管碟法测定抗生素效价讲义.pdf

管碟法测定抗 生素效价目录456基本操作及注意事项检定的影响原因1J概述抗生素微生物检定法是国际上通用时、经典的抗生 素效价测定措施。伴随HPLC等化学分析技术的发展,某些抗生素效价的测定已被化学措施所替代，但因 为下列原因，抗生素微生物检定法，目前在各国药 典中仍占有主要地位。1.微生物检定法可直观、特异的I反应出抗生素药物 的抗菌活性，显示临床的特点。2.多组分抗生素因为不同组分生物活性的差别，化 学测定成果难以精确表征组分、构成、含量和活性 的关系。3.许多抗生素品种因为多种原因目前没有合适的化 学分析措施表征其活性。4.同步微生物法所需的仪器设备简朴，成本低。在中国药典2023年版二部附录XI抗生素微生物检定法及2015 版药典中，详细描述了管碟法和浊度法测定抗生素效价日勺措施,根据企业生产及检测情况，主要是硫酸庆大霉素和硫酸庆大 霉素颗粒，采用抗生素管碟法测效价来计算含量，所以，此章 主要简介管碟法。抗菌活性 抗菌活性是指抗菌药物克制或杀死病原微生物的能力。抗生素的抗菌活性一般用效价来表达。在临床应用中，抗生素的抗菌活性可精确地反应抗生素的医 疗价值。如：硫酸链霉素798单位/毫克青霉素G钠 1670单位/毫克Z基本原理2023版药典二部附录及2023版药典，在合适条件下，根据量 反应平行线原理，利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较原则品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小,测定供试品时效价。抑菌圈的形成两种互动作用：一种是抗生素溶液向培养基内呈球面状扩 散作用；另一种是试验菌的生长作用。当培养到一定时间，琼脂培养基的两种互动作用到达动态 平衡时，琼脂培养基中便形成透明的抑菌圈。即：在抑菌 圈中因抗生素浓度高于抑菌浓度，试验菌生长受到克制，此处琼脂培养基成透明状；在抑菌圈边沿抗生素浓度恰好 等于抗生素最低抑菌浓度。量反应平行线原理：当抗生素浓度的对数剂量和反应呈直线 关系，且供试品和原则品的作用性质相同步，供试品和原则 品的两条量-反应关系曲线相互平行。（中国药典二部附录XIV 生物检定统计法）褊用雷图盛023年版二部附录要求，硫酸庆大霉素和硫酸庆大霉 素颗粒测效价，选用短小芽抱杆菌作为试验菌。取短小芽泡杆菌CMCC(B)63202用勺营养琼脂斜面培养物，接种于 盛有营养琼脂培养基日勺培养瓶中，在3537培养7日，用革兰氏染 色法涂片镜检，应有芽抱85%以上。用灭菌水将芽抱洗下，在65 加热30分钟，备用。流程图一半固体琼脂斜面 一 制菌悬液冻干菌粉营养肉汤（复活）u穿刺管（保藏及传代用）备注：每经过一次培养箱培养，菌时代数就增长一代。参照：药物微生物学检验技术主编：苏德模马绪荣2023年出版1.复活从菌种保藏机构购回的原 则菌株，是冷冻干燥粉，需 经过复活。（冻干菌种为第0 代）无菌操作，将冷冻干燥菌种安甑用75%乙醇消毒后，用砂轮 在安甑颈部刻线，用无菌纱布掰开，或灼热安甑顶部，立即 作灭菌湿纱布盖住顶部，安甑顶部便骤然裂开，小心移去玻 璃碎片，用一无菌毛细管吸收0.5-1 ml合适的液体培养基，直 插安甑底部，挤出营养肉汤培养基，在底部振摇使菌粉溶解,再将安甑内菌液吸出，接种至营养肉汤培养基。35-37度 培养18-二十四小时。（此为第一代）制保藏用菌株 将营养肉汤培养物，用接种针沾取菌苔（菌液），沿半固体 培养基中心向管底作直线穿刺。穿刺到保藏管中，一样温度 35-37度，培养18-24 h,然后，放置2-8度冰箱保存，作为保 藏及传代用的菌株。制工作用菌悬液试验用菌种穿刺管1支，按无菌操作要求，接种于盛有30ml 一般琼脂培养基的大三角瓶中，旋转三角瓶使全部琼脂培养 基表面被菌液浸润，多出的菌液用吸管吸出弃入消毒液中。将已接种的三角瓶置3537时培养箱中培养710天，用 革兰氏染色法涂片镜检，应有芽抱85%以上，用灭菌水20ml 洗下芽抱，制成悬液，在65水浴中加热30分钟，即得。置 5冰箱中保存。革兰染色法 详细操作环节：涂片 干燥（自然干燥、培养箱内）固定（火焰）染色（包括初染、媒染、脱色、复染四步）涂片无菌操作及做涂片的过程染色 初染：草酸核结晶紫染1分钟，自来水冲洗。媒染：加碘液覆盖涂面染1分钟，自来水冲洗。脱色：加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒 后自来水冲洗。复染：加沙黄（复红）复染液30秒后，自来水冲洗白然干燥或用吸水纸吸去水分，镜检。染色的成果：革兰阳性菌呈紫色，革兰阴性菌呈红 色。图片染色环节酸结紫 草镂晶染 初n1 1mQV*染in 媒1m5%醇9乙薇色OS 脱3M愣nV爨燥检 干镜革兰染色原理 因为细菌细胞壁的构造和构成不同，将细菌分为革兰阳性 菌和革兰阴性菌。G+菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性孔障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，透性降低,故保存 结晶紫-碘复合物不易被洗脱而保存在细胞膜上，菌体呈紫 色为革兰阳性菌。G-菌：肽聚糖层薄，交联涣散，乙醇脱色不能使其构造 收缩，其脂含量高，乙醇将脂溶解，细胞壁透性加大，结晶 紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后菌体呈红色为革兰阴 彳生菌。革兰染色注意事项 1.革兰染色成败日勺关键是脱色时间，如脱色过分，革兰阳性菌也可 被脱色而被误以为革兰阴性菌；如脱色时间过短，革兰阴性菌也会 被误以为是革兰阳性菌。所以必须严格把握脱色时间。2.选用培养18二十四小时菌龄日勺细菌为宜，若细菌太老，因为菌 体死亡或自溶常使革兰阳性菌转呈阴性菌。革兰染色成果-革兰KP 口性菌革兰及俄性菌革兰染色成果公基本操作及注意事项 管碟法日勺操作环节预试验试验准缸 双碟日勺制备 供试品、原则品溶液日勺制粒V4 菌层日勺制匕放置小钢堂滴加抗生素溶液 双碟日勺培养 抑菌圈日勺测量成果日勺可靠性检验及效价测定预试验：拟定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗 生素浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合要求，即二 剂量法高剂量浓度原则品溶液所致的抑菌圈直径在18 22mm，三剂量法中间剂量浓度原则品溶液所致的抑菌圈 直径在1518mm.高下剂量之比为2:1.试验成果中抑菌圈直径不应该过大或者过小，在试验之前，能 够先做一种有关用不同浓度菌液配制的琼脂培养基菌层预试验，选择抑菌圈直径在1822mm的菌液浓度为试验用浓度（菌液浓度约为106个/mL）。批量试验中后期，菌液保存的时间过久，菌株就会逐渐衰亡，生长不一致，影响其对抗生素B勺敏感度，造成抑菌圈变大、模糊或者出现双圈。如若菌株不纯,也会造成这么B勺成果。所以，菌液在使用一段时间后，能够 重新配制纯化或者减小原来菌液在使用中B勺稀释倍数。试验准备：双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌；容量瓶、定量 吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等.抗生素试验中，玻璃双碟、小钢管往往会连续使用。因为清 洗方面的原因，它们还是轻易残留上次试验中的抗生素（庆 大霉素、争光霉素、链霉素等）或者被清洗用的杀菌剂（如 新洁而灭、洗洁精、去污粉等）污染，以至于在下次试验中 造成抑菌圈不正常的现象。所以，在清洗时要尤为注意多用 流水冲洗。双碟的制备：每只双碟加底层培养基约 20mL待培养基凝固后,将双碟 放入3537培养箱中彳寺用.无菌室工作台面可能因为使用时间已久，变得凹凸不平或者倾斜，会 影响培养基菌层日勺厚度均匀性。菌层越薄，形成日勺抑菌圈越大，会给 试验造成很大日勺误差。我们能够在桌面上放置一块足够大日勺玻璃平板,确保双碟放置区域日勺平整。在双碟底部预先标识样品日勺高下浓度区 域，在加注培养基底层日勺时候，有顺序地按照一致方向排列。接下来 加注培养基菌层日勺时候，依然按照原来日勺位置与方向排列。这么，虽 然桌面不够水平，还是能够确保培养基菌层是在水平日勺培养基底层上 铺开，到达消除误差日勺目日勺。试验中加注的培养基假如温度太低，就轻易在内部结块，或 者加注到双碟之后不能及时铺开，使得培养基表面为非水平 面，会给试验带来误差。加注6080的培养基底层之后，不应立即给双碟加盖。因为温度过高的培养基会形成大量的 水蒸气，在双碟盖上凝集并滴落在已经凝固定的培养基底层 上，会给培养基菌层的加注带来影响。供试品、原则品溶液日勺制备：估计供试品日勺效价，根据试验要求设计供试品、原则品溶液稀释环节，平行制备供试品、原则品有关剂量日勺溶液.依企业产品，硫酸庆大霉素和硫酸庆大霉素颗粒，采用日勺是二剂量法,试验中，制成高、低浓度日勺溶液。依中国药典2023版及2023版二部附录要求，抗生与关 别试验菌培养基灭菌缓冲 液PH值抗生素浓度 泊围 单位/ml培养条件PHIS温度日：时间/小时庆大霉素短小芽泡杆菌CMCC(B)63 202I7.&-8.07.82.0-12.0353714-16国层欧J制备：注意菌层培养基温度；根据预试验拟定加入菌 层培养基的菌液量，注意 制备菌层的速度和平整 度.制备琼脂培养基菌层时，培养基温度过高或者受热时间太长 都会造成试验菌死亡。当菌种为非芽抱杆菌的时候，现象尤 为明显，甚至会出现无菌生长。所以，培养基应放在50水 浴中保温。当加入试验菌种混匀后，应尽快加注究竟层培养 基上。在试验的时候，假如从大瓶内用刻度吸管吸收带菌培 养基吸管中培养基量少极易冷却，加在底层培养基上就不 易均匀铺开，造成菌层厚度不均，影响到抑菌圈的直径。所以能够事先把配制好的培养基分装在具塞试管内，每管 5mL,湿热灭菌后放在50水浴锅内保温（水浴温度：细菌 为4850,芽抱可至60）。试验中，再分别加入菌液混 匀，配制成带菌琼脂。震荡混匀后继续保温5min使培养基 温度回升，然后直接倒在底层培养基上，转动双碟使培养 基均匀铺开。放置小钢管放置小钢管时，注意管与管之间不能太接近，不然会引起相 邻的两个抑菌圈之间的抗生素扩散区中的浓度增大，相互影 响形成卵圆形或椭圆形抑菌圈。管与双碟边沿一样也不能太 接近，因为液面浸润作用，边沿的琼脂培养基菌层为非平面,会影响抑菌圈的I形状。小钢管放置时，要小心地从 同一高度垂直放在菌层培养 基上，不得下陷，不得倾斜,不能用悬空往下掉的措施。放置之后，不能随意移动,要静置5min,使之在琼脂 内稍下沉降稳定后，再开始 滴加抗生素溶液。滴加抗生素溶液：注意原则品、供试品高、低剂量溶液滴加顺序，确保滴加速度和加量日勺 均匀一致.滴加抗生素要按照SH-TH-SL-TL（二剂量法）或者SH-TH-SM-TMSL-TL（三剂量法）日勺顺序滴加。滴加之前，滴管至少要用被滴液体冲洗3次。在滴加抗生素到小钢管日勺时候，因 为毛细管内抗生素溶液往往会有气泡或者毛细管开口端有液体残留，继续滴加轻易造成气泡膨胀破裂，使溶液溅落在琼脂培养基表面造 成破圈。所以一旦毛细管中出现 气泡或者残留，就重新吸收抗生 素溶液进行滴加，毛细管口应防 止太细，滴加日勺时候离开小钢管 口距离不要太高。SL标品的低浓度TH样品日勺高浓度TL样品的低浓度SH标品的高浓度滴加中若有溅出，可用滤纸片轻轻吸去，不致造成破圈。在滴加中还 有可能出现抗生素溶液滴入小钢管后，没有与琼脂培养基菌层接触，有一段空气被压在溶液与培养基之间，这么是不会产生抑菌圈日勺。此 时能够小心日勺用滴管吸出小钢管内日勺抗生素溶液，弃去。换滴管重新 滴加。抗生素溶液滴加后，液面应该与小钢管管口齐平，液面反光呈 黑色。（抗生素液体加入量不能按滴计算，虽然同一滴管，每滴日勺量 也有差别。）假如抗生素溶液滴加过满，能够用无菌滤纸片小心吸去 多出部分。双碟日勺培养：根据培养温度日勺要求在培养箱中进行培养，培养箱中 水平碟放日勺双碟数以不超出三层为宜。滴加了抗生素溶液后日勺双碟忌震动，要轻拿轻放。在搬运到培养箱 日勺过程中，能够预先在培养箱中垫上报纸铺平，再把双碟连同垫于 桌上日勺玻璃板小心运至培养箱，缓慢推入箱内。双碟在37P下培养 约16h。时间太短会造成抑菌圈模糊，太长则会使菌株对抗生素日勺敏感性下降，在抑菌圈边沿的菌继续生长，使得抑菌圈变小 O在培养过程中，假如温度不均匀（过于接近热源），会造 成同一双碟上细菌生长速率不等，使抑菌圈变小或者不圆。所以把双碟放入培养箱时，要与箱壁保持一定的距离，双碟 叠放也不能超出3个。培养中，箱门不得随意开启，以免影 响温度。应经常注意温度，预防意外过冷过热。抑国圈的J测量：抑国圈测 量仪的使用，每组试验双 碟应在相同的I测量参数下 进行测量.硫酸庆大霉素颗粒剂，采 用每组12只，同步做一 份平行样品，共做2组，试验后，剔除部分不合格 品。采用抑菌圈自动测量分析仪 ZY-300IV型，自动扫描出抑 菌圈，测出直径并计算出产 品效价。（中国药典2023版 附录XIV生物检定统计法）二 ZY-3UUJLV装多必豌抑茵圈浏坐位-L二刑箕2欣 CE 八抗生麦2U1 八中间体2UlbU3Ul 1 J用 文件也）影像X）速殡工）其它叱）和助电）:口 Q|页面也量 0|碎 7|A 3 安|缩放到|1。一 弓 线次|i像素=薮色|国实费记T 通原蛤图愫T 国 目标图愫T叵3试淞结果 T Q 实蛇报告二剂盎2阪1：抗生耒2。15中阿伟A2(MbU3lM-E 文件3)影像B)谑嫌(L)其它 9 和助 g口 Q I页面设置 3 冬3)、Q qG d】I缩放到io。*馁素No O1 No OZ No.03 No 04 No.05 No 06,No.07 No.08,No.09.No IO.No.1 1,No 12 上或AK ZY-3UU_LV型多必豌抑菌国谢呈仪1-二弄便 2敲、抗生素NU1八中间1S文件3)影像 Q)渡镜&)其它9名口 H 口页面设置心口寻|西N|囹实验登记J史原始图像T国目标图像编号?S1|S2|T1 Nm.O116.T3IT.52存器Ho.0216.4018.45Ho.0316.STIT.58Ho.0416 S917 55Ho.0516.4T17.85Ho 0616.27IT.46恐穿No-0716.47IT.Z8?v?A?H-0316.7817.99芝颁Ho.OB16.6217.60Mo.IONo.1 116.4418.1 116.47IT.5SMo.12ie 23IT,51帮助国)A|缩放到打口口 m线宽叵国菽熊圣英I T Q实险报告 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得不小于5%。5J操作要点1.试验菌需新鲜培养，传代最佳不超出5次，以预防菌种老化变异.芽抱杆菌培养物用灭菌水洗下后,应在65C加热30分钟,使菌体日勺菌 龄一致,用革兰氏染色,应有芽泡85%以上.2.加入菌悬液日勺体积,一般不少于0.3ml,而且不不小于上层培养基 体积日勺2%.假如加入菌悬液日勺体积过小,则在同次试验中,不同次加 入菌悬液日勺体积相差较大,造成试验误差；假如加入菌悬液日勺体积 过大,则会使上层培养基变稀,而且因菌悬液日勺温度较低，加至培养 基中可能造成培养基结块,影响测定成果.对于加入菌悬液体 积日勺控制,可经过调整菌悬液日勺浓度来实现.3.放置孵箱培养时排放应不得超出三层，防止因培养温度不 均匀而造成各双碟中抑菌圈大小不一.4.在制备菌层培养基时，将菌液加入菌层培养基后，立即充 分摇匀，但应防止产愤怒泡.5.原则品与供试品溶液浓度日勺比值应控制在2%以内，以确保两者日勺浓度偏差在一定日勺范围内。6.培养基的PH值对试验成果影响很大，使用时培养基的PH 值应调整到适合该品种试验的最佳范围。对氨基糖昔类碱性 抗生素而言，在偏碱性条件下抗菌活性比较强，一般灭菌后 时PH值范围为7.8-8.0。如抑菌圈清楚，当圈偏小时，可考虑 把培养基的PH值调高至80y检定的影响原因1.试验菌种：当试验菌种中具有对抗生素敏感度不同日勺两 种或两种以上日勺菌株时，因为各菌株日勺最低抑菌浓度不 同，在形成抑菌圈时可能出现双圈及边沿模糊不清，影 响测量抑菌圈日勺精确度。所以，应定时将试验菌种进行 平板分离，经涂片镜检后，挑选经典日勺单个菌落作为工 作用菌种。陈旧日勺试验菌培养物也会使抑菌圈边沿模糊,故试验时应用新鲜制备日勺试验菌液。2.培养基：培养基日勺质量对抑菌圈日勺大小和清楚度都有 影响，故对配制培养基用日勺几种主要原材料如陈、牛肉 膏、酵母膏及琼脂等都应经过预试验选择合适日勺品种使 用。庆大霉素检定用日勺培养基是I号。3.双碟日勺制备：铺双碟底层培养基时，培养基日勺温度不宜过高，一般 将融化后日勺培养基在室温冷至约70时加入双碟中为宜，不然加双碟 盖后，底层培养基上会出现冷凝水。当铺菌层培养基时，因为冷凝水 日勺局部冷却和稀释作用，可使菌层培养基凝固后表面不平。菌层培养 基一定要铺均匀，这是决定抗生素效价测定日勺关键。故要求铺菌层时 一定要与铺底层时双碟日勺位置、方向相一致。制备菌层时，培养基日勺 温度不要过高，受热时间也不宜过长，尤其是某些对热敏感日勺试验菌 更要注意。不然，可使试验菌部分或全部被杀死，造成抑菌圈破裂或 甚至无抑菌圈形成。所以，一定要按要求控制菌层培养基日勺温度。在双碟培养基上放置小钢管日勺距离要合适。当距离太小而抑菌圈又太 大时，则相邻两个抑菌圈之间日勺抗生素扩散区中抗生素日勺浓度增大，形成相互影响日勺卵圆形或椭圆形抑菌圈。在滴加抗生素溶液至小钢管 时，若毛细滴管口不圆整或有小缺口，或管内有气泡，均可使抗生素 溶液从管口溅出；若加液太满，溶液会从小钢管口溢出；小钢管底部 不平，溶液会从底部漏出。以上原因均会造成抑菌圈不圆整或破裂成 桃形。预防日勺方法是滴管口要圆整，管口不能太细，管内不能有气泡,加液时滴管口离校钢管日勺距离不能太高，小钢管两端面要平。4.双碟日勺培养温度和时间：培养箱日勺温度要均匀，每组双碟要放在 同一层盘内，在培养过程中，不要开启培养箱，以免影响培养箱内 日勺温度。双碟日勺培养时间也与抑菌圈日勺清楚度有关。5.抗生素污染：无抑菌圈形成日勺原因，大多因为抗生素污染所致。所以，在进行抗生素效价测定时，要严防抗生素污染。预防日勺方法 是将配置和稀释抗生素溶液所用日勺容器与制备培养基所用日勺容器严 格分开，切不可将抗生素溶液撒于地面，以免抗生素附着在微小尘 埃上随风飘落在双碟琼脂培养基上，而造成抑菌圈破裂或无抑菌圈 形成。6.原则品：抗生素微生物检定发日勺试验采用原则品与供试品对比试验 日勺平行线原理。所以，要求原则品与供试品必须是同质日勺抗生素。如 原则品与供试品所含日勺活性物质不同，则原则品和供试品日勺两条剂量 反应线不成平行直线关系，就不能按平行线原理计算效价。多种抗生 素都有它同质日勺原则品，决不能用这一型抗生素组分制备日勺原则品，去测定另一型抗生素日勺供试品。7.抑菌圈质量日勺控制(1)抑菌圈日勺性状试验中，常有抑菌圈破裂，不圆，甚至破圈日勺情况，其原因 是多方面的：在滴加抗生素溶液时，药液溅出、毛细滴管遇到钢管壁使抗生素溶液漏出，出现 不圆等；双碟、钢管、钢管放置器内有残留抗生素污染；试验菌菌龄过老，菌层培养基加菌液时培养基温度过高，将检定菌烫死等；稀释抗生素溶液所用缓冲溶液日勺ph值和盐浓度也可影响抑菌圈日勺圆整。(2)抑菌圈大小日勺控制抗生素抑菌圈日勺大小受浓度、加样量、最低抑菌浓度、扩散系数、扩散时间、培 养基厚度日勺影响；当抗生素浓度不变时，加样量日勺对数与抑菌圈直径或面积呈直线关系，故钢管中 滴加抗生素日勺体积一致；抑菌圈大小受抗生素扩散时间日勺影响，故预先延长抗生素日勺扩散时间可使抑菌圈 变大。试题1.硫酸庆大霉素颗粒剂，测效价，采用时()措施.A.稀释法 B.比浊法C.管碟法D.打孔法2.庆大霉素测效价的培养基ph是O。A.7.8-8.0 B.6.5-6.63.庆大霉素测效价采用()剂量法，高下浓度之比为O。A.二 2:1 B.一 2:1 C.二 3:1 D.一 3:14.庆大霉素测效价，采用的试验菌是O。A.枯草芽抱杆菌B.短小芽抱杆菌C.金黄色葡萄球菌5.二剂量法高剂量浓度原则品溶液所致日勺抑菌圈直径在（）。A.18-22mm B.15-18mm C.16-18mm C.14-16mm6.芽抱杆菌培养物用灭菌水洗下后，应在O加热O,使菌体的菌龄 一致，用革兰氏染色，应有芽泡（）以上。A.65 30min 85%B.50 30min 85%C.65 15min 85%D.50 15min 85%7.管碟法测抗生素效价中，庆大霉素试验，检定用日勺日勺培养基是（）-A.IB.nc.mD.IV1.抗生素测效价中，抑菌圈是两种互动作用形成日勺，是哪两种互动作 用？2.抗生素微生物检定日勺基本原理是什么？3.滴加抗生素溶液按什么顺序进行？4.预试验日勺目日勺是什么？5.抗生素抑菌圈受哪些原因影响?