光谱分析技术_吉林大学.ppt

光谱分析技术光谱分析技术 吉林大学生物基础实验吉林大学生物基础实验教学中心教学中心 1、实验目的实验目的 2 2、实验原理实验原理 3 3、仪器结构与分类仪器结构与分类 3 3、实验操作实验操作 4 4、注意事项注意事项 5 5、思考题思考题吉林大学生物基础实验教学中心吉林大学生物基础实验教学中心实验目的实验目的学习掌握紫外可见、荧光、红外光谱分学习掌握紫外可见、荧光、红外光谱分析技术原理析技术原理了解仪器结构和分类了解仪器结构和分类熟练掌握常用仪器的使用方法和注意事熟练掌握常用仪器的使用方法和注意事项项吉林大学生物基础实验教学中心吉林大学生物基础实验教学中心实验原理实验原理 构构成成物物质质的的分分子子、原原子子或或离离子子经经辐辐射射能能照照射射后后物物质质的的总总能能量量就就会会发发生生变变化化，在在能能量量相相互互转转化化的的过过程程中中产产生生辐辐射射信信号号或或引引起起辐辐射射信信号号变变化化。根根据据产产生生的的辐辐射射信信号号或或引引起起信信号号变变化化，均均可可进进行光谱分析。行光谱分析。1 1、光谱的分类、光谱的分类 根据光的基本性质和它在传递能量过程所发生的变化和引起根据光的基本性质和它在传递能量过程所发生的变化和引起波长或传播方向的差异，可以将光谱分为波长或传播方向的差异，可以将光谱分为3 3大类，即发射光谱、大类，即发射光谱、吸收光谱和散射光谱。吸收光谱和散射光谱。（1 1）发射光谱构成物质的分子、原子或离子，经辐射能照射吸）发射光谱构成物质的分子、原子或离子，经辐射能照射吸收了能量，由基态能级转变成激发态能级后，处于激发态的物收了能量，由基态能级转变成激发态能级后，处于激发态的物质内部能量比原来能量多，处于不稳定状态，需要把吸收多余质内部能量比原来能量多，处于不稳定状态，需要把吸收多余的能量释放出去，再回到稳定的基态。因此，在该物质由激发的能量释放出去，再回到稳定的基态。因此，在该物质由激发态回到基态的过程中，系统内以光的形式释放多余的能量，并态回到基态的过程中，系统内以光的形式释放多余的能量，并产生相对应波长的光谱，这种光谱称之为发射光谱产生相对应波长的光谱，这种光谱称之为发射光谱 吉林大学生物基础实验教学中心吉林大学生物基础实验教学中心（2 2）吸收光谱构成物质的分子，原子或离子等在辐射能的照射下，）吸收光谱构成物质的分子，原子或离子等在辐射能的照射下，在系统内吸收外界能量的过程中，所对应吸收的波长产生光谱，在系统内吸收外界能量的过程中，所对应吸收的波长产生光谱，称之为吸收光谱。称之为吸收光谱。（3）散射光谱构成物质的分子、原子或离子，经辐射能照射后，系统内散射出来的能量产生相对应波长的光谱，称之为散射光谱。散射光谱主要是以拉曼散射为基础形成的光谱，它主要分布在红外区，属于分子散射光谱2 2、吸收光谱相关理论、吸收光谱相关理论(1)(1)光谱分析的常用术语光谱分析的常用术语 消光系数消光系数 是溶液对光吸收的比例常数，是指在一定的浓度和是溶液对光吸收的比例常数，是指在一定的浓度和波长等条件下物质的光吸收值，用波长等条件下物质的光吸收值，用K K表示。表示。K K值取决于溶质性质、值取决于溶质性质、入射光波长和温度。入射光波长和温度。吸光度吸光度 又称光密度又称光密度(OD)(OD)或吸光值或吸光值(A)(A)，表示溶液吸收光的强弱，表示溶液吸收光的强弱或吸收程度，也有用或吸收程度，也有用E E表示。表示。E E值愈大，溶液对光吸收的程度愈值愈大，溶液对光吸收的程度愈大。大。摩尔消光系数摩尔消光系数 溶液浓度为溶液浓度为mol/Lmol/L，光程厚度为，光程厚度为lcmlcm时的消光系时的消光系数，其单位是数，其单位是L/(mol.cm)L/(mol.cm)，用，用表示。表示。值是物质的一个特征值是物质的一个特征常数，由物质的性质与光的波长而定。同一物质在不同的波长常数，由物质的性质与光的波长而定。同一物质在不同的波长所测得的所测得的值不同。一般采用值不同。一般采用值最大的波长进行比色测定。值最大的波长进行比色测定。吉林大学生物基础实验教学中心吉林大学生物基础实验教学中心（2 2）吸收光谱构成物质的分子，原子或离子等在辐射能的照射下，）吸收光谱构成物质的分子，原子或离子等在辐射能的照射下，在系统内吸收外界能量的过程中，所对应吸收的波长产生光谱，在系统内吸收外界能量的过程中，所对应吸收的波长产生光谱，称之为吸收光谱。称之为吸收光谱。（3）散射光谱构成物质的分子、原子或离子，经辐射能照射后，系统内散射出来的能量产生相对应波长的光谱，称之为散射光谱。散射光谱主要是以拉曼散射为基础形成的光谱，它主要分布在红外区，属于分子散射光谱2 2、吸收光谱相关理论、吸收光谱相关理论(1)(1)光谱分析的常用术语光谱分析的常用术语 消光系数消光系数 是溶液对光吸收的比例常数，是指在一定的浓度和是溶液对光吸收的比例常数，是指在一定的浓度和波长等条件下物质的光吸收值，用波长等条件下物质的光吸收值，用K K表示。表示。K K值取决于溶质性质、值取决于溶质性质、入射光波长和温度。入射光波长和温度。吸光度吸光度 又称光密度又称光密度(OD)(OD)或吸光值或吸光值(A)(A)，表示溶液吸收光的强弱，表示溶液吸收光的强弱或吸收程度，也有用或吸收程度，也有用E E表示。表示。E E值愈大，溶液对光吸收的程度愈值愈大，溶液对光吸收的程度愈大。大。摩尔消光系数摩尔消光系数 溶液浓度为溶液浓度为mol/Lmol/L，光程厚度为，光程厚度为lcmlcm时的消光系时的消光系数，其单位是数，其单位是L/(mol.cm)L/(mol.cm)，用，用表示。表示。值是物质的一个特征值是物质的一个特征常数，由物质的性质与光的波长而定。同一物质在不同的波长常数，由物质的性质与光的波长而定。同一物质在不同的波长所测得的所测得的值不同。一般采用值不同。一般采用值最大的波长进行比色测定。值最大的波长进行比色测定。吉林大学生物基础实验教学中心吉林大学生物基础实验教学中心百分消光系数百分消光系数 是指被测物质的浓度以质量浓度表示时的是指被测物质的浓度以质量浓度表示时的消光系数。当溶液浓度为消光系数。当溶液浓度为1g/100ml1g/100ml，光程为，光程为1cm1cm时的消光时的消光系数，其单位是系数，其单位是lOOmL/(g.cmlOOmL/(g.cm)，用，用 表示。值是生物大分表示。值是生物大分子常用的消光系数，由于生物大分子的分子量太大，一般子常用的消光系数，由于生物大分子的分子量太大，一般不用摩尔浓度，而用百分浓度表示，所以测定时用表示，不用摩尔浓度，而用百分浓度表示，所以测定时用表示，它是表示生物大分子的一个特征常数。光吸收它是表示生物大分子的一个特征常数。光吸收 当一定波当一定波长的光通过某介质时，该介质有选择地吸收某一波长的光，长的光通过某介质时，该介质有选择地吸收某一波长的光，使入射光的强度减弱，这种现象称为光吸收。一束连续光使入射光的强度减弱，这种现象称为光吸收。一束连续光经棱镜色散后所得到的光谱中，就出现一处或几处暗的部经棱镜色散后所得到的光谱中，就出现一处或几处暗的部分谱带，这种通过介质的光呈现出射光，透过介质产生的分谱带，这种通过介质的光呈现出射光，透过介质产生的光谱就吸收光谱。紫外光谱就吸收光谱。紫外-可见分光光度测定法就是分子吸可见分光光度测定法就是分子吸收光谱，属于带光谱。收光谱，属于带光谱。光互补色光互补色 溶液颜色与相应颜色的单色光生成互补色一白溶液颜色与相应颜色的单色光生成互补色一白光，这种物理现象称之为光互补色。光，这种物理现象称之为光互补色。吉林大学生物基础实验教学中心吉林大学生物基础实验教学中心(2)(2)朗伯朗伯-比耳比耳 (Lambert-Beer)(Lambert-Beer)定律定律朗伯朗伯-比耳定律，也称之为光吸收定律。在一定的条件比耳定律，也称之为光吸收定律。在一定的条件下，一束单色光通过吸收介质的溶液后，因吸收介质下，一束单色光通过吸收介质的溶液后，因吸收介质吸收部分光能，引起该单束光的强度降低。吸收介质吸收部分光能，引起该单束光的强度降低。吸收介质的厚度和吸光物质的浓度与光降低的程度成正比。用的厚度和吸光物质的浓度与光降低的程度成正比。用公式表示：公式表示：A AKcLKcL式中式中 AA吸光值；吸光值；KK常数；常数；cc溶液浓度；溶液浓度；LL光程。光程。朗伯朗伯-比耳定律同时反映了溶液厚度比耳定律同时反映了溶液厚度L L和浓度和浓度c c对光吸收对光吸收的关系，其数值随光的波长、溶液浓度和溶液的性质的关系，其数值随光的波长、溶液浓度和溶液的性质变化而变化。变化而变化。吉林大学生物基础实验教学中心吉林大学生物基础实验教学中心(3)(3)化合物的吸收特性化合物的吸收特性 发色基团发色基团(chromophoricchromophoric group)group)，亦称生色基团。亦称生色基团。它是指有机化合物或生物大分子中的某些基团，在紫它是指有机化合物或生物大分子中的某些基团，在紫外外-可见光波区具有特殊的吸收峰，这些基团称为发色可见光波区具有特殊的吸收峰，这些基团称为发色团。在生色基团的结构中，含有非键轨道和团。在生色基团的结构中，含有非键轨道和分子轨分子轨道的电子体系，能引起和的电子跃迁，如酮基、醛基、道的电子体系，能引起和的电子跃迁，如酮基、醛基、羧基、硝基等基团中的双键，均具有生色效应。如果羧基、硝基等基团中的双键，均具有生色效应。如果一个化合物的分子含有多个生色基团，但它们并不发一个化合物的分子含有多个生色基团，但它们并不发生共轭作用，则该化合物的吸收光谱将包括这些个别生共轭作用，则该化合物的吸收光谱将包括这些个别生色基团原有的吸收带，这些吸收带的位置及强度互生色基团原有的吸收带，这些吸收带的位置及强度互相影响不大。相影响不大。吉林大学生物基础实验教学中心吉林大学生物基础实验教学中心 助色基团助色基团(auxochromicauxochromic group),group),有机化合物的某些基团本身有机化合物的某些基团本身并不产生特殊吸收峰，但与发色团同存于同一分子中时，能引并不产生特殊吸收峰，但与发色团同存于同一分子中时，能引起生色集团吸收峰发生位移和光吸收的强度增加，这些基团称起生色集团吸收峰发生位移和光吸收的强度增加，这些基团称为助色团。如为助色团。如-OHOH、-NH-NH2 2、-SH-SH及一些卤元素等。这些基团的共及一些卤元素等。这些基团的共同特点是在分子中都有孤对电子，它们能与生色基团中的同特点是在分子中都有孤对电子，它们能与生色基团中的电电子相互作用，发生电子跃迁，导致能量下降并引起吸收峰位移。子相互作用，发生电子跃迁，导致能量下降并引起吸收峰位移。吸收峰向波长的方向发生位移，亦称向红发生位移。如果吸收吸收峰向波长的方向发生位移，亦称向红发生位移。如果吸收峰向波长短的方向发生位移，亦称向紫发生位移。峰向波长短的方向发生位移，亦称向紫发生位移。红移及蓝移红移及蓝移 某些化合物通过取代反应引入了含有未共享电子某些化合物通过取代反应引入了含有未共享电子对的基团之后，如对的基团之后，如-OHOH、-NH-NH2 2、-SH-SH、ClCl、-OR-OR、-SR-SR等，能使该等，能使该化合物的最大吸收峰的波长化合物的最大吸收峰的波长maxmax向长波长的方向移动。这种现向长波长的方向移动。这种现象称之为红移效应，这个化合物的基团成为向红基团。与红移象称之为红移效应，这个化合物的基团成为向红基团。与红移效应相反，某些化合物的生色基团的碳原子一端引入了某些取效应相反，某些化合物的生色基团的碳原子一端引入了某些取代基以后，如代基以后，如C=OC=O基，能使该化合物的最大吸收峰的波长基，能使该化合物的最大吸收峰的波长maxmax向短波长的方向移动。这种现象称之为蓝移效应向短波长的方向移动。这种现象称之为蓝移效应，吉林大学生物基础实验教学中心吉林大学生物基础实验教学中心(4)(4)仪器的测量误差仪器的测量误差任任何何光光学学仪仪器器都都具具有有一一定定的的测测量量误误差差。在在实实验验过过程程中中由由于于电电源源不不稳稳定定，引引起起光光源源能能量量的的波波动动或或光光电电倍倍增增管管老老化化等等原原因因，使使仪仪器器显显示示参参数数重重现现性性差差，造造成成测测试试数数据据不不准准确确。尤尤其其是是光光源源偶偶尔尔变变化化，对对测测定定结结果果影影响响较较大大。当当试试样样浓浓度度过过大大或或过过稀稀时时引引起起的的误误差差更更大大，臣臣此此，在在测测定定时时选选择择合合适适的的吸吸光光度度测测量量范范围围是是很很重重要要的的。根根据据朗朗伯伯一一比比耳耳定定律律可可知知，当当测测定定值值的的吸吸光光值值A=0.434A=0.434时时，测测量量误误差差最最小小。如如果果仪仪器器的的读读数数误误差差为为1 1，要要求求测测量量误误差差少少于于5 5，就就要要将将待待测测液液的的透透光光率率控控制制在在70701010，吸吸光光值值在在0.150.151.001.00。因因此此在在操操作作过过程程中中可可以以通通过过调调节节浓浓度度或或选选用用不不同同厚厚度度的的光光程程的的方方法法使使透透过过率率落落在在最最佳佳的的测定区域内。测定区域内。此外，还要选择合适的检测波长和狭缝宽度，以最强吸收此外，还要选择合适的检测波长和狭缝宽度，以最强吸收带的最大吸收波长为入射光的波长，以得到最大测量灵敏度带的最大吸收波长为入射光的波长，以得到最大测量灵敏度为准。一般情况，狭缝宽度是测试时试样吸收峰半宽度的为准。一般情况，狭缝宽度是测试时试样吸收峰半宽度的1/101/10为最佳。为最佳。吉林大学生物基础实验教学中心吉林大学生物基础实验教学中心3、分子发生光谱-荧光光谱相关理论(1)荧光和磷光当当物物质质被被辐辐射射能能照照射射后后，分分子子内内部部获获得得外外源源能能量量，基基态态分分子子能能级级的的电电子子跃跃迁迁到到较较高高能能爱爱转转变变成成激激发发态态分分子子能能级级，使使分分子子处处在在高高能能域域不不稳稳定定状状态态，因因此此，它它必必须须要要释释放放多多余余的的能能量量变变成成稳稳定定状状态态分分子子。在在由由激激发发态态能能级级回回到到基基态态能能级级的的过过程程中中以以光光的的形形式式释释放放多多余余的的能能量量，并并发发射射出出比比原原波波长长更更长长的的光光谱谱，这这一一过过程程称称为为分分子子发发光光。以以检检测测分分子子发发射射光光谱谱的的分分析析疗疗法法称称为为荧荧光光光光度度分分析析法法。它它涉涉及及工工农农业业、环环境境保保护护、原原煤煤、地地矿矿、石石油油、化化学学及及生生物物等等。对对分分析析对对象象而而言言，包包括括无无机机化化合合物物、有有机机化化合合物物、药药物物分分析析、糖糖类类、维维生生素素、激激素素、氨氨基基酸酸、蛋蛋白白质质、核核酸酸等等物质。物质。吉林大学生物基础实验教学中心吉林大学生物基础实验教学中心 (2)(2)荧光分析的特点荧光分析的特点专专一一性性 强强荧荧光光分分析析法法是是利利用用荧荧光光物物质质的的发发光光性性质质来来检检测其发射光谱，使测定的物质更具有特性。测其发射光谱，使测定的物质更具有特性。灵灵敏敏度度高高 测测定定同同样样浓浓度度物物质质的的含含量量，通通常常比比吸吸收收光光谱谱灵敏度高灵敏度高2 24 4个数量级左右。个数量级左右。选选择择性性强强 荧荧光光分分析析既既可可以以分分析析发发射射光光谱谱，也也可可分分析析激激发发光光谱谱，还还可可分分析析偏偏振振光光谱谱。如如果果某某几几个个物物质质的的发发射射光光谱谱相相似似，难难以以做做出出判判断断，就就可可以以测测量量其其激激发发光光谱谱或或偏偏振振光谱等。光谱等。发发光光方方式式多多 荧荧光光物物质质有有物物理理发发光光、化化学学发发光光、生生物物发发光。光。可可分分析析参参数数多多 可可分分析析荧荧光光光光谱谱、荧荧光光强强度度、荧荧光光效效率率、荧荧光光寿寿命命等等多多种种物物理理参参数数。根根据据这这些些参参数数，可可以以从从不不同同角度研究分子的各种信息。角度研究分子的各种信息。吉林大学生物基础实验教学中心吉林大学生物基础实验教学中心 (4)(4)荧光分析方法荧光分析方法定定量量分分析析 利利用用荧荧光光分分子子发发射射荧荧光光的的强强弱弱进进行行定定量量测测定定，其其基基本本原原理理与紫外与紫外-可见分光光度分析法相仿。主要有标准曲线法和内标法两种。可见分光光度分析法相仿。主要有标准曲线法和内标法两种。a.a.标标准准曲曲线线法法 荧荧光光测测定定多多采采用用标标准准曲曲线线法法，即即以以已已知知量量的的标标准准荧荧光光物物质质经经过过同同样样的的处处理理后后，配配成成系系列列的的不不同同浓浓度度的的标标准准溶溶液液，将将在在荧荧光光光光度度计计上上测测得得的的值值绘绘制制标标准准曲曲线线。然然后后在在同同样样条条件件下下测测得得的的未未知知样样品品值值，在在标标准准曲曲线线上上查查得得量量，求求出出荧荧光光物物质质的的浓浓度度。b.b.内内标标法法 通通常常一一定定的的浓浓度度范范围围内内(在在荧荧光光标标准准曲曲线线的的浓浓度度范范围围内内)，选选择择一一个个合合适适的的标标准准样样品品浓浓度度，将将其其在在荧荧光光光光度度计计上上测测得得的的值值与与在在同同样样条条件件下下的的未未知知样样品品的的值值进进行行比比较较，通通过过公公式式计计算算出出未未知知样样品品的的浓浓度。度。未知样品浓度未知样品浓度(mgmgmLmL)=(A)=(A1 1A A2 2)c )c 式中式中 A A1 1未知样品的荧光发光值；未知样品的荧光发光值；A A2 2标准样品的荧光发光值；标准样品的荧光发光值；cc标准样品浓度。标准样品浓度。定定性性分分析析 根根据据荧荧光光发发射射的的波波长长和和出出现现的的峰峰位位，确确定定物物质质结结构构的的某某些些特征。特征。吉林大学生物基础实验教学中心吉林大学生物基础实验教学中心 仪器结构与分类仪器结构与分类 光谱分析仪器的基本构造v凡凡是是用用于于研研究究光光的的吸吸收收、发发射射和和散散射射的的强强度度与与波波长长关关系系的的仪仪器器，均均称称之之为为光光谱谱仪仪或或分分光光光光度度计计。这这些些仪仪器器通通常常都都是是由由光光源源、单单色色器器、样样品品室室、检检测测器器和和显显示示器器等等5 5个基本单元组成。个基本单元组成。吉林大学生物基础实验教学中心吉林大学生物基础实验教学中心2 2、分类、分类任任何何光光谱谱分分析析都都包包含含三三个个主主要要过过程程：（1 1）能能源源提提供供能能量量，（2 2）能能量量与与被被测测物物质质相相互互作作用用，（3 3）产产生生被被检检测的讯号。测的讯号。因因此此，按按能能源源不不同同，光光谱谱分分析析法法可可分分为为红红外外分分光光光光度度计计、紫紫外外-可可见见分分光光光光度度计计、X X光光衍衍射射仪仪及及化化学学发发光光等等光谱法；光谱法；按被作用物质来分，可分为原子光谱和分子光谱；按被作用物质来分，可分为原子光谱和分子光谱；以产生的被检测讯的辐射能的基本性质来划分，则可以产生的被检测讯的辐射能的基本性质来划分，则可分为吸收、发射、散射、折射、反射、干涉、衍射和分为吸收、发射、散射、折射、反射、干涉、衍射和偏振等。偏振等。吉林大学生物基础实验教学中心吉林大学生物基础实验教学中心实验室通常按使用波长将吸收光谱仪器分为：实验室通常按使用波长将吸收光谱仪器分为：1.1.可见分光光度计可见分光光度计(330(330-800nm)-800nm)；如如723723型可见分光光度计型可见分光光度计 2.2.紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计 如如752N752N紫外可见分光光度计紫外可见分光光度计 3.3.紫外紫外-可见可见-近红外分光光度计近红外分光光度计(190(190-3200nm)-3200nm)4 4.红外光谱仪红外光谱仪(0.75(0.75-1 000-1 000 m)m)5.5.荧光分光光度计荧光分光光度计吉林大学生物基础实验教学中心吉林大学生物基础实验教学中心 荧光分光光度计荧光分光光度计通通常常是是检检测测发发射射光光谱谱为为特特征征，也也可可以以检检测测吸吸收收光光谱谱。因因此此，其其基基本本结结构构与与紫紫外外分分光光光光度度计计十十分分相相似似，主主要要是是由由激激发发光光源源、激激发发单单色色器器、样样品品池池、发发射射单单色色器器、检测器以及显示系统几部分组成。检测器以及显示系统几部分组成。荧荧光光分分光光光光度度计计常常用用的的光光源源有有钨钨灯灯、碘碘钨钨灯灯、氢氢灯灯、氚氚灯灯、汞汞灯灯、氙氙灯灯、激激光光等等。但但就就光光源源而而言言，紫紫外外光光源使用最多。源使用最多。虽虽然然荧荧光光分分光光光光度度计计和和紫紫外外分分光光光光度度计计在在结结构构上上有有许许多多相相似似之之处处，但但在在设设计计上上还还是是有有一一定定的的区区别别。荧荧光光分分光光光光度度计计结结构构是是根根据据发发射射光光谱谱的的特特点点而而设设计计的的，紫紫外外分分光光光光度度计计是是根根据据吸吸收收光光谱谱设设计计的的。二二者者之之间间的的差差异异主要有以下主要有以下3 3点。点。吉林大学生物基础实验教学中心吉林大学生物基础实验教学中心测测光光角角度度不不同同 荧荧光光分分光光光光度度计计的的检检测测器器的的位位置置与与入入射射光光源源方方向向成成9090角角，其其对对面面的的背背景景为为暗暗背背景景。紫紫外外分分光光光光度度计计的的检检测测器器的的位位置置与与入入射射光光源源方方向向平平行行，其其对对面的背景为亮背景。面的背景为亮背景。单单色色器器位位置置不不同同 荧荧光光分分光光光光度度计计的的单单色色器器设设在在检检测测器器前前面面，样样品品的的发发射射光光经经单单色色器器分分光光后后进进人人检检测测器器，这这样样可可以以除除去去样样品品发发射射以以外外的的辐辐射射，使使分分析析更更有有专专一一性性。紫紫外外分分光光光光度度计计的的单单色色器器设设在在样样品品池池前前面面，光光束束先进入分光器分光后再进入样品池。先进入分光器分光后再进入样品池。比比色色杯杯不不同同 荧荧光光分分光光光光度度计计使使用用的的样样品品池池是是四四面面透透光光的的样样池池，它它可可以以作作为为紫紫外外分分光光光光度度计计的的样样品品池池。紫紫外外分分光光光光度度计计使使用用的的样样品品池池是是两两面面透透光光的的样样池池，它它不不能作为荧光分光光度计的样品池。能作为荧光分光光度计的样品池。吉林大学生物基础实验教学中心吉林大学生物基础实验教学中心仪器操作规程仪器操作规程752752型型紫紫外外光光栅栅分分光光光光度度计计为为例例介介绍绍常常用用光光谱谱仪仪器器的的使使用方法。用方法。吉林大学生物基础实验教学中心吉林大学生物基础实验教学中心使用方法使用方法（1 1）将灵敏度旋钮调置）将灵敏度旋钮调置“1 1”档档(放大倍率最小放大倍率最小)。（2 2）按按“电电源源”开开关关，(开开关关内内2 2只只指指示示灯灯亮亮)。钨钨灯灯点点亮亮；按按“氢氢灯灯”开开关关(开开关关内内左左侧侧指指示示灯灯亮亮)；氢氢灯灯电电源源接接通通，再再按按“氢氢灯灯触触发发”按按钮钮(开开关关内内右右侧侧指指示示灯灯亮亮)；氢灯点亮。仪器预热氢灯点亮。仪器预热3030分钟。分钟。（3 3）选择开关置于）选择开关置于“T T”。（4 4）打打开开试试样样室室盖盖(光光门门自自动动关关闭闭),),调调节节“0%0%”(T)T)旋旋钮，使数字显示字为钮，使数字显示字为“000.0000.0”。（5 5）将波长置于所需要测的波长。）将波长置于所需要测的波长。（6 6）将装有溶液的比色皿放置比色皿架中。）将装有溶液的比色皿放置比色皿架中。（7 7）盖上样品室盖，将参比溶液比色皿置于光路，调）盖上样品室盖，将参比溶液比色皿置于光路，调节透过率节透过率“100100”旋钮，旋钮，使数字显示为使数字显示为100.0%(100.0%(T),(T),(如如果显示不到果显示不到100.0%(100.0%(T)T)，则可适当增加灵敏度则可适当增加灵敏度的档数，的档数，同时应重复同时应重复“4 4”，调整仪器的，调整仪器的“000.0000.0”。吉林大学生物基础实验教学中心吉林大学生物基础实验教学中心（8 8）将将被被测测溶溶液液置置于于光光路路中中，数数字字显显示示器器上上直直接接读读出出被测溶液的透过率被测溶液的透过率(T)T)值。值。（9 9）吸吸光光度度的的测测量量：参参照照“4 4”和和“7 7”,调调整整仪仪器器的的“000.0000.0”和和“100.0100.0”。将将选选择择开开关关置置于于“A A”。旋旋动动吸吸光光度度调调整整旋旋钮钮，使使得得数数字字显显示示为为“000.0000.0”，然然后移入被测溶液，显示值即为试样的吸光度后移入被测溶液，显示值即为试样的吸光度A A值。值。（1010）浓浓度度C C的的测测量量:选选择择开开关关由由“A A”至至“C C”,将将已已标标定定浓浓度度的的溶溶液液移移入入光光路路,调调节节“浓浓度度”旋旋钮钮使使得得数数字字显显示示为为标标定定值值。将将被被测测溶溶液液移移入入光光路路，即即可可读读出出相相应应的浓度值。的浓度值。吉林大学生物基础实验教学中心吉林大学生物基础实验教学中心 注意事项注意事项1 1、波波长长在在360360nmnm以以上上时时,可可以以用用玻玻璃璃比比色色皿皿。波波长长在在360360nmnm以以下时下时,使用石英比色皿。使用石英比色皿。2 2、如如果果大大幅幅度度改改变变测测试试波波长长时时,需需要要等等数数分分钟钟后后,才才能能正正常常工工作作。（因因波波长长由由长长波波向向短短波波或或短短波波向向长长波波移移动动时时,光光能能量量变变化化急急剧剧,使使倍倍增增管管受受光光后后响响应应缓缓慢慢，需需一一移移光光响响应应平平衡时间）。衡时间）。3 3、仪仪器器在在使使用用时时,应应常常参参照照上上述述操操作作方方法法中中“4 4”和和“7 7”进进行调行调“000.0 000.0”和和“100.0100.0”的工作。的工作。4 4、每每台台仪仪器器所所配配套套的的比比色色皿皿不不能能与与其其它它仪仪器器上上的的比比色色皿皿单单个调换。个调换。5 5、本本仪仪器器数数字字显显示示后后背背部部带带有有外外接接插插座座,可可输输出出模模拟拟仪仪号号。插座插座1 1脚为正，脚为正，2 2脚为负接地线。脚为负接地线。6 6、对对由由于于在在运运输输搬搬运运过过程程中中引引起起光光源源偏偏移移和和吸吸光光度度斜斜率率的的偏移偏移,必须进行调整。必须进行调整。吉林大学生物基础实验教学中心吉林大学生物基础实验教学中心UV-3150UV-3150紫紫外外可可见见近近红红外外分分光光光光度度计计和和RF-5301PCRF-5301PC型型荧荧光光分分光光光光度度计计的的详详细细操操作作说说明明参参见见吉吉林林大大学学生生物物基基础础实实验验教教学学中中心心网网站站：http:/http:/上上相相关关课件。课件。吉林大学生物基础实验教学中心吉林大学生物基础实验教学中心752N紫外可见分光光度计紫外可见分光光度计 吉林大学生物基础实验教学中心吉林大学生物基础实验教学中心使用方法使用方法仪器使用前需开机预热仪器使用前需开机预热20-3020-30分钟。分钟。功能键作用：功能键作用：A/T/C/FA/T/C/F键：每按此键来切换键：每按此键来切换A,T,C,FA,T,C,F之间的值。其中之间的值。其中A,T,C,FA,T,C,F分分别为吸光度，透射比，浓度，斜率。别为吸光度，透射比，浓度，斜率。SDSD键：用于键：用于RS232RS232串行口和计算机传输数据和当处于串行口和计算机传输数据和当处于F F，并自动转，并自动转到到C,C,计算当时的计算当时的C C值（值（C=F*AC=F*A）/0%/0%键键:在在T T状态时，打开样品盖，按键调零。状态时，打开样品盖，按键调零。在在F F状态下，按本键状态下，按本键F F值会自动减值会自动减1 1，按住本键，加快速度，当，按住本键，加快速度，当F F值为值为0 0后，再按键它会自动变为后，再按键它会自动变为19991999，再按键开始自动减，再按键开始自动减1 1。/100%/100%键：在键：在A,TA,T状态时有效，关闭样品室盖，按键后调零和状态时有效，关闭样品室盖，按键后调零和100100。在在F F状态下，按本键状态下，按本键F F值会自动加值会自动加1 1，按住本键，加快速度，按住本键，加快速度，当当F F值为值为19991999后，再按键它会自动变为后，再按键它会自动变为0 0，再按键开始自动加，再按键开始自动加1 1。吉林大学生物基础实验教学中心吉林大学生物基础实验教学中心测定；测定；测定样品前分别测定比色皿（空白溶液或蒸馏水）的测定样品前分别测定比色皿（空白溶液或蒸馏水）的读数，记下数值。读数，记下数值。测定样品时，分别减去其值，以此校正比色皿偏差。测定样品时，分别减去其值，以此校正比色皿偏差。测定标准曲线时，需分别记下对应浓度的吸光度值，测定标准曲线时，需分别记下对应浓度的吸光度值，绘制标准曲线。或计算出曲线斜率绘制标准曲线。或计算出曲线斜率F.(F.(一般吸光度值一般吸光度值在在0.10.10.70.7之间较好之间较好)测定样品时，可利用标准曲线，通过吸光度直接求浓测定样品时，可利用标准曲线，通过吸光度直接求浓度。度。也可在计算出也可在计算出F F值后，在值后，在F F状态下，输入状态下，输入F F值，按值，按SDSD键键确定，然后自动回到确定，然后自动回到C C状态，假如所测的状态，假如所测的A A值为值为0 0。234234，则此时显示的，则此时显示的C C值为值为03510351。使用后先关闭机器开关，再切断电源。整理好后，盖使用后先关闭机器开关，再切断电源。整理好后，盖上仪器罩。上仪器罩。吉林大学生物基础实验教学中心吉林大学生物基础实验教学中心 注意事项注意事项在在330330370nm370nm用圆筒形滤光片套入样品空镜筒上，用圆筒形滤光片套入样品空镜筒上，其他波长不用使用。其他波长不用使用。在在380380780780可见区，可见区，200-380200-380近紫外近紫外 78078030003000近近红外，红外，10-20010-200远紫外，远紫外，300030003000030000中红外，中红外，3000030000300000300000远红外（电磁波谱）远红外（电磁波谱）每次用后检查样品室是否有溶液溢出，擦干。每次用后检查样品室是否有溶液溢出，擦干。不能把溶液，比色皿等放在仪器盖上，以防污染。不能把溶液，比色皿等放在仪器盖上，以防污染。测样时准备好洗瓶，废液缸，镜头纸，滤纸等，测样时准备好洗瓶，废液缸，镜头纸，滤纸等，及时洗净比色皿，使用后在培养皿中控干后，放及时洗净比色皿，使用后在培养皿中控干后，放入盒内。入盒内。填写使用记录本填写使用记录本吉林大学生物基础实验教学中心吉林大学生物基础实验教学中心723723型可见分光广度计型可见分光广度计 吉林大学生物基础实验教学中心吉林大学生物基础实验教学中心使用方法使用方法 插上电源，打开后面电源开关，连接打印开关，预热插上电源，打开后面电源开关，连接打印开关，预热3030分钟（注意：仪器开机时，因有自检和存基线，此分钟（注意：仪器开机时，因有自检和存基线，此时，样品室的盖不能打开，且样品室内应无异物，以时，样品室的盖不能打开，且样品室内应无异物，以免当住光路。每次关机前，为节省重新开机时间，免当住光路。每次关机前，为节省重新开机时间，最好把波长设定在最好把波长设定在550nm550nm，然后关机。），然后关机。）仪器自检：波长显示器上显示仪器自检：波长显示器上显示723c723c，从，从320-820nm320-820nm，回，回复到复到500nm.500nm.ABS.OABS.O100%T100%T3 3、消除偏差，零点校正：仪器要定量测试时，先把全、消除偏差，零点校正：仪器要定量测试时，先把全部装有参比溶液的比色皿插入样品架分别测定部装有参比溶液的比色皿插入样品架分别测定R R、S1S1、S2S2、S3 S3 分别按分别按 校正。校正。（也可用蒸馏水代替，测定后，比色皿顺序不能变）（也可用蒸馏水代替，测定后，比色皿顺序不能变）ABS.O100%T吉林大学生物基础实验教学中心吉林大学生物基础实验教学中心4、波长设定：、波长设定：输入波长数值输入波长数值 ENTER 5、T、A切换切换T/A 1 ENTER T/A 2 ENTER GOTOT/AT/A吉林大学生物基础实验教学中心吉林大学生物基础实验教学中心 3 ENTER 1 ENTER 3 ENTER 1 ENTER 输入测定样品序号输入测定样品序号分别按分别按 ENTERENTER 显示打印输出显示打印输出NO CONC ABS NO CONC ABS 样品样品放入后按放入后按START/STOP START/STOP 进行线性回归运算。分别打印输出进行线性回归运算。分别打印输出 K K值，值，B B值值 R*RR*R值值 样品架插入样品样品架插入样品 START/STOP START/STOP 显示输出值显示输出值 乘以初始浓度即得测定浓度乘以初始浓度即得测定浓度T/AT/A吉林大学生物基础实验教学中心吉林大学生物基础实验教学中心7、输入输入k k和和B B值的操作：值的操作：T/A 3 ENTER 2 T/A 3 ENTER 2 输入输入K K值值 ENTER ENTER 输入输入B B值值 ENTER ENTER 即可测定未知样浓度即可测定未知样浓度8 8、扫描、定时打印、扫描、定时打印吉林大学生物基础实验教学中心吉林大学生物基础实验教学中心注意事项：注意事项：拖动池架要到位。拖动池架要到位。每次用后检查样品室内是否有溶液溢出，擦干。每次用后检查样品室内是否有溶液溢出，擦干。注意检查干燥剂，及时更换。注意检查干燥剂，及时更换。不能把溶液放到仪器盖上，以防污染。正确使用比不能把溶液放到仪器盖上，以防污染。正确使用比色皿。色皿。及时洗净比色皿，不可用手、滤纸、毛刷等摩擦透及时洗净比色皿，不可用手、滤纸、毛刷等摩擦透光面，只能用绸布和擦镜纸擦。光面，只能用绸布和擦镜纸擦。测样时准备好洗瓶，废液缸，擦镜纸、滤纸等。测样时准备好洗瓶，废液缸，擦镜纸、滤纸等。如实填写实验记录本如实填写实验记录本吉林大学生物基础实验教学中心吉林大学生物基础实验教学中心UVPC2401UVPC2401UVPC2401UVPC2401紫外分光光度计紫外分光光度计紫外分光光度计紫外分光光度计 日本导津日本导津日本导津日本导津技术指标：技术指标：1.1.测试波长范围：测试波长范围：190-900nm190-900nm2.2.波长准确度：波长准确度：0.3nm 0.3nm 精度：精度：0.1nm0.1nm3.3.扫描速度：扫描速度：900-160nm/min 900-160nm/min 4.4.测量方式：双光速方式测量方式：双光速方式5.5.测光范围：吸光度测光范围：吸光度-4-5ABS -4-5ABS 透射率、透射率、反射率：反射率：0.0-999.9%0.0-999.9%6.6.测光准确度：测光准确度：0.002ABS(0-0.5ABS),0.002ABS(0-0.5ABS),0.004ABS(0.5-1.0ABS),0.004ABS(0.5-1.0ABS),0.3%T(0-100%)0.3%T(0-100%)7.7.测光精度：测光精度：0.001ABS(0-0.5ABS),0.001ABS(0-0.5ABS),0.002ABS(0.5-1.0ABS),0.01%T,0.002ABS(0.5-1.0ABS),0.01%T