去细胞壁的细胞除去细胞壁的细胞)相融合，相融合，将两个或多个细胞合并成将两个或多个细胞合并成一个细胞的技术。一个细胞的技术。人心肌细胞人心肌细胞人肝脏细胞人肝脏细胞种内杂交细胞种内杂交细胞人细胞人细胞鼠细胞鼠细胞种间杂交细胞种间杂交细胞在适当的条件下，细胞融合在一起，产生具有在适当的条件下，细胞融合在一起，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞（交细胞（hybridcell）。）。种内杂交细胞种内杂交细胞（intraspecific hybrid intraspecific hybrid cellcell）:同种细胞融合而成的细胞同种细胞融合而成的细胞种间杂交细胞（种间杂交细胞（interspecific hybrid interspecific hybrid cellcell）:不同种的细胞融合而成的细胞不同种的细胞融合而成的细胞非对称细胞融合（非对称细胞融合（asymmetric fusionasymmetric fusion）：）：利用物理或化学方法使某亲本细胞的核或细胞质失活后再进行融合。细胞核或细胞质失活的有物理和化学方法：细胞核或细胞质失活的有物理和化学方法：1.1.物理方法，如物理方法，如X X射线、射线、r r射线等，它们能使细胞核失活；射线等，它们能使细胞核失活；2.2.化学方法，核失活碘乙酰胺（化学方法，核失活碘乙酰胺（IOAIOA）、碘乙酸）、碘乙酸(Iodoacetate)(Iodoacetate)；质失活罗丹明（；质失活罗丹明（R R6 6G G，它是一种亲，它是一种亲脂染料，能够抑制线粒体的氧化磷酸化过程而达到失活作脂染料，能够抑制线粒体的氧化磷酸化过程而达到失活作用。用。动物克隆动物克隆上海第二医科大学上海第二医科大学陈莹博士陈莹博士2003年，她将一5岁男孩的包皮细胞与一只已去除细胞核的新西兰兔卵母细胞融合，获得了人类早期胚胎。二细胞融合的原理二细胞融合的原理n n荧光标记的小鼠细胞和人细胞融合实验荧光标记的小鼠细胞和人细胞融合实验荧光标记的小鼠细胞和人细胞融合实验荧光标记的小鼠细胞和人细胞融合实验将小鼠的抗体与发绿色荧光的荧光素(fluorescin)结合,人的抗体与发红色荧光的罗丹明(rhodamine)结合；显微镜下的细胞融合过程显微镜下的细胞融合过程细胞融合的过程细胞融合的过程细胞互相靠近细胞膜融合细胞桥形成细胞质融合细胞核融合n n细胞融合主要经过了两原生质体或细胞互细胞融合主要经过了两原生质体或细胞互相靠近、细胞桥形成、胞质渗透、细胞核相靠近、细胞桥形成、胞质渗透、细胞核融合主要步骤。融合主要步骤。细胞桥的形成是细胞融合最关键的一步细胞桥的形成是细胞融合最关键的一步，融，融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥。成细胞桥。细胞融合过程中两个细胞膜的变化细胞融合过程中两个细胞膜的变化形成细胞桥的具体变化形成细胞桥的具体变化形成细胞桥的具体变化形成细胞桥的具体变化细胞融合分为两种：细胞融合分为两种：1.自发细胞融合2.人工诱导细胞融合（1）自发细胞融合）自发细胞融合自发细胞融合（自发细胞融合（spontaneous cell spontaneous cell fusionfusion）是在）是在未施加任何诱导条件未施加任何诱导条件的情况下所的情况下所发生的细胞融合现象。发生的细胞融合现象。自发细胞融合现象在自然界中并不多见，常见的主要自发细胞融合现象在自然界中并不多见，常见的主要有以下几种情况：有以下几种情况：1.精子和卵子受精精子和卵子受精2.肌管的形成肌管的形成3.胚胎着床胚胎着床4.巨细胞的形成巨细胞的形成5.破骨细胞的形成破骨细胞的形成6.肿瘤细胞融合肿瘤细胞融合（2）诱导细胞融合）诱导细胞融合人工诱导细胞融合是在人为条件下人为条件下发生的细胞融合现象常用的诱导方法有三种：常用的诱导方法有三种：1.生物法（病毒诱导法等）生物法（病毒诱导法等）2.化学法（化学法（PEG诱导法、诱导法、Ca2+诱导法、诱导法、溶血卵磷脂诱导法等）溶血卵磷脂诱导法等）3.物理法（电诱导法等）物理法（电诱导法等）1.病毒诱导法病毒诱导法常用的病毒：仙台病毒（常用的病毒：仙台病毒（Sendal virus),又称日本血凝病毒又称日本血凝病毒n（Hemagglutinating virus of Japan,HVJ）n 属于副粘液病毒科，属于副粘液病毒科，RNA病毒，病毒，圆球形圆球形n 19621962年，日本仙台东北大学学者冈田发现仙台年，日本仙台东北大学学者冈田发现仙台病毒可诱导细胞融合。病毒可诱导细胞融合。病毒促使细胞融合病毒促使细胞融合 两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近，使两个细胞膜、胞质间互相渗透 -细胞核互相融合，进入正常的细胞分裂途径，杂种子细胞。2 2化学法（聚乙二醇）化学法（聚乙二醇）nPEG:聚乙二醇（聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）n分子式：分子式：HOCH2(CH2OCH2)nCH2OHn性状：白色蜡状固体，具有强烈的凝集、性状：白色蜡状固体，具有强烈的凝集、沉淀蛋白质的作用沉淀蛋白质的作用n 分子量分子量 1000-6000u，可作诱融剂。，可作诱融剂。20世纪世纪70年代，华裔科学家高国南发现聚乙二醇能诱导细胞融合年代，华裔科学家高国南发现聚乙二醇能诱导细胞融合n n分子量小的PEG，融合效应差，又有毒性，分子量过大，则粘性太大，不易操作。pH偏碱时融合效应最高。n n用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分子量 为 4000者，常 用 浓 度 为 50，pH8.0pH8.2聚乙二醇聚乙二醇普遍认为聚乙二醇分普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂触点处质膜的脂类分类分子发生疏散和重组，子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张和以及彼此的表面张力作用，力作用，从而使细胞从而使细胞发生融合发生融合 基本原理基本原理n n聚乙二醇聚乙二醇(PEG)是一种多聚化合物，商是一种多聚化合物，商品名卡波蜡品名卡波蜡(Carbowax)。聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）介导的细胞融合）介导的细胞融合 原理：原理：PEGPEG带有大量的负带有大量的负电荷电荷,和原生质体表面的和原生质体表面的负电荷在钙离子的连接下，负电荷在钙离子的连接下，形成静电键，促使异源的形成静电键，促使异源的原生质体间的粘着和结合，原生质体间的粘着和结合，在高在高pH,pH,高钙离子的溶液高钙离子的溶液的作用下，将钙离子和与的作用下，将钙离子和与质膜结合的质膜结合的PEGPEG分子洗脱，分子洗脱，导致电荷平衡失调并重新导致电荷平衡失调并重新分配，使两种原生质体上分配，使两种原生质体上的正负电荷连接起来，进的正负电荷连接起来，进而形成具有共同质膜的融而形成具有共同质膜的融合体。合体。融合过程中应注意事先要做好两种原生质体的识别标记，如色素、缺陷型、抗性标记等。原生质体的密度应在105个mL左右，两种原生质体按1：1等量混合。常用PEG的分子量通常为40006000，加热熔化与Eagle溶液配成50(WV)浓度(小分子质量的PEG配 成 55 浓 度)。加 入 PEG后，24培 育1020min注意时间宜短不宜长，过长，使原生质体周围包裹一层膜形成凝集体，会降低融合率)，缓缓加入高pH、高钙离子溶液15min后用冲洗液清洗，离心收集原生质体。3.物理法一电融合诱导法物理法一电融合诱导法1981年，Scheurich和Zimmermann发明了电诱导细胞融合。电融合槽电融合槽在直流电脉冲的诱导下，原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种原生质体黏合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜形成融合体。细胞电融合细胞电融合原理：原理：悬于大小不同的两平行电悬于大小不同的两平行电极间的低导电率溶液中的极间的低导电率溶液中的细胞，在细胞，在1 1100MHz100MHz和和1001001000V/cm1000V/cm的交流电场的交流电场中，会向小电极移动，并中，会向小电极移动，并极化成偶极子，而沿电场极化成偶极子，而沿电场方向发生方向发生双向电泳双向电泳，此时，此时再加上适当强度和持续时再加上适当强度和持续时间的高压电脉冲，即可使间的高压电脉冲，即可使相邻细胞膜的接触区产生相邻细胞膜的接触区产生可逆电降解可逆电降解，从而触发细，从而触发细胞融合。胞融合。+-+-+-+-+偶极子偶极子电诱导法原理电诱导法原理+-+双向电泳：在交流电场的作用下（1MHz，150V/cm）细胞膜上正负电荷分离，产生偶极，两个极化的细胞会发生相互的紧密接触。原生质体电融合过程1）在高频电流电场下的相互接触。2）脉冲刺激后30s3)50秒后4）1.5分钟后5）6分钟后6）15分钟后，原生质体融合完成。注意事项1）对介质要求高，一般用高纯度的蒸馏水并选用适当的非电介质溶液，如甘露醇等配制等渗性介质。2）注意控制高频交流电压和直流脉冲电压的强度和时间，以防止细胞连接成串或发生可逆性降解。优点：优点：融合率高，达7080，甚至100可在显微镜下定向诱导细胞融合可直接挑选杂种细胞重复性强、对原生质体伤害小；装置精巧、方便简单；免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控制性强等。融合指数融合指数（fusion indexfusion index）:反映细胞融合的效率反映细胞融合的效率有两种计算方法：有两种计算方法：1.FI=1.FI=（对照组细胞数（对照组细胞数-试验组细胞数）试验组细胞数）/试验组细胞数试验组细胞数2.2.FI=多核细胞中的细胞核数多核细胞中的细胞核数/所有细胞所有细胞中的细胞核数中的细胞核数不同细胞融合的条件及其主要应用来源来源前处理前处理融合的方法融合的方法主要应用主要应用动物细胞动物细胞不需不需仙台病毒仙台病毒,PEG，电融合，电融合生产单克隆抗体生产单克隆抗体植物细胞植物细胞脱壁脱壁PEG,电融合电融合创造植物新品种创造植物新品种微生物细胞微生物细胞脱壁脱壁PEG,高产优质新菌种高产优质新菌种同核体同核体同核体同核体异核体（杂交细胞）异核体（杂交细胞）未融合未融合未融合未融合加入融合剂加入融合剂融合细胞的类型融合细胞的类型同核体：同核体：由同一亲本细胞融合而来由同一亲本细胞融合而来异核体：异核体：（heterokaryon）有不同亲本细有不同亲本细胞融合而来胞融合而来异核体其细胞膜融合在一起，而融合的细异核体其细胞膜融合在一起，而融合的细胞含有两个不同的细胞核。胞含有两个不同的细胞核。动物细胞融合影响因素动物细胞融合中，除促融剂外，其他如细胞性质、温度、pH、离子强度及离子种类等均全影响细胞融合效率。亲本细胞表面性质影响较大亲本细胞表面性质影响较大细细胞胞种种类类不不同同，融融合合效效果果也也不不同同，如腹水癌及株化细胞较易融合，而淋巴细胞或血球细胞几乎不融合。细胞融合时需要适宜温度和运动状态。细胞融合时需要适宜温度和运动状态。如仙台病毒诱导-腹水癌细胞融合时，于37 振摇时易于融合，且融合效率与病毒量呈正比。但在34振摇则融合率下降。在37时不振摇则-不融合。细胞融合过程中，通通常常耗耗氧氧量量较较大大，缺氧时经常不融合。空气中含氧量大于20时有一定融合率，但有些细胞在无氧条件也可融合。有有些些细细胞胞融融合合时时需需要要CaCa2+2+，否否则则不不融融合合，细胞蛋白质亦发生变化。实验表明Sr2+、Ba2+、Mg2+、Mn2+等离子可代替Ca2+，但有效浓度较Ca2+大的多。融合时最适合的离子强度一般为0.1mol/L。最最适适合合的的pHpH为为7.4-7.87.4-7.8之之间间，在此范围之外，融合率均较低。比较常用的杂种细胞筛选方法比较常用的杂种细胞筛选方法n n1遗传互补筛选法：遗传互补筛选法：n n2营养互补筛选：n n3温度敏感筛选法温度敏感筛选法1）遗传互补筛选法：利用每一亲本贡献一个功能正常等位基因，纠正另一亲本的缺陷，令杂种细胞表现正常。n n亲本A：HGPRT-/TK+n n亲本B：HGPRT+/TK-n n杂交细胞：HGPRT+/TK+n n在HAT培养基中杂交细胞存活，A、B死亡2）营养互补筛选系统：细胞在缺乏一 种或几种营养成分时，不能生长繁殖 即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细 胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞。n n亲本A：色氨酸缺陷型n n亲本B：苏氨酸缺陷型n n杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养，而亲本细胞均会死亡。3）温度敏感突变型杂种细胞的筛选：一般的培养细胞能在32度到40度的范围内生长，但温度敏感突变型的细胞能在高温或低温下生长。由此筛选杂种细胞。n n亲本一：低温敏感突变型，可在低温下生长，在高温下死亡。n n亲本二：高温敏感突变型，可在高温下生长，在低温下死亡。n n杂种细胞能在高温和低温下生长。细胞融合的应用细胞融合的应用1.用于基因定位用于基因定位2.用于生产树突状细胞抗肿瘤疫苗用于生产树突状细胞抗肿瘤疫苗2.用于动物育种用于动物育种3.用于细胞治疗用于细胞治疗4.用于生产单克隆抗体用于生产单克隆抗体5.用于研究核质关系和肿瘤发生机制用于研究核质关系和肿瘤发生机制细胞融合应用细胞融合应用n n一一.单克隆抗体克隆抗体 19751975年英国科学家年英国科学家Milstein和和Kohler将将产生抗体生抗体 的淋巴的淋巴细胞胞同同肿瘤瘤细胞融合，成功建立了胞融合，成功建立了单克隆抗克隆抗 体技体技术，而，而获得得1984年年诺贝尔医学和生理医学和生理学学奖。The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1984forthediscoveryoftheprincipleforproductionofmonoclonalantibodiesGeorges J.F.KoehlerFederalRepublicofGermanyBaselInstituteforImmunologyBasel,Switzerlandb.1946d.1995Car MilsteinArgentinaandUnitedKingdomMRCLaboratoryofMolecularBiologyCambridge,UnitedKingdomb.1927(inBahiaBlanca,Argentina)d.2002科莱尔米尔斯坦单克隆抗体的概念单克隆抗体的概念n n单:单个细胞n n克隆:无性繁殖n n抗体:化学性质单一、特异性强亲本细胞的准备亲本细胞的准备亲本细胞的准备亲本细胞的准备细胞融合细胞融合杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的筛选可分泌特异性单克隆抗体可分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞的筛选的杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的克隆化培养杂交瘤细胞的克隆化培养单克隆抗体的生产和纯化单克隆抗体的生产和纯化生生 产产 过过 程程单克隆抗体的大量制备过程n n一一一一 细胞融合前准备细胞融合前准备细胞融合前准备细胞融合前准备n n(一一一一)动物免疫与免疫脾细胞悬液的制备动物免疫与免疫脾细胞悬液的制备动物免疫与免疫脾细胞悬液的制备动物免疫与免疫脾细胞悬液的制备n n在腹腔免疫在腹腔免疫在腹腔免疫在腹腔免疫1 12 2次后的次后的次后的次后的2 24 4周，于融合前周，于融合前周，于融合前周，于融合前3 34 4天加强免疫天加强免疫天加强免疫天加强免疫一次，这样可以使抗原最近激活的一次，这样可以使抗原最近激活的一次，这样可以使抗原最近激活的一次，这样可以使抗原最近激活的B B淋巴细胞定位于脾脏，淋巴细胞定位于脾脏，淋巴细胞定位于脾脏，淋巴细胞定位于脾脏，也使记忆细胞处在激活与分裂状态。许多资料结果表明，也使记忆细胞处在激活与分裂状态。许多资料结果表明，也使记忆细胞处在激活与分裂状态。许多资料结果表明，也使记忆细胞处在激活与分裂状态。许多资料结果表明，脾细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤的最佳时间，是在脾细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤的最佳时间，是在脾细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤的最佳时间，是在脾细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤的最佳时间，是在抗体形成高峰之前，而不是在抗体形成高峰期。可溶性抗抗体形成高峰之前，而不是在抗体形成高峰期。可溶性抗抗体形成高峰之前，而不是在抗体形成高峰期。可溶性抗抗体形成高峰之前，而不是在抗体形成高峰期。可溶性抗原的免疫量常为原的免疫量常为原的免疫量常为原的免疫量常为10-100ug10-100ug，经皮下或腹腔注射免疫，经皮下或腹腔注射免疫，经皮下或腹腔注射免疫，经皮下或腹腔注射免疫1-21-2次次次次（间隔（间隔（间隔（间隔2-32-3周），周），周），周），3 3周后周后周后周后50-500ug50-500ug抗原加强免疫，加强免疫抗原加强免疫，加强免疫抗原加强免疫，加强免疫抗原加强免疫，加强免疫一定要静脉注射或腹腔内注射，确保抗原到达脾脏。细胞一定要静脉注射或腹腔内注射，确保抗原到达脾脏。细胞一定要静脉注射或腹腔内注射，确保抗原到达脾脏。细胞一定要静脉注射或腹腔内注射，确保抗原到达脾脏。细胞抗原常用抗原常用抗原常用抗原常用2 102 107 7用细胞腹腔注射，不需佐剂。用细胞腹腔注射，不需佐剂。用细胞腹腔注射，不需佐剂。用细胞腹腔注射，不需佐剂。n n一般取最后一次加强免疫一般取最后一次加强免疫一般取最后一次加强免疫一般取最后一次加强免疫3 3天以后的天以后的天以后的天以后的脾脏脾脏脾脏脾脏，制备成细胞悬，制备成细胞悬，制备成细胞悬，制备成细胞悬液。液。液。液。n n淋巴细胞：经过免疫处理的淋巴细胞，多用大鼠淋巴细胞：经过免疫处理的淋巴细胞，多用大鼠淋巴细胞：经过免疫处理的淋巴细胞，多用大鼠淋巴细胞：经过免疫处理的淋巴细胞，多用大鼠或小鼠。或小鼠。或小鼠。或小鼠。n n免疫方法：体内法或体外法。免疫方法：体内法或体外法。免疫方法：体内法或体外法。免疫方法：体内法或体外法。n n体内法：对细胞或微生物抗原可直接注射如小鼠体内法：对细胞或微生物抗原可直接注射如小鼠体内法：对细胞或微生物抗原可直接注射如小鼠体内法：对细胞或微生物抗原可直接注射如小鼠体内，可溶性蛋白抗原可与等量的福氏完全佐剂体内，可溶性蛋白抗原可与等量的福氏完全佐剂体内，可溶性蛋白抗原可与等量的福氏完全佐剂体内，可溶性蛋白抗原可与等量的福氏完全佐剂混合乳化后，注入到动物体内。混合乳化后，注入到动物体内。混合乳化后，注入到动物体内。混合乳化后，注入到动物体内。3 3 3 34 4 4 4天后，在无天后，在无天后，在无天后，在无菌条件下可以取出脾或淋巴结制成悬液，存活率菌条件下可以取出脾或淋巴结制成悬液，存活率菌条件下可以取出脾或淋巴结制成悬液，存活率菌条件下可以取出脾或淋巴结制成悬液，存活率在在在在95959595以上的可以用于融合。以上的可以用于融合。以上的可以用于融合。以上的可以用于融合。n n体外法：直接提取大、小鼠淋巴细胞，调整为体外法：直接提取大、小鼠淋巴细胞，调整为体外法：直接提取大、小鼠淋巴细胞，调整为体外法：直接提取大、小鼠淋巴细胞，调整为101010107 7 7 7个个个个/ml/ml/ml/ml，加适当浓度抗原，加适当浓度抗原，加适当浓度抗原，加适当浓度抗原，3 3 3 34 4 4 4天后，收集被刺激天后，收集被刺激天后，收集被刺激天后，收集被刺激的淋巴细胞。的淋巴细胞。的淋巴细胞。的淋巴细胞。n n小牛血清的选择小牛血清的选择小牛血清的选择小牛血清的选择n n供血的新生小牛必须是健康牛的产仔，并在产后供血的新生小牛必须是健康牛的产仔，并在产后供血的新生小牛必须是健康牛的产仔，并在产后供血的新生小牛必须是健康牛的产仔，并在产后2424小时小时小时小时内抽血，此期间不得吸取母乳。内抽血，此期间不得吸取母乳。内抽血，此期间不得吸取母乳。内抽血，此期间不得吸取母乳。n n以无菌操作自颈动脉放血，并在无菌条件下分离血清及以无菌操作自颈动脉放血，并在无菌条件下分离血清及以无菌操作自颈动脉放血，并在无菌条件下分离血清及以无菌操作自颈动脉放血，并在无菌条件下分离血清及滤菌，全过程在滤菌，全过程在滤菌，全过程在滤菌，全过程在3636小时内完成。经滤菌的血清置小时内完成。经滤菌的血清置小时内完成。经滤菌的血清置小时内完成。经滤菌的血清置2020保保保保存。存。存。存。血清使用前需做细菌、支原体培养及内毒素测定，血清使用前需做细菌、支原体培养及内毒素测定，血清使用前需做细菌、支原体培养及内毒素测定，血清使用前需做细菌、支原体培养及内毒素测定，在确实无污染的情况下方可使用。在确实无污染的情况下方可使用。在确实无污染的情况下方可使用。在确实无污染的情况下方可使用。n n每批小牛血清测定总蛋白含量并分别配成每批小牛血清测定总蛋白含量并分别配成每批小牛血清测定总蛋白含量并分别配成每批小牛血清测定总蛋白含量并分别配成1010、2020、2525于基础培养基和于基础培养基和于基础培养基和于基础培养基和HATHAT培养基中，对骨髓瘤细胞和杂交培养基中，对骨髓瘤细胞和杂交培养基中，对骨髓瘤细胞和杂交培养基中，对骨髓瘤细胞和杂交瘤细胞进行培养，观察小牛血清对瘤细胞和融合细胞的细瘤细胞进行培养，观察小牛血清对瘤细胞和融合细胞的细瘤细胞进行培养，观察小牛血清对瘤细胞和融合细胞的细瘤细胞进行培养，观察小牛血清对瘤细胞和融合细胞的细胞毒性。胞毒性。胞毒性。胞毒性。n n轻微溶血的血清，而无细胞毒性者仍可应用。轻微溶血的血清，而无细胞毒性者仍可应用。轻微溶血的血清，而无细胞毒性者仍可应用。轻微溶血的血清，而无细胞毒性者仍可应用。n n在用血清做细菌培养时，应置于细胞培养瓶内进行，培在用血清做细菌培养时，应置于细胞培养瓶内进行，培在用血清做细菌培养时，应置于细胞培养瓶内进行，培在用血清做细菌培养时，应置于细胞培养瓶内进行，培养期间随时可放于倒置显微镜下观察，可避免由于肉眼观养期间随时可放于倒置显微镜下观察，可避免由于肉眼观养期间随时可放于倒置显微镜下观察，可避免由于肉眼观养期间随时可放于倒置显微镜下观察，可避免由于肉眼观察的疏忽。察的疏忽。察的疏忽。察的疏忽。B淋巴细胞的准备淋巴细胞的准备红细胞将红细胞注入小鼠皮下或腹腔取出脾脏B淋巴细胞 亲本细胞的准备亲本细胞的准备亲本细胞的准备亲本细胞的准备(二二)骨髓瘤细胞的获得与培养骨髓瘤细胞的获得与培养n n 骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一晶系小鼠腹腔内产生杂交瘤细胞在同一晶系小鼠腹腔内产生大量大量McAB。n n骨髓瘤细胞的培养可利用一般的动物细骨髓瘤细胞的培养可利用一般的动物细胞培养液。小牛血清的浓度一般在胞培养液。小牛血清的浓度一般在1020，细胞的最大密度不得超，细胞的最大密度不得超106个个ml，一般扩大培养以，一般扩大培养以1：10稀释传代，每稀释传代，每3-5天传代一次。细胞的倍增时间为天传代一次。细胞的倍增时间为16-20h。亲本细胞的准备亲本细胞的准备亲本细胞的准备亲本细胞的准备骨髓瘤细胞的准备骨髓瘤细胞的准备骨髓瘤细胞：是癌变的浆细胞，可以分泌免疫球蛋白，所以必须选择不分泌免疫球蛋白的缺陷型骨髓瘤细胞，多用多用BALB/C BALB/C 小鼠的骨小鼠的骨髓瘤细胞。髓瘤细胞。细胞融合细胞融合加入PEG作融合剂B淋巴细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞1234二二 细胞融合细胞融合n n融合条件除了融合剂以外，还包括温融合条件除了融合剂以外，还包括温度、培养基和培养板等。我们首先分度、培养基和培养板等。我们首先分析用析用PEG作融合剂时的条件选择。由作融合剂时的条件选择。由于作用时间不一样对细胞的毒性也不于作用时间不一样对细胞的毒性也不一样。用于融合的分子量一般在一样。用于融合的分子量一般在10004000，一般作用浓度在，一般作用浓度在3550之间，之间，PEG作用作用12分钟，以分钟，以PH8.08.2时融时融合率最高。合率最高。小白鼠脾臟細胞小白鼠脾臟細胞小白鼠脾臟細胞小白鼠脾臟細胞 B B 與與與與 癌細胞癌細胞癌細胞癌細胞 NN 以以以以 PEG PEG 進行融合，進行融合，進行融合，進行融合，操作在操作在操作在操作在 10 min 10 min 內完成內完成內完成內完成 (如下圖如下圖如下圖如下圖)，隨即把細胞平均分，隨即把細胞平均分，隨即把細胞平均分，隨即把細胞平均分配在配在配在配在 96 96 槽細胞培養盤槽細胞培養盤槽細胞培養盤槽細胞培養盤 中中中中 n n细胞融合：细胞融合：1.脾细胞的准备；拉颈处死小鼠；脾细胞的准备；拉颈处死小鼠；无菌操作取出脾脏；清洗、研磨。无菌操作取出脾脏；清洗、研磨。2.制备制备脾细胞悬液脾细胞悬液:收集细胞；离心洗涤；细胞计收集细胞；离心洗涤；细胞计数。数。3.准备骨髓瘤细胞准备骨髓瘤细胞:收集细胞；离心洗收集细胞；离心洗涤；活细胞计数；调整细胞浓度，骨髓瘤涤；活细胞计数；调整细胞浓度，骨髓瘤细胞与小鼠脾胞按一定比例混合。细胞与小鼠脾胞按一定比例混合。4.细胞细胞融合剂的选择：融合剂的选择：病毒，病毒，PEG。5.细胞融合：细胞融合：在聚乙二醇作用下各种淋巴细胞可与骨髓在聚乙二醇作用下各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。n n将免疫脾细胞和小鼠骨髓细胞以将免疫脾细胞和小鼠骨髓细胞以2 2：1 1或或1010：1 1的比例混匀于的比例混匀于50ml50ml锥形离心管内。锥形离心管内。n n1200rpm1200rpm离心离心7 71010分钟，尽量吸净上清液，分钟，尽量吸净上清液，用手指轻击管壁，使管底沉淀的细胞铺展用手指轻击管壁，使管底沉淀的细胞铺展成薄层。成薄层。n n在室温条件下边轻轻振摇离心管边在在室温条件下边轻轻振摇离心管边在6060秒秒钟内逐滴加入钟内逐滴加入50%50%的的PEG 0.5mlPEG 0.5ml，随后静置，随后静置9090秒。秒。n n再于再于5 5分钟内边振摇边逐滴加入分钟内边振摇边逐滴加入5 510ml10ml不不含血清的培液或盐水缓冲液，以终止含血清的培液或盐水缓冲液，以终止PEGPEG的的作用，再静置作用，再静置1010分钟。分钟。n n融合细胞的早期观察及其异常结果分融合细胞的早期观察及其异常结果分析：析：n n1融合后的细胞早期观察与管理；融合后的细胞早期观察与管理；2无分泌特异性抗体杂交瘤原因分析；无分泌特异性抗体杂交瘤原因分析；n n3转种与扩大培养过程中杂交瘤细胞转种与扩大培养过程中杂交瘤细胞生长；生长；n n4不出现杂交瘤的原因分折。不出现杂交瘤的原因分折。三三杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的筛选融合将细胞转移到HAT培养基中培养HAT1234HATHAT培养基筛选杂交瘤细胞培养基筛选杂交瘤细胞n n细胞团块分散后，加HAT溶液，稀释至骨髓瘤细胞不超过2105 ml，即可加入有饲养细胞的96孔塑料培养板内每孔0.1ml，如是24孔板，每孔0.5ml；总量分别为0.2ml和1ml。n n用HAT选择性培养时每隔23天半量换液，7天后可以选择出杂交瘤细胞。HATHAT选择系统选择系统n nHATHAT是含一定浓度是含一定浓度次黄嘌呤（次黄嘌呤（H H）、氨基喋呤氨基喋呤（A A）及及胸腺嘧啶核苷（胸腺嘧啶核苷（T T）的一种的一种选择性培养选择性培养基基，其中三种成分与细胞，其中三种成分与细胞DNADNA合成有关。合成有关。n nDNADNA合成途径有两种。合成途径有两种。n n杂交瘤技术中，常选用 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷（HPRTHPRT-）骨髓瘤细胞或 胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TKTK-）骨髓瘤细胞为亲本之一。n nHPRT-细胞的嘌呤只能由全合成途径产生；n nTK-细胞的嘧啶只能由全合成途径合成。含氨基喋呤培养基抑制了细胞内嘌呤和嘧啶的全合成途径。n n淋巴细胞具有合成DNA的两条途径。n n杂种细胞通过互补作用获得HRPT或TK基因，可应用培养基中次黄嘌呤及胸腺嘧啶核苷，通过补救合成途径合成DNA。n n在HAT培养基中，HPRT-或TK-亲本细胞死亡，淋巴细胞亦逐渐死亡，只有杂种细胞存活。四四可分泌特异性单克隆抗体可分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞的筛选的杂交瘤细胞的筛选HAT将培养皿孔内的上清液取出，检测抗体。常用的方法将培养皿孔内的上清液取出，检测抗体。常用的方法有：放射免疫测定、酶联免疫吸附试验和免疫荧光测定。有：放射免疫测定、酶联免疫吸附试验和免疫荧光测定。融合五五杂交瘤细胞的克隆化培养杂交瘤细胞的克隆化培养123456融合HAT杂交瘤细胞的克隆化培养杂交瘤细胞的克隆化培养n n利用单个细胞培养技术选育出遗传稳定的分泌特异抗体的细胞系。n n在培养过程中，一般要加能释放某些生长因子促进杂交瘤生长的饲养细胞，如小鼠的腹腔巨噬细胞、脾细胞或胸腺细胞等。n n方法有有限稀释法、软琼脂培养法、显微操作法、应用荧光激活分选仪等。n n克隆化的目的克隆化的目的克隆化的目的克隆化的目的1 1）是细胞建株的必经过程，以得到遗传特征相同是细胞建株的必经过程，以得到遗传特征相同是细胞建株的必经过程，以得到遗传特征相同是细胞建株的必经过程，以得到遗传特征相同的细胞；的细胞；的细胞；的细胞；2 2）就杂交瘤而言，可从中筛选出稳定而同源的就杂交瘤而言，可从中筛选出稳定而同源的就杂交瘤而言，可从中筛选出稳定而同源的就杂交瘤而言，可从中筛选出稳定而同源的杂种细胞系，淘汰遗传不稳定的杂交瘤细跑。杂种细胞系，淘汰遗传不稳定的杂交瘤细跑。杂种细胞系，淘汰遗传不稳定的杂交瘤细跑。杂种细胞系，淘汰遗传不稳定的杂交瘤细跑。3 3）减少非分泌型无关细胞生长过快。减少非分泌型无关细胞生长过快。减少非分泌型无关细胞生长过快。减少非分泌型无关细胞生长过快。n n注意事项：注意事项：注意事项：注意事项：待克隆细胞生长处于对数增长期；待克隆细胞生长处于对数增长期；待克隆细胞生长处于对数增长期；待克隆细胞生长处于对数增长期；小牛血清的质量和浓度；小牛血清的质量和浓度；小牛血清的质量和浓度；小牛血清的质量和浓度；细胞计数要准确；细胞计数要准确；细胞计数要准确；细胞计数要准确；及时观察细胞生长情况。及时观察细胞生长情况。及时观察细胞生长情况。及时观察细胞生长情况。n n饲养细胞的种类和作用饲养细胞的种类和作用对于培养小鼠细胞来说，主要有下列各种细胞可对于培养小鼠细胞来说，主要有下列各种细胞可供作为其饲养细胞：供作为其饲养细胞：胸腺细胞胸腺细胞,用量为用量为106/0.2ml106/0.2ml正常的脾细胞；正常的脾细胞；传代培养中的大鼠胚胎成纤维细胞；传代培养中的大鼠胚胎成纤维细胞；腹腔细胞其用量为腹腔细胞其用量为2104/0.2ml2104/0.2ml，腹腔细胞是使，腹腔细胞是使用得最普遍的饲养细胞。用得最普遍的饲养细胞。胚胎成纤维细胞因在细胞培养条件下有分裂增殖胚胎成纤维细胞因在细胞培养条件下有分裂增殖的能力，故只适应于软琼脂平板法培养中，该细的能力，故只适应于软琼脂平板法培养中，该细胞铺于平板的底层。胞铺于平板的底层。n n饲养细胞的作用饲养细胞的作用提高培养细胞的密度，使待克隆细胞容提高培养细胞的密度，使待克隆细胞容易生存与繁殖。易生存与繁殖。腹腔细胞能清除培养中的死亡细胞，从腹腔细胞能清除培养中的死亡细胞，从而促进单个细胞克隆的生长。而促进单个细胞克隆的生长。饲养细胞能释放诸如细胞生长因子类物饲养细胞能释放诸如细胞生长因子类物质，起到促进细胞分裂、增殖的作用。质，起到促进细胞分裂、增殖的作用。n n 1.1.有限稀释法有限稀释法稀释稀释n n1 1）有限稀释法）有限稀释法）有限稀释法）有限稀释法 有限稀释法原理是从理论上将细胞稀释到有限稀释法原理是从理论上将细胞稀释到有限稀释法原理是从理论上将细胞稀释到有限稀释法原理是从理论上将细胞稀释到1010个个个个/ml/ml，然后装成每小孔，然后装成每小孔，然后装成每小孔，然后装成每小孔(96(96孔板孔板孔板孔板)0.1ml)0.1ml，使每孔理，使每孔理，使每孔理，使每孔理论上含有单个细胞，经过培养后即可获得单个细论上含有单个细胞，经过培养后即可获得单个细论上含有单个细胞，经过培养后即可获得单个细论上含有单个细胞，经过培养后即可获得单个细胞形成集落胞形成集落胞形成集落胞形成集落 。有限稀释法举例：有限稀释法举例：有限稀释法举例：有限稀释法举例：1.1.取取取取1.0 ml 5104ml1.0 ml 5104ml细胞细胞细胞细胞+4ml+4ml培养基稀释，培养基稀释，培养基稀释，培养基稀释，得得得得1104/ml.1104/ml.2.2.取取取取0.5ml 1104ml0.5ml 1104ml细胞液细胞液细胞液细胞液+4.5ml+4.5ml培养基稀释，培养基稀释，培养基稀释，培养基稀释，得得得得1103/ml.1103/ml.3.3.取取取取1.0ml 1103ml1.0ml 1103ml细胞液细胞液细胞液细胞液+4.5ml+4.5ml培养基稀释，培养基稀释，培养基稀释，培养基稀释，得得得得1102/ml.1102/ml.2.软琼脂培养法软琼脂培养法n n在加入饲养细胞的无菌平皿内铺上一层0.5的琼脂，待凝固后再铺上一层混有杂交瘤细胞的0.25的软琼脂。待细胞长成集落后，用毛细管吸出移种于含饲养细胞的96孔板内。n2）软琼脂培养法：）软琼脂培养法：本法对于某些抗原，可以把克隆化培养与特异本法对于某些抗原，可以把克隆化培养与特异性筛选测定结合起来进行，所以它的特点是效率性筛选测定结合起来进行，所以它的特点是效率较高，速度较快。但缺点是克隆率不高。基本原较高，速度较快。但缺点是克隆率不高。基本原理是利用单个细胞在软琼脂培养基上的局限化生理是利用单个细胞在软琼脂培养基上的局限化生长，待细胞集落长到肉眼可见后，用巴氏吸管从长，待细胞集落长到肉眼可见后，用巴氏吸管从琼脂上挑出来琼脂上挑出来(一般一般810天后天后)，再移到液体培养，再移到液体培养基中，进行生长繁殖，并检测培养上清液的活性。基中，进行生长繁殖，并检测培养上清液的活性。也可以用溶血空斑技术或围绕集落形成免疫沉淀也可以用溶血空斑技术或围绕集落形成免疫沉淀的方法来直接测它的活性。的方法来直接测它的活性。3.3.显微镜操作法显微镜操作法n3）显微镜操作法）显微镜操作法 在倒置在倒置(或解剖或解剖)显微镜下，借助于毛细吸管将显微镜下，借助于毛细吸管将单个细胞个别吸出，分别放入已加饲养细胞的单个细胞个别吸出，分别放入已加饲养细胞的96孔培养孔内，根据原理不同，又分为普通法和玫孔培养孔内，根据原理不同，又分为普通法和玫瑰花结两种方法。瑰花结两种方法。普通显微镜操作法：于普通显微镜操作法：于6cm平皿中，假如约平皿中，假如约103个个细胞；细胞；CO2培养基箱中静置培养基箱中静置1小时左右无菌条件；小时左右无菌条件；在倒置显微镜下去平皿盖用直角转头滴管，吸出在倒置显微镜下去平皿盖用直角转头滴管，吸出单个细胞移至预先加有饲养细胞的单个细胞移至预先加有饲养细胞的96孔板内直至孔板内直至96孔均分装有细胞，加盖；于孔均分装有细胞，加盖；于CO2培养箱内培养培养箱内培养观察与更换培养方法同有限稀释法。观察与更换培养方法同有限稀释法。玫瑰花结原理：分泌抗体细胞在其表面含有抗原玫瑰花结原理：分泌抗体细胞在其表面含有抗原受体，在受体，在定的条件下常可与特异性抗原致敏的定的条件下常可与特异性抗原