形成酶标抗体抗原上课讲义.ppt

第七章第七章酶免疫分析技术酶免疫分析技术雅安职业技术学院雅安职业技术学院目目录录 第一节第一节 概述概述 第二节第二节 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验 第三节第三节 其他酶标记免疫测定技术其他酶标记免疫测定技术 雅安职业技术学院雅安职业技术学院酶免疫分析技术的分类酶免疫分析技术的分类克隆酶供体免疫测定克隆酶供体免疫测定酶免疫分析技术酶免疫分析技术酶免疫组织化学技术酶免疫组织化学技术酶免疫测定技术酶免疫测定技术均相酶免疫测定均相酶免疫测定非均相酶免疫测定非均相酶免疫测定酶放大免疫测定技术酶放大免疫测定技术液相酶免疫测定液相酶免疫测定固相酶免疫测定固相酶免疫测定3第一节第一节 概述概述一、基本原理一、基本原理 酶免疫分析技术的酶免疫分析技术的原理原理是利用酶标记抗体是利用酶标记抗体(抗原抗原)形成酶标抗体形成酶标抗体(抗原抗原)结合物，此结合物既结合物，此结合物既保留抗体保留抗体(抗原抗原)的免疫活性，又保留了酶对底物的免疫活性，又保留了酶对底物的催化活性。酶标抗体的催化活性。酶标抗体(抗原抗原)与相应抗原与相应抗原(抗体抗体)进行反应后，酶催化相应的底物显色，借助酶作进行反应后，酶催化相应的底物显色，借助酶作用于底物的用于底物的显色反应显色反应来判定结果。来判定结果。雅安职业技术学院雅安职业技术学院二、酶和酶底物二、酶和酶底物 标记酶的要求：标记酶的要求：活性高，纯度高活性高，纯度高作用专一性强作用专一性强性质稳定，易与抗原或抗体偶联性质稳定，易与抗原或抗体偶联测定方法简便易行、敏感、精确测定方法简便易行、敏感、精确酶和底物对人体无害酶和底物对人体无害酶和底物价廉易得酶和底物价廉易得雅安职业技术学院雅安职业技术学院（一）辣根过氧化物酶（一）辣根过氧化物酶 （horseradish peroxidase,HRP）2.2.糖蛋白（主酶）糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基）亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心辅基是酶的活性中心3.3.RZ值：值：403403nm(辅基辅基)与与275275nm(主酶主酶)OD值之比值之比 4.4.RZ值与酶活性无关，酶活性单位比值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要值更为重要 1.ELISA中中应用最为广泛应用最为广泛的标记用酶的标记用酶 雅安职业技术学院雅安职业技术学院 DH2十H2O2D十2H20HRP催化的反应式为：催化的反应式为：DH2 2为供氢体，习惯称为底物，为供氢体，习惯称为底物，H2 2O2 2为受氢体为受氢体HRP对受氢体的专一性很高，作用底物有多种。对受氢体的专一性很高，作用底物有多种。雅安职业技术学院雅安职业技术学院邻苯二胺邻苯二胺 OPD四甲基联苯胺四甲基联苯胺 TMB5-5-氨基水杨酸氨基水杨酸5-5-ASA 2,2-2,2-氨基氨基-二二(3-(3-乙基乙基-苯并噻唑苯并噻唑啉磺酸啉磺酸-6)-6)铵盐铵盐 ABTSHRP常用底物常用底物雅安职业技术学院雅安职业技术学院OPD反应后显反应后显橙黄色橙黄色，加酸终止反应后呈，加酸终止反应后呈棕黄棕黄色色，测定波长，测定波长492492nm。不稳定，有致癌性。不稳定，有致癌性。TMB反应后显反应后显蓝色蓝色 ，加酸终止反应后变为，加酸终止反应后变为黄色黄色黄色黄色,测定波长测定波长450450nm，稳定，无致癌性，稳定，无致癌性，ELISA中应中应用最广泛的底物。用最广泛的底物。雅安职业技术学院雅安职业技术学院（二）碱性磷酸酶（二）碱性磷酸酶 （alkaline phosphatase，AP)是一种磷酸酯水解酶，从大肠杆菌提取是一种磷酸酯水解酶，从大肠杆菌提取 AP的的 底物底物 对对-硝基苯磷酸硝基苯磷酸酯（酯（pNPP）经经APAP作用后的产物为黄色对作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为硝基酚，最大吸收峰波长为405 405 nm。雅安职业技术学院雅安职业技术学院（三）（三）-半乳糖苷酶半乳糖苷酶（-galactosidase，-Gal）源于大肠埃希菌源于大肠埃希菌 ，常用于均相酶免疫测定。，常用于均相酶免疫测定。-Gal的底物的底物 4-4-甲基伞酮基甲基伞酮基-D半半-乳糖苷（乳糖苷（4MUG）酶作用后，生成高强度荧酶作用后，生成高强度荧光物光物 ，用荧光计测量。，用荧光计测量。雅安职业技术学院雅安职业技术学院（四）其他酶（四）其他酶 在商品试剂中，经常应用的酶还有葡萄糖氧在商品试剂中，经常应用的酶还有葡萄糖氧化酶、化酶、6-6-磷酸葡萄糖脱氢酶、溶菌酶、青霉素磷酸葡萄糖脱氢酶、溶菌酶、青霉素酶、脲酶、苹果酸脱氢酶等。酶、脲酶、苹果酸脱氢酶等。雅安职业技术学院雅安职业技术学院三、酶标抗体三、酶标抗体(抗原抗原)的制备的制备制备要求：制备要求：抗原要求纯度高、抗原性强。抗原要求纯度高、抗原性强。抗体则要求特异性强、效价高、亲和力强、抗体则要求特异性强、效价高、亲和力强、易于分离纯化和批量生产。易于分离纯化和批量生产。雅安职业技术学院雅安职业技术学院（一）常用的标记方法（一）常用的标记方法标记方法要求：标记方法要求：方法简单，产率高方法简单，产率高不影响酶和抗体不影响酶和抗体(抗原抗原)的生物活性的生物活性所得酶结合物稳定，本身不发生聚合所得酶结合物稳定，本身不发生聚合较少形成酶与酶、抗体与抗体或抗原与抗原的较少形成酶与酶、抗体与抗体或抗原与抗原的 聚合物聚合物雅安职业技术学院雅安职业技术学院1 1过碘酸钠氧化法过碘酸钠氧化法 仅用于仅用于HRP的标记。可与抗体蛋白的游离氨的标记。可与抗体蛋白的游离氨基结合，形成基结合，形成HRP-CH2-NH-IgG。此法酶标记物。此法酶标记物产率较高，但纯化后仍有少量游离产率较高，但纯化后仍有少量游离IgG，部分结，部分结合物可能聚合，抗体的活性可能有所降低。合物可能聚合，抗体的活性可能有所降低。雅安职业技术学院雅安职业技术学院2 2戊二醛交联法戊二醛交联法 戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与酶和抗体（抗原）分子上的氨基结合。该法有一酶和抗体（抗原）分子上的氨基结合。该法有一步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶标记物质量较均一。标记物质量较均一。雅安职业技术学院雅安职业技术学院（二）酶标记物的纯化与鉴定（二）酶标记物的纯化与鉴定 1 1酶标记物的纯化酶标记物的纯化 标记完成后应除去反应溶液中的游离酶、游离标记完成后应除去反应溶液中的游离酶、游离抗体抗体(抗原抗原)、酶聚合物及抗体、酶聚合物及抗体(抗原抗原)聚合物，聚合物，避避免免游离酶增加非特异显色以及游离抗体游离酶增加非特异显色以及游离抗体(抗原抗原)的的竞争作用。竞争作用。常用的纯化方法有葡聚糖凝胶层析法和饱和常用的纯化方法有葡聚糖凝胶层析法和饱和硫酸铵沉淀法等。硫酸铵沉淀法等。雅安职业技术学院雅安职业技术学院 2.2.酶标记物的鉴定酶标记物的鉴定（1 1）免疫活性鉴定：免疫活性鉴定：常用免疫电泳或双向免疫扩常用免疫电泳或双向免疫扩散法，出现沉淀线表示结合物中的抗体散法，出现沉淀线表示结合物中的抗体(抗原抗原)具有具有免疫活性。免疫活性。（2 2）酶标记率测定：酶标记率测定：用分光光度法分别测定结合用分光光度法分别测定结合物中酶和抗体物中酶和抗体(抗原抗原)蛋白的含量，然后按公式计算蛋白的含量，然后按公式计算其标记率。其标记率。雅安职业技术学院雅安职业技术学院四四、固相载体、固相载体（一）固相载体的要求（一）固相载体的要求结合抗体结合抗体(抗原抗原)的容量大，结合稳定；的容量大，结合稳定；可结合抗原或抗体及亲和素或链霉亲可结合抗原或抗体及亲和素或链霉亲 和素等大分子；和素等大分子；固相化后分子仍应保持活性；固相化后分子仍应保持活性；固相化方法应简便、快速。固相化方法应简便、快速。雅安职业技术学院雅安职业技术学院（二）固相载体的种类（二）固相载体的种类1 1塑料制品塑料制品 由聚苯乙烯、聚氯乙烯制成。形状由聚苯乙烯、聚氯乙烯制成。形状 主要有微量反应板、小试管和小珠三种。主要有微量反应板、小试管和小珠三种。2 2微颗粒微颗粒 微颗粒是由高分子单体聚合成的微球微颗粒是由高分子单体聚合成的微球 或颗粒。或颗粒。3.3.微孔虑膜微孔虑膜 是一种多孔薄膜过滤材料，包括硝酸是一种多孔薄膜过滤材料，包括硝酸 纤维素膜（纤维素膜（NC）、尼龙膜和玻璃纤维素膜等。）、尼龙膜和玻璃纤维素膜等。雅安职业技术学院雅安职业技术学院微量反应板微量反应板返回章目录返回章目录雅安职业技术学院雅安职业技术学院第二节第二节 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验一、基本原理一、基本原理 将已知抗原或抗体吸附在固相载体表面，使将已知抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤的方法将抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤的方法将固相上的抗原抗体复合物与液相中的游离成分分固相上的抗原抗体复合物与液相中的游离成分分开。加入酶的底物后，通过酶对底物催化的显色开。加入酶的底物后，通过酶对底物催化的显色反应程度，对标本中抗原或抗体进行反应程度，对标本中抗原或抗体进行定性定性或或定量定量。雅安职业技术学院雅安职业技术学院二、酶联免疫吸附试验的类型二、酶联免疫吸附试验的类型（一）双抗体夹心法检测抗原（一）双抗体夹心法检测抗原 将己知抗体包被固相载体，待检标本中的相将己知抗体包被固相载体，待检标本中的相应抗原与固相表面的抗体结合，洗涤去除未结合应抗原与固相表面的抗体结合，洗涤去除未结合成分。然后再与抗原特异的酶标抗体结合，形成成分。然后再与抗原特异的酶标抗体结合，形成固相抗体固相抗体-抗原抗原-酶标抗体复合物，根据加底物后酶标抗体复合物，根据加底物后的显色程度确定待检抗原的含量。的显色程度确定待检抗原的含量。1.原理原理雅安职业技术学院雅安职业技术学院 E固相抗体固相抗体标本（含抗原）标本（含抗原）酶标抗体酶标抗体EE底物底物双抗体夹心法检测抗原双抗体夹心法检测抗原雅安职业技术学院雅安职业技术学院（1 1）将特异性抗体包被于固相反应板上，洗涤。）将特异性抗体包被于固相反应板上，洗涤。（2 2）加待检标本）加待检标本,温育，洗涤。温育，洗涤。（3 3）加酶标抗体，洗涤。）加酶标抗体，洗涤。（4 4）加底物，根据颜色反应的程度进行该抗原的）加底物，根据颜色反应的程度进行该抗原的 定性或定量。定性或定量。2 2技术要点技术要点雅安职业技术学院雅安职业技术学院（+）（-）E EE EE EE EE EE EE EE EE E双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原雅安职业技术学院雅安职业技术学院 双抗体夹心法中，应注意类风湿因子双抗体夹心法中，应注意类风湿因子(RF)的的干扰。如果待检标本中含有干扰。如果待检标本中含有RF，可能产生假阳，可能产生假阳性结果。使用抗体的性结果。使用抗体的F(ab)2或或Fab片段作为酶标片段作为酶标抗体可消除抗体可消除RF的干扰。的干扰。3 3注意事项注意事项雅安职业技术学院雅安职业技术学院（二）双位点一步法检测抗原（二）双位点一步法检测抗原 即在双抗体夹心法基础上使用针对抗原分子即在双抗体夹心法基础上使用针对抗原分子上两个不同表位的单克隆抗体，分别作为固相抗上两个不同表位的单克隆抗体，分别作为固相抗体和酶标抗体。测定时将待检标本和酶标抗体同体和酶标抗体。测定时将待检标本和酶标抗体同时加入进行反应，两种抗体互不干扰，经一次温时加入进行反应，两种抗体互不干扰，经一次温育和洗涤后，即可加入底物进行显色测定。育和洗涤后，即可加入底物进行显色测定。1 1原理原理雅安职业技术学院雅安职业技术学院 EEE底物底物固相抗体固相抗体标本（含抗原）标本（含抗原）酶标抗体酶标抗体双位点一步法检测抗原双位点一步法检测抗原雅安职业技术学院雅安职业技术学院E EE EE EE E（+）E EE E（-）双位点一步法测抗原双位点一步法测抗原雅安职业技术学院雅安职业技术学院 如果待检标本中抗原浓度过高，如果待检标本中抗原浓度过高，容易形成容易形成“钩状效应钩状效应（hook effect）”。钩状效应严重时，钩状效应严重时，可出现假阴性结果，必要时可将待检标本适当可出现假阴性结果，必要时可将待检标本适当稀释后重新测定。稀释后重新测定。2 2注意事项注意事项雅安职业技术学院雅安职业技术学院（三）竞争法检测抗原（三）竞争法检测抗原 酶标抗原和待检抗原对固相特异性抗体具有酶标抗原和待检抗原对固相特异性抗体具有相同的结合力，二者竞争结合固相特异性抗体。相同的结合力，二者竞争结合固相特异性抗体。免疫反应后，结合于固相的酶标抗原量与标本中免疫反应后，结合于固相的酶标抗原量与标本中待检抗原含量呈待检抗原含量呈反比反比。待检抗原量越多，酶标抗。待检抗原量越多，酶标抗原与固相抗体结合越少，底物显色反应越浅；反原与固相抗体结合越少，底物显色反应越浅；反之则显色越深，即底物显色与待检标本中抗原含之则显色越深，即底物显色与待检标本中抗原含量呈反比。量呈反比。1 1原理原理雅安职业技术学院雅安职业技术学院酶标抗原酶标抗原 EEEE固相抗体固相抗体标本（含抗原）标本（含抗原）底物底物E竞争法检测抗原竞争法检测抗原雅安职业技术学院雅安职业技术学院（1 1）将特异性抗体包被于固相反应板上，洗涤。）将特异性抗体包被于固相反应板上，洗涤。（2 2）待测管中加待检标本和一定量酶标抗原的混）待测管中加待检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，待检标本中如果含有抗原，则与酶标抗原合溶液，待检标本中如果含有抗原，则与酶标抗原竞争固结合相抗体，使酶标抗原与固相载体的结合竞争固结合相抗体，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。对照管中只加酶标抗原，温育，洗涤。量减少。对照管中只加酶标抗原，温育，洗涤。（3 3）加底物显色。对照管中颜色深，待测管颜色）加底物显色。对照管中颜色深，待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。越淡，表示标本中抗原含量越多。2 2技术要点技术要点雅安职业技术学院雅安职业技术学院（+）E EE E（-）E EE EE EE EE EE EE EE E竞争法测抗原竞争法测抗原雅安职业技术学院雅安职业技术学院（四）间接法检测抗体（四）间接法检测抗体 将已知抗原吸附于固相载体上，待检标本中将已知抗原吸附于固相载体上，待检标本中相应抗体与之结合，形成固相抗原相应抗体与之结合，形成固相抗原-抗体复合物，抗体复合物，再用酶标二抗与固相免疫复合物中的抗体结合，再用酶标二抗与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原形成固相抗原-抗体抗体-酶标二抗复合物，根据加底酶标二抗复合物，根据加底物后的显色程度确定待检抗体含量。物后的显色程度确定待检抗体含量。1 1原理原理雅安职业技术学院雅安职业技术学院 固相抗原固相抗原标本（含抗体）标本（含抗体）酶标二抗酶标二抗底物底物EEE间接法检测抗体间接法检测抗体雅安职业技术学院雅安职业技术学院（1 1）将特异性抗原包被于固相反应板上，洗涤。）将特异性抗原包被于固相反应板上，洗涤。（2 2）加稀释的受检血清，洗涤。）加稀释的受检血清，洗涤。（3 3）加酶标二抗，洗涤。）加酶标二抗，洗涤。（4 4）加底物显色，颜色深度代表标本中待检抗体）加底物显色，颜色深度代表标本中待检抗体 的量。的量。2 2技术要点技术要点雅安职业技术学院雅安职业技术学院（+）E EE EE EE EE EE E（-）E EE EE E间接法测抗体间接法测抗体雅安职业技术学院雅安职业技术学院（五）（五）双抗原夹心法检测抗体双抗原夹心法检测抗体 将已知抗原包被固相载体，待检标本中的将已知抗原包被固相载体，待检标本中的相应抗体可分别与固相表面的抗原、酶标抗原相应抗体可分别与固相表面的抗原、酶标抗原结合，形成固相抗原结合，形成固相抗原-抗体抗体-酶标抗原复合物，酶标抗原复合物，根据加底物后的显色程度确定待检抗体含量。根据加底物后的显色程度确定待检抗体含量。同双抗体夹心法。同双抗体夹心法。1 1原理原理2 2技术要点技术要点雅安职业技术学院雅安职业技术学院E固相抗体固相抗体标本（含抗体）标本（含抗体）酶标抗原酶标抗原底物底物EE双抗原夹心法检测抗体双抗原夹心法检测抗体雅安职业技术学院雅安职业技术学院（+）（-）E EE EE EE EE EE EE EE EE E双抗原夹心法测抗体双抗原夹心法测抗体雅安职业技术学院雅安职业技术学院（六）竞争法检测抗体（六）竞争法检测抗体同竞争法结合抗原。同竞争法结合抗原。HBcAb和和HBeAb的测定均采用竞争法，但其的测定均采用竞争法，但其测定具体模式有区别。测定具体模式有区别。1 1原理原理雅安职业技术学院雅安职业技术学院（1 1）竞争法检测）竞争法检测HBcAb：将将HBcAg包被于固相反应板上，洗涤。包被于固相反应板上，洗涤。加入待检标本和酶标特异性抗体，温育，洗涤。加入待检标本和酶标特异性抗体，温育，洗涤。加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比色加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比色仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗体含仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗体含量成反比。量成反比。2 2技术要点技术要点雅安职业技术学院雅安职业技术学院固相抗原标本（含抗体）底物酶标抗体EEEEE竞争法检测竞争法检测HBcAbHBcAb雅安职业技术学院雅安职业技术学院（+）E EE E（-）E EE EE EE EE EE EE E竞争法检测竞争法检测HBcAbHBcAb雅安职业技术学院雅安职业技术学院（2 2）竞争法检测）竞争法检测HBeAb：将将HBeAb包被于固相反应板上，洗涤。包被于固相反应板上，洗涤。加入待检标本和加入待检标本和HBeAg，温育，洗涤。，温育，洗涤。加入酶标加入酶标HBeAb，温育，洗涤。，温育，洗涤。加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比色仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗色仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗体含量成反比。体含量成反比。雅安职业技术学院雅安职业技术学院固相抗体标本（含抗体）抗原酶标抗体底物EEE竞争法检测竞争法检测HBeAbHBeAb雅安职业技术学院雅安职业技术学院（+）（-）E EE EE EE EE EE EE EE EE E竞争法检测竞争法检测HBeAbHBeAb雅安职业技术学院雅安职业技术学院（七）捕获法检测抗体（七）捕获法检测抗体 将抗人将抗人IgM抗体吸附于固相载体上，待检抗体吸附于固相载体上，待检标本中的标本中的IgM类抗体多被固相抗体捕获。加入类抗体多被固相抗体捕获。加入特异抗原与固相抗体捕获的特异抗原与固相抗体捕获的IgM类抗体结合，类抗体结合，再加入抗原特异的酶标抗体，形成固相抗人再加入抗原特异的酶标抗体，形成固相抗人IgM-IgM-抗原抗原-酶标抗体复合物。最后根据加酶标抗体复合物。最后根据加底物后的显色程度确定待检底物后的显色程度确定待检IgM抗体的含量。抗体的含量。1 1原理原理雅安职业技术学院雅安职业技术学院（1 1）将抗人）将抗人IgM链抗体包被于固相反应板上，链抗体包被于固相反应板上，洗涤。洗涤。（2 2）加人待检标本，温育，洗涤。）加人待检标本，温育，洗涤。（3 3）加入特异性抗原，温育，洗涤。）加入特异性抗原，温育，洗涤。（4 4）加入抗原特异的酶标抗体，温育，洗涤。）加入抗原特异的酶标抗体，温育，洗涤。（5 5）加入底物，温育一定时间，显色，用酶标）加入底物，温育一定时间，显色，用酶标 比色仪测定结果。比色仪测定结果。2 2技术要点技术要点雅安职业技术学院雅安职业技术学院固相抗人固相抗人lgMlgM抗体抗体E标标本（含抗本（含抗体）体）抗原抗原底物底物EE固相捕获法检测固相捕获法检测lgMlgM抗体抗体雅安职业技术学院雅安职业技术学院E EE EE EE EE EE E（+）（-）捕获法捕获法雅安职业技术学院雅安职业技术学院 采用固相捕获法检测采用固相捕获法检测IgM类抗体时要注意的类抗体时要注意的是是RF（IgM类）及其它非特异类）及其它非特异IgM的干扰。的干扰。RF（IgM类）能与固相抗人类）能与固相抗人链抗体结合，并可链抗体结合，并可与随后加入的酶标抗体（动物与随后加入的酶标抗体（动物IgG）反应，从而）反应，从而导致导致假阳性反应假阳性反应。3 3注意事项注意事项雅安职业技术学院雅安职业技术学院 非特异IgM由于其在第一步温育中，可与特异IgM竞争与固相抗体结合，所以会影响测定的灵敏度。因此，使用本法测IgM，必须对临床样本进行适当稀释。雅安职业技术学院雅安职业技术学院三、最适工作浓度的选择三、最适工作浓度的选择（一）间接法检测抗体（一）间接法检测抗体（1 1）用）用100100ng/ml人人IgG进行包被，洗涤。进行包被，洗涤。（2 2）将酶标抗人）将酶标抗人IgG用稀释液作一系列稀释后分用稀释液作一系列稀释后分别加入已包被的孔中，温育，洗涤。别加入已包被的孔中，温育，洗涤。（3 3）加底物显色。加酸终止反应后，读取吸光度）加底物显色。加酸终止反应后，读取吸光度（A）值在）值在1.01.0时的酶标抗体稀释度，作为酶标抗时的酶标抗体稀释度，作为酶标抗体的工作浓度。体的工作浓度。1 1酶标抗抗体工作浓度的选择酶标抗抗体工作浓度的选择雅安职业技术学院雅安职业技术学院（1 1）用包被液将抗原作一系列稀释后包被，洗涤。）用包被液将抗原作一系列稀释后包被，洗涤。（2 2）将强阳性参考血清、弱阳性参考血清和阴性）将强阳性参考血清、弱阳性参考血清和阴性参考血清用稀释液作参考血清用稀释液作1:1001:100稀释，加样，温育，洗稀释，加样，温育，洗涤。涤。（3 3）加按工作浓度稀释的酶标抗人）加按工作浓度稀释的酶标抗人IgG抗体，温育，抗体，温育，洗涤。洗涤。2 2棋盘滴定法选择包被抗原工作浓度棋盘滴定法选择包被抗原工作浓度雅安职业技术学院雅安职业技术学院 （4）加底物显色，加酸终止反应后读取A值。（5）选择强阳性参考血清的A值为0.8左右，阴性参考血清的A值小于0.1的包被抗原的稀释度作为工作浓度。雅安职业技术学院雅安职业技术学院参考血清各抗原稀释度的吸光度值（A）1:501:100 1:200 1:4001:800强阳性1.201.040.840.680.42弱阳性0.640.410.300.220.19阴性0.230.130.080.660.05稀释液0.090.020.020.020.04间接间接ELISAELISA法包被抗原最适工作浓度的选择法包被抗原最适工作浓度的选择雅安职业技术学院雅安职业技术学院（二）双抗体夹心法检测抗原（二）双抗体夹心法检测抗原（1 1）抗体用包被缓冲液稀释至浓度为）抗体用包被缓冲液稀释至浓度为1010、1 1和和0.10.1g/ml，分别在，分别在ELISA板上进行包被，洗涤。板上进行包被，洗涤。（2 2）在一个横行各包被孔中加入强阳性抗原液，）在一个横行各包被孔中加入强阳性抗原液，另一横行加入弱阳性抗原液，第三横行加入阴性对另一横行加入弱阳性抗原液，第三横行加入阴性对照液，温育，洗涤。照液，温育，洗涤。雅安职业技术学院雅安职业技术学院 （3）将酶标抗体用稀释液稀释成三个浓度，例如1:1000、1:5000和1:25000。温育，洗涤。（4）加底物显色，加酸终止反应后，读取A值。（5）以强阳性抗原的A值在0.8左右、阴性参考的A值小于0.1的条件作最适条件，据此选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度。雅安职业技术学院雅安职业技术学院包被抗体的浓度酶标抗体稀释度各抗原的吸光度值（A）强阳性（25ng/ml）弱阳性（1.5ng/ml）阴性10g/ml1:10001.170.150.091:50000.460.0301:250000.12001g/ml1:100020.250.101:50000.910.120.011:250000.250.0100.1g/ml1:10000.420.130.131:50000.110.030.021:250000.0300返回章目录返回章目录夹心夹心ELISAELISA包被抗体和酶标抗体工作浓度的选择包被抗体和酶标抗体工作浓度的选择雅安职业技术学院雅安职业技术学院第三节第三节 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验的应用和注意事项的应用和注意事项一、一、应用应用1 1病原体及其抗体测定病原体及其抗体测定 广泛应用于传染病的诊断。广泛应用于传染病的诊断。2 2蛋白质测定蛋白质测定 各种免疫球蛋白、补体组分、肿瘤各种免疫球蛋白、补体组分、肿瘤标志物各种血浆蛋白质、同工酶等。标志物各种血浆蛋白质、同工酶等。雅安职业技术学院雅安职业技术学院 3非肽类激素测定 如T3、T4、雌激素、绒毛膜促性腺激素、黄体素、胰岛素、皮质醇、促甲状腺素等。4药物和毒品测定 如地高辛、苯巴比妥、庆大霉素、吗啡等。雅安职业技术学院雅安职业技术学院1加样 应力求准确，并注意不可溅出和产生气泡。2温育 注意反应的温度和时间应按规定的要求，整块反应板的温度应一致，以防止“边缘效应”。3洗涤 手工洗板是在每次温育后，将反应液吸出或甩干，然后用缓冲液洗涤2或3次，拍干。使用洗板机洗涤次数要适当增加。二、注意事项二、注意事项雅安职业技术学院雅安职业技术学院4 4显色显色 根据试剂盒说明操作即可。根据试剂盒说明操作即可。5 5比色比色 要注意波长的选择。操作中应注意避免要注意波长的选择。操作中应注意避免出现滤光片错用的问题。出现滤光片错用的问题。雅安职业技术学院雅安职业技术学院第四节第四节 其他酶标记免疫测定技术其他酶标记免疫测定技术一、均相酶免疫测定法、固相模免疫测定法等一、均相酶免疫测定法、固相模免疫测定法等 基本原理基本原理 酶标抗原和非标记抗原具有相同的酶标抗原和非标记抗原具有相同的与限量抗体竞争结合的能力，而酶标抗原与抗体与限量抗体竞争结合的能力，而酶标抗原与抗体结合形成酶标抗原结合形成酶标抗原-抗体复合物后，其中的酶活抗体复合物后，其中的酶活性将被减弱或增强。性将被减弱或增强。（一）均相酶免疫测定法（一）均相酶免疫测定法雅安职业技术学院雅安职业技术学院 因此，不需对反应液中结合和游离的酶标抗原进行分离，直接测定反应系统中总酶活性的变化即可推算出被测样品中抗原的含量。雅安职业技术学院雅安职业技术学院（二）非均相液相酶免疫测定法（二）非均相液相酶免疫测定法基本原理：基本原理：将酶标抗原、待检抗原与特异性抗体将酶标抗原、待检抗原与特异性抗体同时混合（平衡法），或先将待检抗原与特异性同时混合（平衡法），或先将待检抗原与特异性抗体混合反应一定时间后，再加入酶标抗原（非抗体混合反应一定时间后，再加入酶标抗原（非平衡法），抗原抗体反应达到平衡后，加入二抗，平衡法），抗原抗体反应达到平衡后，加入二抗，经离心沉淀后，将游离的酶标记物与结合的酶标经离心沉淀后，将游离的酶标记物与结合的酶标记物（酶标抗原记物（酶标抗原-抗体抗体-二抗复合物）分离，弃上二抗复合物）分离，弃上清液，测定沉淀物中酶的活性。待检抗原量与沉清液，测定沉淀物中酶的活性。待检抗原量与沉淀物中酶的活性成反比。淀物中酶的活性成反比。雅安职业技术学院雅安职业技术学院（三）固相膜免疫测定法（三）固相膜免疫测定法1.斑点酶免疫吸附试验斑点酶免疫吸附试验 基本原理与常规基本原理与常规ELISA相同，不同之处在于相同，不同之处在于Dot-ELISA使用吸附蛋白质能力很强的使用吸附蛋白质能力很强的NC 膜为膜为固相载体，底物经酶反应后形成有色的沉淀物，固相载体，底物经酶反应后形成有色的沉淀物，使使NC 膜染色。膜染色。雅安职业技术学院雅安职业技术学院斑点斑点-酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验雅安职业技术学院雅安职业技术学院2.免疫印迹试验免疫印迹试验原理原理 抗原等蛋白样品经抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在处理后带阴电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动。将在凝胶聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动。将在凝胶中已经分离的蛋白质条带转移至中已经分离的蛋白质条带转移至NC腹上，选用腹上，选用低电压低电压(100(100v)和高电流和高电流(1(12 2A)，通电，通电4545min转移转移即可完成。即可完成。雅安职业技术学院雅安职业技术学院 印有蛋白条带的NC膜依次与特异性抗体和酶标二抗作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。阳性反应的条带染色清晰，根据SDS-PAGE时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。雅安职业技术学院雅安职业技术学院免疫印迹试验免疫印迹试验雅安职业技术学院雅安职业技术学院免疫印迹试验免疫印迹试验雅安职业技术学院雅安职业技术学院3.重组免疫结合试验重组免疫结合试验 基本原理与免疫印迹试验相似，不同之处基本原理与免疫印迹试验相似，不同之处是特异性抗原不通过电泳分离转印，而是是特异性抗原不通过电泳分离转印，而是直接直接分条加在固相膜上。分条加在固相膜上。RIBA已用于血清抗已用于血清抗HCV抗抗体的测定和分析。体的测定和分析。雅安职业技术学院雅安职业技术学院二、生物素二、生物素-亲和素标记技术在亲和素标记技术在 ELISA中的应用中的应用（一）生物素和亲和素的特点（一）生物素和亲和素的特点 结构中的咪唑酮环是与亲和素结合的主要部结构中的咪唑酮环是与亲和素结合的主要部位，四氢噻吩环戊酸侧链末端羧基是与抗体和位，四氢噻吩环戊酸侧链末端羧基是与抗体和酶等蛋白质结合的主要部位。酶等蛋白质结合的主要部位。1生物素生物素(biotin，B)雅安职业技术学院雅安职业技术学院 利用生物素的羧基加以化学修饰后可制利用生物素的羧基加以化学修饰后可制成各种活性基团的衍生物成各种活性基团的衍生物(活化生物素活化生物素)，以，以适合与各种生物大分子结合的需要。适合与各种生物大分子结合的需要。雅安职业技术学院雅安职业技术学院 富含色氨酸，借助色氨酸残基与生物素的咪富含色氨酸，借助色氨酸残基与生物素的咪唑酮环结合。亲和素与生物素之间的亲和力极强，唑酮环结合。亲和素与生物素之间的亲和力极强，比抗原与抗体的亲和力至少高比抗原与抗体的亲和力至少高1 1万倍，且具有高度万倍，且具有高度特异性和稳定性。特异性和稳定性。2亲和素亲和素(avidin，A)雅安职业技术学院雅安职业技术学院 酸性氨基酸含量较多，其等电点为pH值6.0，而且不带任何糖基，在检测中出现的非特异性结合明显少于卵白亲和素，正逐渐取代卵白亲和素。3链霉亲和素链霉亲和素(streptavidin，SA)雅安职业技术学院雅安职业技术学院生物素生物素-亲和素技术在亲和素技术在ELISAELISA中的应用类型中的应用类型反应层次直接法间接法BA-ELISAAg-（Ab-B）-AAg-（Ab-B）-A-BAg-（Ab-B）-ABCAg-Ab1-（Ab2-B）-AAg-Ab1-（Ab2-B）-A-BAg-Ab1-（Ab2-B）-ABCBAB-ELISAABC-ELISAA为标记亲和素为标记亲和素 B为标记生物素为标记生物素雅安职业技术学院雅安职业技术学院 基本原理：基本原理：直接直接BA-ELISA是以酶标亲合素直是以酶标亲合素直接连接生物素化抗体。间接接连接生物素化抗体。间接BA-ELISA采用生物采用生物素化的二抗，可进一步提高检测灵敏度。素化的二抗，可进一步提高检测灵敏度。BA-ELISA中亲和素与酶的共价结合对酶的活性有一中亲和素与酶的共价结合对酶的活性有一定程度的损伤。定程度的损伤。1.BA-ELISA雅安职业技术学院雅安职业技术学院BA-ELISA检测抗原检测抗原雅安职业技术学院雅安职业技术学院 BA-ELISA检测抗体检测抗体雅安职业技术学院雅安职业技术学院 基本原理：基本原理：直接直接BAB-ELISA是以游离的亲是以游离的亲合素作为桥联剂，利用亲合素的多价性，将生合素作为桥联剂，利用亲合素的多价性，将生物素化抗体和酶标生物素连接起来，以检测反物素化抗体和酶标生物素连接起来，以检测反应分子。间接应分子。间接BAB-ELISA是在加入抗体后，再是在加入抗体后，再用生物素化的二抗，使反应增加一个层次，从用生物素化的二抗，使反应增加一个层次，从而使灵敏度进一步提高。而使灵敏度进一步提高。2BAB-ELISA雅安职业技术学院雅安职业技术学院 BAB-ELISA雅安职业技术学院雅安职业技术学院基本原理：基本原理：亲合素与酶标生物素结合形成亲合素亲合素与酶标生物素结合形成亲合素-生物素生物素-过氧化物酶复合物过氧化物酶复合物(ABC)。当其与生物素。当其与生物素化抗体化抗体(直接直接ABC-ELISA)或生物素化二抗或生物素化二抗(间接间接ABC-ELISA)相遇时，相遇时，ABC中未饱和的亲合素结中未饱和的亲合素结合部位可与抗体上的生物素结合，使抗原抗体反合部位可与抗体上的生物素结合，使抗原抗体反应体系与应体系与ABC体系连成一体。通过依次的相互连体系连成一体。通过依次的相互连接作用，形成一个具有多级放大作用的晶格样网接作用，形成一个具有多级放大作用的晶格样网状结构，使检测敏感性明显提高。状结构，使检测敏感性明显提高。3ABC-ELISA雅安职业技术学院雅安职业技术学院ABC-ELISA雅安职业技术学院雅安职业技术学院小小 结结 酶免疫分析技术酶免疫分析技术是以酶标记的抗原或抗体作是以酶标记的抗原或抗体作为主要试剂的免疫检测方法，在抗原与抗体的特为主要试剂的免疫检测方法，在抗原与抗体的特异性反应完成后，通过酶对底物的催化作用提高异性反应完成后，通过酶对底物的催化作用提高反应的敏感性。酶免疫分析技术可分为酶免疫组反应的敏感性。酶免疫分析技术可分为酶免疫组织化学技术和酶免疫测定两大类织化学技术和酶免疫测定两大类,后者根据抗原后者根据抗原抗体反应后是否需要分离结合与游离的酶标记物抗体反应后是否需要分离结合与游离的酶标记物而分为均相和非均相两种类型。而分为均相和非均相两种类型。雅安职业技术学院雅安职业技术学院 最常用的技术是以聚苯乙烯等材料作最常用的技术是以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA）,其原理可分为夹心法、竞争其原理可分为夹心法、竞争法、间接法和捕获法等。法、间接法和捕获法等。雅安职业技术学院雅安职业技术学院展展 望望 酶免疫技术酶免疫技术是三大经典标记免疫技术之一，是是三大经典标记免疫技术之一，是以酶标记抗体或抗原为主要试剂的一种标记免疫分以酶标记抗体或抗原为主要试剂的一种标记免疫分析技术。随着相关新技术的不断问世，如杂交瘤单析技术。随着相关新技术的不断问世，如杂交瘤单克隆抗体、生物素一亲和素放大系统的应用以及与克隆抗体、生物素一亲和素放大系统的应用以及与化学发光和电化学发光技术的偶联等，明显地提高化学发光和电化学发光技术的偶联等，明显地提高了分析和测定方法的特异性、灵敏度及其自动化程了分析和测定方法的特异性、灵敏度及其自动化程度，使酶免疫分析技术不断更新，应用范围不断拓度，使酶免疫分析技术不断更新，应用范围不断拓宽。宽。雅安职业技术学院雅安职业技术学院 当前，酶免疫技术己与形式各异、各具当前，酶免疫技术己与形式各异、各具特点和用途的定位、定量和超微量测定的标特点和用途的定位、定量和超微量测定的标记免疫技术融合发展，在医学和生物学中有记免疫技术融合发展，在医学和生物学中有着广泛的应用。着广泛的应用。雅安职业技术学院雅安职业技术学院谢谢 谢！谢！雅安职业技术学院雅安职业技术学院