SIK2通过Akt_mTOR转导途径调节细胞自噬对减轻心肌缺血_再灌注损伤的研究.pdf

mCor.S实验研究联勤军事医学2 0 2 3年6 月2 8 日第37 卷第6 期Mil Med JntLog,Vol.37,No.6,June28,2023455SIK2通过Akt/mTOR转导途径调节细胞自噬对减轻心肌缺血/再灌注损伤的研究朱涛，张为民，阿不都乃比麦麦提艾力，刘正，艾克热木吐尔逊，霍强【摘要】目的探讨盐诱导激酶2(salt induceskinase 2，SIK 2)对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的调控作用，及对蛋白激酶B(proteinkinaseB，A k t）)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetof rapamycin，mT O R）通路的影响。方法将15只SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组（心肌缺血/再灌注损伤模型）、SIK2抑制剂组（造模前2 4h给予10 mg/kg博舒替尼），每组5只大鼠。采用超声仪检测大鼠心脏功能，苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，H E）染色评估心肌组织病理学情况，透射电镜观察心肌细胞自噬情况，Westernblot检测心肌组织Akt/mTOR通路（SIK2、p-A k t、A k t、p-m T O R、mTOR)以及自噬(Beclin-1、LC3-I I/LC3-I、p 6 2)相关蛋白表达水平。结果3组大鼠左心室后壁厚度（leftventricularposteriorwall,LVPW）、室间隔（interventricularseptum,IVS）组间比较差异无统计学意义（P0.05），SIK 2 抑制剂组左心室短轴缩短率（leftventricularfractionshort，LVFS）以及左心室射血分数（leftventricularejectionfractions，LVEF）均高于模型组、低于假手术组（P均 0.0 1)，模型组LVFS、LVEF均低于假手术组（P均 0.0 1)。与假手术组比较，模型组心肌组织病理损伤明显，自噬小体明显增加，SIK2抑制剂组心肌组织病理损伤、心肌细胞自噬情况较模型组明显改善。SIK2抑制剂组Beclin-1、LC3-I I/LC3-I 蛋白表达量低于模型组、高于假手术组，p62蛋白表达量高于模型组、低于假手术组（P均 0.0 5），SIK2抑制剂组SIK2水平高于假手术组、低于模型组，而p-Akt、P-m T O R水平高于模型组，模型组p-Akt、p-m T O R水平低于假手术组（P均0.05),the left ventricular fraction short(LVFS)and left ventricu-【基金项目】国家自然科学基金资助项目（8 2 0 6 0 90 7）【作者单位】830054新疆乌鲁木齐，新疆医科大学第一附属医院心脏外科(朱涛、张为民、阿不都乃比麦麦提艾力、刘正、艾克热木吐尔逊、霍强）【通信作者】霍强强,E-mail:lar ejection fractions(LVEF)in the SIK2 inhibition groupwere higher than those in the model group and lower thanthose in the sham surgery group(all P0.01),LVFSand LVEF in model group were lower than those in thesham surgery group(all P0.01).Compared with thesham surgery group,the pathological injury of myocardialtissue were obvious and autophagy of myocardial cells sig-MilMedJntLog0.6,June28,2023联勤军事医学2 0 2 3年6 月2 8 日第37 卷第6 期456nificantly increased in the model group,while the pathological injury of myocardial tissue and autophagy of myocardialcells in the SIK2 inhibition group were significantly improved.The protein expression levels of Beclin-1,LC3-II/LC3-Iin SIK2 inhibition group were lower than those in model group and higher than those in sham surgery group,while theprotein expression levels of p62 were higher than those in model group and lower than those in sham surgery group(all P0.05),the level of SIK2 in the SIK2 inhibition group was higher than that in the sham surgery group but lower than thatin the model group,while the level of p-Akt and p-mTOR was higher than that in the model group,and the levels ofp-Akt and p-mTOR in the model group were lower than those in the sham surgery group(all P0.05).Conclusion In-hibition of SIK2 can reduce abnormal autophagy of myocardial cells and improve myocardial ischemia/reperfusion injury,its mechanism may be related to the regulation of Akt/mTOR signaling pathway by SIK2.【K e y w o r d s Protein kinase B/mammalian target of rapamycin signaling pathway;Myocardial ischemia/reperfusioninjury;Autophagy;Myocardial injury;Salt induces kinase 2自噬在心肌缺血/再灌注损伤中发挥重要调控作用，过度自噬会诱导心肌细胞损伤、调亡，从而破坏心脏结构和功能，进而引发缺血/再灌注损伤1-3。蛋白激酶B(proteinkinaseB,Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mam-malian target of rapamycin，mT O R）信号通路是调控自噬的关键通路,其中mTOR是细胞生长、增殖、自噬的调控中心，通过调控ULK1-ATG13-FIP200蛋白复合物启动，诱导自噬疾病的表达4。有研究表明，多种药物可通过调控mTOR状态而影响心肌细胞自噬，有助于改善心肌缺血/再灌注损伤5。盐诱导激酶2（salt induceskinase2，SIK 2)属于单磷酸腺苷依赖的蛋白激酶(adenosine5-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)家族成员，既往研究发现SIK2可调控脑组织缺血/再灌注损伤大鼠模型中的能量代谢，改善脑组织损伤，同时SIK2还能调节细胞自噬体的成熟、自噬过程6-刀。基于以上研究，本文作者认为SIK2可能通过影响自噬相关通路（Akt/mTOR信号通路)而减少心肌细胞异常自噬，改善心肌缺血/再灌注损伤。因此，本次研究将建立心肌缺血/再灌注损伤大鼠模型进行论证。1材料与方法1.1材料与仪器1.1.1实验动物15只成年雄性SD大鼠，12 15周龄，体质量2 0 0 2 50 g，购自北京维通利华公司许可证号：SYXK（京）2 0 2 2-0 0 52 。大鼠置于SPF级实验动物中心通风饲养，室内温度为（2 12)，相对湿度为40%6 0%，自由饮水、进食。1.1.22主要试剂0.9%氯化钠注射液购自于石家庄第四制药厂；Beclin-1、LC3-II/LC3-I、p 6 2 兔抗大鼠IgG购自美国Abcam公司；兔多克隆抗体p-Akt、Akt、p-mT O R、mT O R、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glycer-aldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)购 自于美国Cell SignalingTechnology公司；磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline,PBS）、二甲基亚矾、乌拉坦等均购自于Sigma公司SIK2抑制剂（博舒替尼）、放射免疫沉淀法（radioimmunoprecipitationas-say,RIPA)裂解液、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG购自于碧云天生物技术有限公司；苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，H E)染色液购自于北京索莱宝科技有限公司；化学发光试剂购自美国Millipore公司。1.1.3主要仪器设备超声仪器为PhilipsEPIQ7C,探头L12-3；小动物呼吸机（HX-101E）、心电图机（BL-420S)购自成都泰盟软件有限公司；凝胶电泳系统购自美国Bio-Rad公司；各种型号显微镜购自Carl-Zeiss公司。1.2动物分组与模型的建立大鼠适应7 天后随机分为假手术组、模型组和SIK2抑制剂组，每组5只。假手术组：缝线穿过冠状动脉左前降支但不结扎；模型组：缝线结扎冠状动脉左前降支，30 min后松开结扎线再灌2 h；SI K 2 抑制剂组：造模前2 4h于左股静脉注射博舒替尼10 mg/kg（生理盐水溶解），模型组、SIK2抑制剂组2 4h后建模。具体建模过程如下：术前12 h禁食，自由饮水，称重后于腹腔注射5ml/kg、2 5%乌拉坦，待麻醉起效后仰卧位固定大鼠于恒温鼠板上，酒精消毒，记录正常心电图。颈正中开切口，分离颈部气管，气管插管，连接呼吸机通气。左侧34肋间开胸，缝线结扎冠脉左前降支（假手术组不结扎），复位心脏位置，挤出胸腔内空气，关闭胸腔即可。心电图显示ST段抬高或下降0.2mV则表明造模成功，缺血30 min后打开胸腔，松开结扎线，缝合胸部皮肤，再灌2 h。1.3观察指标1.3.1大鼠心脏功能大鼠于麻醉状态下至少检测3个连续、完整的心动周期，获取超声心动图参数，包括左心室后壁厚度（left ventricular posterior wall，LVPW）、室间隔（interventricular septum,IVS)、左心室短轴缩短率（left ventricular fraction short,LVFS)以及左心室射血分数（leftventricularejection frac-联勤军事医学2 0 2 3年6 月2 8 日第37 卷第6 期Mil Med Jnt Log,Vol.37,No.6,June28,2023457tions,LVEF)。1.3.2心脏病理学采用HE染色法评估心脏病理学情况，断头处死大鼠，取心脏，4%多聚甲醛中固定2 4h，脱水、包埋、切片、染色等操作。从心尖部开始分割成3等份，厚度均为2 3mm,脱水处理;HE染液、梯度乙醇分别将心肌细胞的细胞核、细胞质染成蓝色、红色，中性树胶封片，光学显微镜下观察细胞形态、结构。1.3.3心肌细胞自噬情况取大鼠左心室心尖部组织，体积约1mm，固定液固定2 4h，常规脱水、浸透、包埋、染色，制成50 7 0 nm切片，透射电镜下观察心肌组织自噬情况1.3.4心脏组织蛋白采用Westernblot检测心肌组织 Akt/mTOR 通 路（SIK2、p-A k t、A k t、p-m T O R、mTOR)以及自噬(Beclin-1、LC3B、p 6 2)相关蛋白表达水平。大鼠再灌注2 h后断头处死，获取心脏组织，加人RIPA裂解液，提取组织中总蛋白，蛋白质定量试剂盒（p r o t e i n q u a n t i f i c a t i o n k i t，BCA）法检测蛋白浓度。配制聚丙烯酰胺凝胶，上样后电泳分离1.5h,转聚偏二氟乙烯（polyvinylidenefluoride，PVD F）膜，洗膜，封闭，加人一抗稀释抗体SIK2（1:50 0)、p-A k t(1:50 0)、A k t(1：500)、p-m T O R(1:50 0)、m T O R(1:50 0)、Be c l i n-1(1:1000)、LC3B(1:10 0 0)、p 6 2(1:10 0 0),4孵育过夜。洗膜3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，避光37孵育2 h,显影。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceral-dehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）为 内参,ImageJ软件分析蛋白条带的灰度值。1.4统计学处理所有数据采用SPSS19.0软件进行分析，其中计量资料以均数土标准差（土s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，事后两两比较采用LSD-t检验，P 0.0 5），而LVFS、LV EF组间比较差异有统计学意义（P均 0.0 1)，其中SIK2抑制剂组LVFS、LV EF水平均高于模型组，低于假手术组，模型组LVFS、LV EF水平均低于假手术组（P均0.01),见表1。表13组大鼠心动图参数比较（土s）Table 1 Comparison of cardiac parameters of rats in the 3 groups(s)项目nLVPW(mm)IVS(mm)LVFS(%)LVEF(%)假手术组51.62 0.031.86 0.0550.82 3.1380.67 3.75模型组51.65 0.041.83 0.0421.23 1.77*41.78 2.64*SIK2抑制剂组51.66 0.031,92 0.0432.92 2.32*#62.67 4.25*#F/P值1.912/0.1902.368/0.136181.933/0.001145.341/0.001注：与假手术组比较，*P0.01；与模型组比较，#P0.012.33组大鼠心脏组织病理学情况假手术组心肌细胞结构完整，排列整齐，横纹清晰，心肌间质未发现明显的炎症细胞浸润。模型组心肌纤维肿胀紊乱，部分肌纤维断裂，且中间出现大量空洞，心肌细胞水肿,甚至出现细胞核固缩、碎裂、溶解，坏死心肌细胞周围浸润大量炎症细胞。SIK2抑制剂组心脏组织病理学变化较模型组明显减轻，但心肌纤维中间仍存在少量空洞，心肌间质有炎症细胞浸润，见图2。2.43组大鼠心肌细胞自噬情况假手术组心肌细胞结构完整，排列整齐，明暗带清晰，细胞核、线粒体形态和数量均正常。模型组大鼠肌原纤维明显肿胀，可见溶解、断裂、甚至缺失，线粒体突紊乱、消失、空泡化严重，有较多自噬体形成，自噬程度增强。SIK2抑制剂组心肌细胞形态基本正常，肿胀、空泡化减轻，肌原纤维偶有挛缩，形成较少的自噬体，见图3。Mil MedJntLogNo.6,June28,2023联勤军事医学2 0 2 3年6 月2 8 日第37 卷第6 期458对照组模型组SIK2抑制剂组图2 3组大鼠心脏组织病理学情况Figure 2 Cardiac histopathology of rats in the 3 groups对照组模型组SIK2抑制剂组图33组大鼠心肌细胞自噬情况Figure 3Autophagy of cardiac myocytes of rats in the 3 groups2.53组大鼠自噬蛋白的表达情况3组大鼠自噬蛋白（Beclin-1、LC 3-/LC 3-I、p62)组间比较差异有统计学意义（P0.01)，其中SIK2抑制剂组Beclin-1、LC 3-I I/LC 3-I 蛋白表达量低于模型组、高于假手术组，p62蛋白表达量高于模型组、低于假手术组（P均 0.0 1）；模型组Beclin-1、LC3-I/LC3-I 蛋白表达量高于假手术组，p62蛋白表达量低于假手术组，见表2。表2 3组大鼠自噬蛋白的表达情况（s）Table 2 Expression of autophagic proteinof rats in the 3 groups(s)项目nBeclin-1LC3-II/LC3-IP62假手术组50.48 0.030.66 0.050.74 0.08模型组50.96 0.09*1.12 0.09*0.43 0.03*SIK2抑制剂组50.72 0.06*#0.85 0.07*#0.58 0.05*#F/P值68.571/0.00151.710/0.00136.786/0.001注：与假手术组比较，*P0.01；与模型组比较，#P 0.0 5），而SIK2、p-A k t、p-m T O R表达水平组间比较差异有统计学意义（P0.01），其中SIK2抑制剂组SIK2高于假手术组、低于模型组，而p-mTOR高于模型组（P均 0.0 5），模型组p-Akt、p-m T O R水平均低于假手术组（P均 0.0 1)，见表3。3讨论急性心肌梗死是引起心血管疾病患者死亡的重要原因，临床上主要采取溶栓或直接经皮冠状动脉介人的方式及时恢复血运，在缺血一段时间后的血流恢复过程中容易发生心肌缺血/再灌注损伤，导致病情加重，增加患者死亡风险8 。心肌缺血/再灌注损伤过程复杂，有研究表明自噬是心肌缺血/再灌注损伤的重要作用机制9。Akt/mTOR途径是调节自噬的重要信表33组大鼠Akt/mTOR通路相关蛋白表达情况（土s）Table3Expression of Akt/mTOR pathway related proteins of rats in the 3 groups(s)项目nSIK2Aktp-AktmTORp-mTOR假手术组50.62 0.090.98 0.120.89 0.080.99 0.110.87 0.08模型组51.09 0.12*1.03 0.170.72 0.06*0.95 0.090.58 0.04*SIK2抑制剂组50.76 0.08*#0.96 0.090.81 0.070.91 0.080.77 0.09#F/P值30.225/0.0010.379/0.6927.282/0.0090.902/0.43120.217/0.001注：与假手术组比较，*P0.05，*P 0.0 1；与模型组比较，#P0.01下转第47 1页）联勤军事医学2 0 2 3年6 月2 8 日第37 卷第6 期MilMedJntLVol.37,No.6,June28,2023459号通路，其中心肌缺血/再灌注损伤时该通路处于异常活化状态，mTOR失活和ULK1（Se r 7 57）激活，诱导自噬10。SIK2作为AMPK亚家族成员，具有多种生物学效应，如调控脂肪和糖代谢，引起心肌肥厚，诱导自噬过程等，尽管有研究报道SIK2还参与缺血、缺氧性疾病的进展11-12 ,但目前关于其在心肌缺血/再灌注损伤中的作用机制尚不明确。本次研究发现，大鼠在建立心肌缺血/再灌注损伤模型后心肌组织病理损伤明显，自噬小体明显增加，其中心功能指标LVEF、LV FS值下降，自噬蛋白LC3-II/LC3-I、Be c l i n-1水平升高，而p62表达水平降低，表明缺血/再灌注损伤会诱导心肌细胞异常自噬，进而增加心肌缺血/再灌注损伤程度，模型组大鼠心肌组织病理损伤加重，如心肌纤维肿胀紊乱，心肌细胞坏死、凋亡，大量炎症细胞浸润等，且心功能以及心电图指标异常。大鼠在建模前给予SIK2抑制剂（博舒替尼)后,SIK2抑制剂组大鼠的心肌组织病理损伤程度以及自噬小体数量较模型组明显降低或者减轻，且 LVEF、LVFS 以及 LC3-/LC3-I、Be c l i n-1等蛋白表达水平较模型组明显改善，表明下调SIK2表达可抑制心肌细胞过度自噬，有助于改善心功能状态。刘秀秀等13 研究也发现，SIK2会诱导心肌细胞自噬小体形成，引起心肌组织病理损伤，而抑制SIK2表达则明显改善自噬情况，缓解心肌损伤。尽管既往大量研究均表明心肌缺血/再灌注会引发自噬，然而自噬产生的结局不同，自噬会加重损伤，同样也有研究认为自噬会减轻损伤14-151。总体而言，短期、轻度自噬会通过降解受损蛋白或者细胞器而维持细胞存活状态，产生有益作用，而持续升高或过度的自噬则会产物不良作用，诱导细胞调亡为了进一步明确SIK2诱导自噬的具体机制，本研究考察了模型组大鼠心肌组织Akt/mTOR途径相关蛋白表达水平，结果显示模型组大鼠p-Akt、p-mTOR表达水平较假手术组明显降低，表明心肌缺血/再灌注损伤会抑制Akt/mTOR信号通路，Akt、mTOR失活，从而促进细胞自噬。自噬是机体为应对内外界刺激通过清除受损蛋白质、细胞器等而维持内环境稳态的代谢途径。给予SIK2抑制剂后，p-Akt、P-mTOR蛋白表达水平明显升高，提示SIK2可能通过调控Akt/mTOR途径而影响心肌细胞自噬过程，下调SIK2后则使得Akt、m T O R活化，降低自噬水平。许乐等16 研究表明，mTOR调控的ULK1-ATG13-FIP200蛋白复合物启动自噬，其中高活性mTORC1会磷酸化ULK1残基，进而破坏与AMPK之间的作用，抑制ULK1活化，最终下调自噬过程。同时，Gao等17 研究显示，给予mTOR抑制剂则增加自噬介导的抗原呈递，从而激活细胞自噬。谢凯等18 研究也证实香烟烟雾提取物可通过下调Akt/mTOR信号通路而促进自噬，结合本次研究结果进一步证实SIK2通过调控Akt/mTOR转导途径而参与细胞自噬过程，影响心肌组织损伤。综上所述，在心肌再灌注损伤过程中，SIK2处于高表达状态，并参与调控细胞自噬过程，加重心肌组织损伤，抑制SIK2则会调控Akt/mTOR信号通路，抑制心肌细胞过度自噬，从而减少心肌细胞损伤、调亡，改善大鼠心功能，有助于保护心肌缺血/再灌损伤，具有良好的临床应用前景。参考文献1Peng JF,Salami OM,Habimana O,et al.Targeted mitochondrialdrugs for treatment of ischemia-reperfusion injuryJJ.Curr 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