实用高效液相色谱方法的建立.ppt

实用高效液相色谱方法的建立沈 菁湖北省农科院质标所介绍你们的工作使用的液相色谱仪型号？仪器配置：泵？检测器？从事行业？常量分析、痕量分析或跟踪？用到哪一类HPLC方法方法来源？开发过方法？主要内容HPLC基本知识方法建立的步骤色谱法的分离原理溶于流动相中的各组分经过固定相时，由于与固定相发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。HPLC以液体作为流动相的色谱分离方法。流动相具有运载样品分子和选择性分流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用。离的双重作用。HPLC的分类正相色谱正相色谱(NP-HPLC)反相色谱反相色谱(RP-HPLC)反相离子对色谱反相离子对色谱(RPIC)离子交换色谱离子交换色谱(IEC)空间排阻色谱空间排阻色谱(SEC)手性化合物分离模式手性化合物分离模式(Chiral separation mode)按两相极性不同按两相极性不同HPLC的特点HPLC具有分离效率高、分析速度快和应用范围广等特点适合于高沸点、大分子、强极适合于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分性和热稳定性差的化合物的分离分析离分析应用已成为化学、生化、医学、工业、农业、环保、商检和法检等学科领域中重要的分离技术我国药典收载HPLC项目和数量比较表方法项目数量1985版1990版1995版2000版2005版HPLC法鉴别934150检查1240160含量测定 760117387479农药产品标准中分析方法选择的趋势由气相改液相：毒死蜱、三唑磷等由光度法改液相：百草枯、草甘膦等目前，在大多数的实验室，HPLC方法的建立仍在靠经验进行。避免随意的“试验错误”法。对每次试验进行设计，以获得有用的信息HPLC方法建立的步骤方法建立的步骤1.有关样品的情况，明确分离目的2.是否需要特殊的HPLC步骤，样品预处理等？3.选择检测器5.优化分离条件6.检查出现的问题或所需的特殊步骤7.论证方法使之进入常规实验室4.选择液相色谱法，进行预试验，估计最佳分离条件1.有关样品成分和性质的重要情况所含化合物的数目化合物的化学结构（官能团）化合物的分子量化合物的pKa值化合物的UV光谱图-检测器选择样品基质的性质：溶剂，填充物等-是否需要前处理化合物在有关样品中的浓度范围样品的溶解度-流动相的兼容性 经经SPE净化，咪净化，咪鲜胺的鲜胺的TIC图图提取液直接进提取液直接进样，咪鲜胺的样，咪鲜胺的TIC图图样品基质对目标物保留值的影响样品基质对目标物保留值的影响明确分离目的主要目的是分析还是回收样品组分？是否已知样品所有成分的化学特性，或是否需定性分析？是否解析出样品的所有成分？如需定量分析，需精密度多高？本法用于几种样品剂型（原料、制剂、环保样品等）？需要一种以上的HPLC方法吗？本法将仅用于分析几种样品，还是许多种？将使用最终方法的常规实验室中，已有哪些HPLC设备和技术？2.样品的性质和需要的预处理p可直接进样的溶液p需稀释、缓冲pH或添加另一液体的溶液p能在流动相中溶解的固体p含有干扰物质或“损柱剂”而必须在进样前将其去除的溶液p含有不溶性赋形剂的混合物敌百虫的水解反应3.检测尽量使用UV检测器二极管阵列示差折光荧光电化学柱前或柱后衍生化应确保能检测到所分离的样品谱峰紫外吸收曲线选择合适的波长最小检测质量：达ng级最大允许样品量：100g吡虫啉吡虫啉UVUV多菌灵多菌灵UVUV一种化合物，使其峰的最大吸收值理想，可用该公式估计其最小的重量wm加强加强UVUV检测能力检测能力每日用强溶剂冲洗柱子预处理样品以排除其后期流出物梯度洗脱除去每次进样分析的晚期流出物杂质4.开始分离针对所测样品选择最有希望的HPLC方法和一支适宜的色谱柱适于不同样品的较好HPLC方法和色谱柱样品特性样品特性较好的HPLC方法/柱大分子量（大分子量（20002000道尔顿道尔顿）通常需要特殊柱；尺寸排阻和离子交换HPLC一般较好含有光学异构体（对映体）含有光学异构体（对映体）一般需特殊的手性柱含有其他异构体（立体、位置含有其他异构体（立体、位置等）等）一般正相柱最佳，尤其用原硅胶柱无机盐混合物无机盐混合物离子色谱法烃类烃类氨基柱加反相条件；离子交换树脂生物样品生物样品特殊条件常用于生命科学样品；然而，与其他小分子量化合物比较，可能不需要不同方法高效氯氰菊酯立体异构体精喹禾灵光学异构体*草甘膦（酸）阴离子百草枯阳离子化合物主要HPLC方法的特性方法/特点/色谱柱何时应用该方法反相反相HPLC首选为能溶于水/有机混合液的中性或非离子化合物流动相：水/有机溶剂色谱柱：C-18(ODS),C-8,苯基，三甲基硅烷(TMS),氰基离子对离子对HPLC为离子或可电离化合物，尤其碱性或阳离子化合物的良好选择流动相：水/有机溶剂 一种缓冲物控制pH，和离子对试剂色谱柱：C-18,C-8,氰基正相正相HPLC当反相或离子对HPLC无效时的第二个较好选择；首选为不溶于水/有机混合液的亲脂样品、异构体混合物和制备HPLC（硅胶最好）流动相：有机溶剂混合液 色谱柱：氰基，二醇基，氨基，硅胶次要HPLC方法的特性方法/特点/色谱柱何时应用该方法离子交换色谱法离子交换色谱法分离无机离子混合物的首选（离子色谱法）；分离蛋白质、核酸样品及有关化合物的良好首选流动相：水相，另以缓冲液控制pH值色谱柱：阴离子或阳离子交换尺寸排阻色谱法尺寸排阻色谱法用于大分子量样品，如蛋白质和人造聚合物的良好首选，也可用作测量分子量分布流动相：水相（凝胶滤过）或有机相（凝胶渗滤）色谱柱：凝胶滤过用二醇基 凝胶渗滤用聚苯乙烯或硅胶疏水疏水-相互作用色谱法相互作用色谱法用于分离蛋白质 流动相：盐溶液 色谱柱：类似于反相填料，但疏水性小得多选用反相：进第一个样品分离条件最好的首选目标色谱柱 尺寸（长度，内径）250.46cm 微粒大小5m 固定相C-8或C-18流动相 溶剂A/B水/乙腈%B可变可变 缓冲液（化合物，pH值，浓度）25mM磷酸盐，pH3.5 添加剂（离子对试剂，胺类）流速12mL/min温度40样品量 体积50L 质量100g流动相的比例？选溶剂强度适中的等度流动相：选溶剂强度适中的等度流动相：至少有可能使某些化合物流出至少有可能使某些化合物流出且具有合理的保留时间且具有合理的保留时间用强度大的等度流动相（如用强度大的等度流动相（如100%100%有机相），然后以有机相），然后以20%20%比比例递减有机相比例例递减有机相比例采用采用梯度洗脱梯度洗脱法分离最初样品法分离最初样品必要时选择缓冲液样品特性样品特性添加剂碱性化合物（如：胺类）碱性化合物（如：胺类）50mM磷酸盐缓冲液，30mM三乙胺（缓冲至pH=3.0）酸性化合物（如：羧酸）酸性化合物（如：羧酸）50mM磷酸盐缓冲液，1%w乙酸（缓冲至pH=3.0）酸和碱的混合物酸和碱的混合物50mM磷酸盐缓冲液，30mM三乙胺，1%w乙酸（缓冲至pH=3.0）阳离子盐类（如：四烷基季铵阳离子盐类（如：四烷基季铵盐化合物）盐化合物）30mM三乙胺，50mM硝酸钠阴离子盐类（如：烷基磺酸盐）阴离子盐类（如：烷基磺酸盐）1%乙酸，50mM硝酸钠反相流动相推荐反相流动相推荐HPLC方法建立的目标所有色谱峰间合适的分离度：Rs2.0适当的保留：1k10.5 如：分离时间在510min良好的方法耐用性与适应性 定量：含量测定2%（RSD）要求不高的或痕量分析5%压力：最好150bar 峰高：最好为信噪比大的窄峰 流动相尽可能简单，溶剂消耗少R=1.5 达基线分离色谱基础：分离度公式分离度影响因素理论塔板数N：最容易提升的因素选择因子：对分离度的影响最大容量因子k 改变键合相 改变流动相小结：先优化k，再，最后优化N，便可改变测定条件最常用的调节因素最常用的调节因素分离度与溶剂强度的关系避免k1:可能有干扰峰，基线经常不好，使定量困难k增大，操作时间延长，谱峰展宽，将使定量难以准确要适中建立方法之初，应测出k范围5.优化条件如果改变选择性，首选改变流动相 流动相的比例 流动相的种类 流动相pH其次是改变键合相品牌或种类色谱柱改变流动相比例流动相为乙腈-水体系改变流动相种类流动相为甲醇-水体系等强度的溶剂混合对分离的改善三元体系改变流动相pH酸酸HA H+A-(电中性电中性)(带电带电)碱碱B BH+OH-(电中性电中性)(带电带电)离子对HPLC中的溶剂优化通过改变离子对试剂在流动相中的浓度通过改变流动相pH柱“强度”改变色谱柱种类C18-C18-柱柱36%36%乙腈乙腈/水水 苯基柱苯基柱29%29%乙腈乙腈/水水 氰基柱氰基柱20%20%乙腈乙腈/水水溶解样品的溶剂对谱峰的影响归纳：可重现的分离在方法建立过程中，改变实验条件（流动相、色谱柱、温度）时，必须经过足够长的时间，使色谱柱在新流动相和温度下达到平衡。通常1020倍的柱体积。应在同一条件下，经过重复实验得到证实。6.完善方法定量与方法论证解决出现的问题方法的普适性提供一个精密准确、稳定可靠可移植转让的严格HPLC方法建立一个用于日常工作或质量监控方法应：（1）预备数据表明所需方法的性能（2）为其他操作者使用的书面分析步骤（3）以一个以上的系统/操作者，用那些包括成分或分析浓度期望范围的样品，系统地论证方法的性能；得出日间和实验室间的数据（4）得到柱的期望寿命和柱间重现性的数据（5）研究不正常的结果以纠正潜在问题（6）研究所有影响分离的条件（温度，流动相组成，pH等）；规定这些条件的限度；对可能发生的问题（关键谱峰对分离不足，最末谱峰随操作次数增多而保留值延长等）提出建议措施药典对方法的要求首选填料为C18，并至少对两根不同品牌的色谱柱进行比较试验，其中一根为国产柱。流动相首选甲醇-水系统，应尽可能少用含有缓冲液的流动相，如为碱性药物，流动相的pH值应为78；如为酸性药物，流动相的pH值应为34。尽可能选用流动相作为溶剂，如未能选用，应说明原因。检测器首选UV检测器。7.检查问题谱峰宽谱峰严重拖尾同一品牌同一规格柱不能重现柱子寿命短