白细胞介素-1受体拮抗剂对脂多糖诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤的保护作用.pdf

动物营养学报，（）：白细胞介素 受体拮抗剂对脂多糖诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤的保护作用郭咏梅 石惠宇 闫素梅 史彬林 郭晓宇 赵艳丽（内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古自治区高校动物营养与饲料科学重点实验室，呼和浩特）摘 要：本试验以脂多糖（）作为应激源，诱导奶牛乳腺上皮细胞（）氧化损伤，旨在探究白细胞介素 受体拮抗剂（）对 诱导的 氧化损伤的保护作用，并确定抑制细胞氧化损伤的适宜 浓度。第 代贴壁生长的 被随机分为 个组：对照组（无，无）、组（）、单独添加（、和 ）组、同时添加 与（、）组，每组设 个重复。不同处理的工作液作用于细胞 后，测定细胞相对增殖率（），并且收集细胞和培养液测定抗氧化指标和炎性因子含量。结果显示：与对照组相比，单独添加不同浓度的 对、谷胱甘肽过氧化物酶（）、硫氧还蛋白还原酶（）、过氧化氢酶（）活性与总抗氧化能力（）以及丙二醛（）、活性氧（）、肿瘤坏死因子（）、白细胞介素（）、诱导性一氧化氮合酶（）、一氧化氮（）含量均无显著影响（）；但是，单独添加不同浓度对白细胞介素（）的生成有显著的抑制效果（）。与 组相比，同时添加 和 能显著提高（），显著增加 和超氧化物歧化酶（）活性与，并显著降低、含量（）。结果提示，单独添加 可以专一性的抑制 内 的产生，对细胞氧化应激的影响不显著；加速了 氧化还原水平的失衡，可有效抑制 诱导的细胞氧化损伤，且 的适宜作用浓度为 。关键词：奶牛乳腺上皮细胞；脂多糖；白细胞介素 受体拮抗剂中图分类号：文献标识码：文章编号：（）收稿日期：基金项目：内蒙古农业大学高层次人才科研启动项目（）；国家自然科学基金项目（）；内蒙古农业大学基本科研业务费专项资金（）作者简介：郭咏梅（），女，内蒙古呼和浩特人，讲师，博士，从事草食家畜营养与饲料开发研究。：通信作者：闫素梅，教授，博士生导师，：体内高浓度自由基的积累导致氧化还原系统失衡以及乳腺的异常炎性反应，从而导致奶牛乳腺炎发病率增加。一氧化氮（，）是体内重要的活性氮类自由基（，），一氧化氮合成酶（，）在多种细胞中参与催化 精氨酸（，）与氧气（，）的多步骤氧化还原反应，并不断产生低浓度的内源性 分子。然而，当 产生过量时，它可以与超氧阴离子（）反应，形成有害的自由基，导致炎症，而炎症又可以引起细胞凋亡和组织损伤。因此，有效地控制奶牛乳腺上皮细胞（期郭咏梅等：白细胞介素 受体拮抗剂对脂多糖诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤的保护作用，）中 的过量生产，以防止乳腺组织中 积累造成氧化损伤是非常重要的。研究表明，炎性因子白细胞介素（，）的产生是触发目标基因诱导型一氧化氮合酶（，）表达增加和 产生过多的重要原因。例如，激活的滑膜细胞和软骨细胞中 的过度产生介导了前列腺素活性和 相关的酶如环氧化酶 和 活性的 增 加，导 致 的 蓄 积。主 要 包 括、，是调节体内免疫和炎症反应的核心介质，或 与各自的受体结合，激活相关信号通路。白细胞介素 受体拮抗剂（，）是一种内源性的细胞因子，能选择性地与 型受体（如和 受体）结合，阻断细胞内信号传导途径体内 与 之间的平衡对免疫状态和内环境的稳定很重要。表达高，表达低，机体处于病理状态。研究发现，添加外源性 可以抑制 的生成，促进机体恢复 与 之间的平衡。革兰氏阴性杆菌细胞壁的主要组分之一脂多糖（，）作为诱导机体发生氧化损伤的一种毒素，已经被广泛地用于建立动物炎症和细菌感染模型。本课题组的前期研究已经以 为研究对象成功建立了 诱导的氧化应激模型，确定了 适宜的作用浓度（）和作用时间（）。当巨噬细胞受到过量的 刺激时，会产生大量的肿 瘤 坏 死 因 子 （，）和 等 炎 性 因 子。研 究 发 现，的 显著减弱了 诱导的成年大鼠慢性神经炎症及损伤。在人和小鼠的星形胶质细胞中，可以诱导产生过量的，这在人的软骨细胞中也得到了证实。以上研究提示，通过阻断 信号对细胞氧化损伤发挥保护作用，但关于其作用剂量各研究结果不一，且针对 的报道甚少。鉴于此，本试验以 为应激源诱导建立的 氧化损伤模型为基础，探究 对 诱导的 氧化损伤的保护作用以及抑制 活性的最佳作用浓度，为进一步深入探讨 的氧化应激机制及抗氧化机理奠定基础。材料与方法 试剂配制 工作液的制备：将 溶于含 牛血清白蛋白（）的磷酸盐缓冲液（）中，配制成浓度为 的母液，再按照试验要求配制成浓度分别为、的 贮备液。试验开始前经饥饿培养基进一步稀释配制成不同浓度（、）的 工 作 液。工 作 液 经 过 滤 器（）过滤后避光保存。取 的 粉末溶于 中，配成 的 母液。继续稀释 倍配制成 的 贮备液。试验开始前，用 的 贮备液和饥饿培养基配制成 的 细胞工作液。配制好的工作液用 过滤器过滤，每次换液体时现配并且避光保存。细胞培养 细胞培养采用胶原酶消化法。于内蒙古自治区呼和浩特市北亚清真冷库采集荷斯坦奶牛的乳腺组织，切除外层，用含有 双抗的 冲洗 次，用 的医用酒精冲洗 ，接着用含有 双抗的 冲洗 次，冲洗后的组织切除表面，从腺体的深部滤泡中切下 的碎片装入离心管中。反复剪碎后加入 的型胶原酶于 下消化 ，每 轻轻摇晃 次以确保完全消化。然后用孔径为 的细胞滤网过滤组织，收集于新的离心管中，离心 。去除上清液并清洗细胞，将细胞重新悬浮在 中，再次离心 （）。将重悬于 的细胞接种到培养瓶中，置于培养箱（、）培养。当 在培养瓶底部生长到 时，采用差速法纯化细胞。本试验采用第 代细胞进行研究，细胞经荧光免疫细胞染色法鉴定。试验设计 采用单因子完全随机试验设计，将第 代贴壁生长的 随机分为 个组，第 组为对照组，工作液中不添加 和；第 组为 组，工作液中 浓度为 ；第 组为单独添加 组，工作液中 浓度分别为、，依次命名为、组；第 组为同时动 物 营 养 学 报 卷添加 和 组，工作液中 浓度均为 ，浓 度 分 别 为、，依次 命 名 为 、组。每组设 个重复。不同处理的工作液作用于细胞 后，测定细胞相对增殖率（，），并收集细胞和培养液测定抗氧化指标和炎性因子含量。样品采集 经不同处理的工作液处理 后，以重复为单位收集细胞培养液于离心管中，离心 ，收集上清液用于后续指标的测定。接着，将培养瓶置于冰上，经 清洗后加入 动物细胞裂解液，后用细胞刮刀刮取贴 壁 细 胞，收 集 于 离 心 管 中 离 心 （，），收 集 上 清 用 于 后 续 指 标 的测定。测定指标及方法 采用四甲基偶氮唑盐（，），法测定，通过吸光度（）值的大小反映细胞的存活数量，值越高，说明细胞的存活数量越 多。（）（试 验 组 对 照 组）。谷胱甘肽过氧化物酶（）活性采用二硫代二硝基苯甲酸法测定，过氧化氢酶（）活性采用比色法测定；超氧化物歧化酶（，）活性采用黄嘌呤氧化酶法测定；丙二醛（，）含量采用硫代巴比妥酸法测定；总抗氧化能力（，）采用比色法测定，以上试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。硫氧还蛋白还原酶（，）活性以及、白细胞介素（）、肿瘤坏死因子（，）、活性氧（，）、含量均采用酶联免疫吸附试验（）法测定，试剂盒均购自美国 公司。上述指标的测定依照各自试剂盒说明书进行操作。细胞内的抗氧化指标的活性或含量换算为以总蛋白含量基础，总蛋白含量采用二喹啉甲酸（）法测定，试剂盒购自北京碧云天科技有限公司。数据处理与分析 试验数据经 进行初步整理和计算后，采用 软件的单因素方差分析（）程序进行显著性检验和 氏法多重比较，为显著性判断标准。结果与分析 对 诱导的 的影响 由图 可见，与对照组相比，组的 显著降低（），而、组的 均无显著变化（）。与 组相比，、组的 均显著提高（），并且，其提高的水平随着浓度的增加呈现先升高后降低的变化趋势，在浓度为 时最高。数据柱标相同小写字母表示差异不显著（），不同小写字母表示差异显著（）。（），（）图 对 诱导的奶牛乳腺上皮细胞相对增殖率的影响 对 诱 导 的 内 抗 氧 化指标的影响 由表 可知，与对照组相比，组的、活性与 均显著降低（），含量显著增加（）；、组的、活性及、含量均无显著变化（），但 活性显著降低（），且 个单独添加 组之间，组显著高于 组（），其他各组之间差异均不显著（）。个同时添加 和 组之间，、活性与 随 浓度的增加呈先升高后降低的变化趋势，含量呈先降低后升高趋势，当 的浓度为 时，、期郭咏梅等：白细胞介素 受体拮抗剂对脂多糖诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤的保护作用活性与 均达到最大值，含量达到最小值。与 组相比，组、组、组的 活性显著升高（），组、组、组、组、组的 活性显著升高（），组的 活性显著升高（），组、组、组的 显著升高（），组、组、组、组、组的 含量显著降低（）。对 诱导的 内炎性因子、及 含量的影响 由表 可知，与对照组相比，除 含量变化不显著（）外，组的、和 含量均显著增加（）；除 显著降低（）外，、和 组的、和 含量均无显著变化（），且 个单独添加 组之间、和 含量均无显著差异（）。个同时添加 和 组之间，、和 含量均随 浓度的增加呈先降低后升高的变化趋势，当 的浓度为 时，上述指标的含量均降到最低值。与 组相比，、和 组的、和 含量显著降低（），、组的 含量显著降低（），组的 和 含量显著降低（）。讨 论 诱导氧化应激已经是氧化应激研究中有效并且常用的方法之一。为了开发临床抗炎性药物，在关于小鼠成软骨细胞中促炎症信号通路的研究中，作为刺激源诱导氧化损伤，导致细胞活力显著下降、细胞凋亡增加，同时一些促炎性细胞 因 子 如、白 细 胞 介 素 （，）、的含量和 相对表达量均显著升高。在 等的研究中也有类似的发现。有研究指出，的蓄积以及的基因表达增加也源于 的刺激诱导；的刺激会导致 基因和蛋白的大量表达，进而催化生成过量的。本课题组先前的研究表明，添加维生素 可以有效缓解 诱发的氧化应激，究其原因可能与维生素 抑制 的过量生成有关。氧化应激参数的变化是确定细胞是否发生了氧化损伤以及细胞氧化应激模型是否构建成功的重要依据。动物体内有 个主要系统在清除自由基方面非常活跃，包括酶促防御系统和非酶促防御系统；、等抗氧化酶可以有效地清除 自由基并结束自由基连锁反应，属于酶促防御系统；维生素、维生素、生育酚、巯基化合物、辅酶 等抗氧化物质，属于非酶促防御系统。抗氧化酶如、和 是内源性酶，可以通过清除各种 自由基、脂质过氧化物和过氧化物醛类以缓解组织损伤。因此，除细胞活力外，、活性和 含量被认为可以反映机体清除自由基的能力和脂质过氧化损伤的程度，也可作为判断细胞是否发生氧化应激的重要指标。在本试验中，组的、和 活性与 均较对照组显著下降，说明 发生了氧化应激，细胞内氧化还原水平遭到破坏。当添加 后，上述抗氧化酶的活性明显升高，诱导的氧化损伤得到有效缓解，且这种调控作用呈现剂量依赖效应。是临床医学上用于抗炎症的一种有效方法，它没有激动剂的活性，通常不触发任何信号就可以阻断细胞因子 的活性，其治疗效果与用量密切相关。属于 的一种内源性的抑制因子，竞争性的拮抗 的受体，阻止 与其受体相结合，继而阻断了 诱导的其他下游炎性因子的释放以及与之关联的炎症信号通路的进一步激发。促炎性细胞因子 主要由巨噬细胞产生，与其受体结合后形成复合蛋白，接着靠近细胞质附近的区域被激活，包括核因子（，）、氨基末端激酶（，）转录因子激活蛋白（，）和 丝裂原活化蛋白激酶（，）等途径。研究发现，受到 刺激后的间质干细胞在添加 后，减少了上清液中 等炎症细胞因子的产生，样受体（，）和核因子抑制因子（，）的 相对表达量急剧下降，逆转了 诱导的 信号通路的激活，以时间和剂量依赖的方式有效削弱了 诱导的细胞损伤。可以显著降低处于应激状态的雄性大鼠脑部及血液中 的含量，同时抑制其下游基因 的表达。动 物 营 养 学 报 卷表 对 诱导的 内抗氧化指标的影响 项目组别 对照脂多糖 值谷胱甘肽过氧化物酶 （）硫氧还蛋白还原酶 （）超氧化物歧化酶 （）过氧化氢酶 （）总抗氧化能力 （）丙二醛 （）同行数据肩标中不含有相同小写字母表示组间差异显著（），反之差异不显著（）。下表同。（），（）表 对 诱导的 内炎性因子、及 含量的影响 ，项目组别 对照脂多糖 值白细胞介素（）白细胞介素（）肿瘤坏死因子（）诱导型一氧化氮合酶（）一氧化氮（）活性氧 （）期郭咏梅等：白细胞介素 受体拮抗剂对脂多糖诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤的保护作用 在本试验中，组的炎性因子、与脂质过氧化产物、以及 和 的含量均显著高于对照组，而 的添加则有效地降低了上述指标的含量，但其作用效果随着 浓度的增加先增加后降低，说明 诱导产生过量的 并且诱发其他炎性因子的大量生成，加剧细胞的氧化损伤，一旦 被有效拮抗，上述氧化应激将显著缓解，但是过高浓度的会产生相反的调控趋势。因此，诱导生成的炎性因子被降低的最多，最接近对照组时，该浓度即为 的最佳作用浓度。在本试验条件下，根据试验 结 果 可 知，的 最 佳 作 用 浓 度 为 。综合本研究所得结果可以看出，能有效地抑制 诱导的细胞氧化损伤，而本课题组前期添加维生素 的研究也显示出类似的效果。基 于 本 研 究，缓 解 诱 导 的 内大量 释放的具体机制在基因和蛋白表达水平及信号通路激活的层面需要进一步研究，以明确维生素 缓解 氧化损伤的机制。结 论 可以阻断 的信号通路，进而抑制 和 生成，缓解 引起的 氧化损伤，且本试验条件下 的作用效果最好。参考文献：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（），：宋相伟，杨婉身，周晓巍，等白细胞介素 信号转导调控研究进展 细胞与分子免疫学杂志，（）：，（）：（），（）：伍国华乙酰半胱氨酸对脂多糖刺激仔猪肠道免疫应激和抗氧化能力的影响硕士学位论文武汉：武汉工业学院，：，（），（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：动 物 营 养 学 报 卷 ，（）：，（）：，：王春林，抗氧化剂对鸡长期成活率的重要性国外畜牧学（猪与禽），（）：，（），（）：（），：？，（）：张爱丽 蛋白在脂多糖致 损伤后炎症反应及凋亡中的作用的研究 博士毕业论文石家庄：河北医科大学，：，：（），（）：，：，（）：，：，：，（）：，：，（）：期郭咏梅等：白细胞介素 受体拮抗剂对脂多糖诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤的保护作用，：（责任编辑 菅景颖）（，）：，（）（），（），（），（），（，），（，），（），（），（）（），（），（），（），（），（），（）（）（）；，（）（），（）（），（）；，（）：；