circ_NEK6_miR-503-5p对多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡及迁移的影响.pdf

第5 2卷第4期第5 1 1页2 0 2 3年8月 华中科技大学学报(医学版)A c t aM e dU n i vS c iT e c h n o lH u a z h o n g V o l.5 2 N o.4 P.5 1 1A u g.2 0 2 3实验研究*贵州省遵义市科技计划项目N o.遵市科合H Z(2 0 2 2)9 6葛金丽,女,1 9 8 6年生,主治医师,E-m a i l:1 8 2 7 5 6 1 7 2 4 71 6 3.c o m通讯作者,C o r r e s p o n d i n ga u t h o r,E-m a i l:2 8 2 6 1 2 6 6q q.c o mc i r c_N E K 6/m i R-5 0 3-5 p对多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡及迁移的影响*葛金丽,李 行,李 强,柘娜娜,周震沧,刘兆玉遵义医科大学第三附属医院(遵义市第一人民医院)血液内科,遵义 5 6 3 0 0 0摘要:目的 探讨c i r c_N E K 6/m i R-5 0 3-5 p分子轴对多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡及迁移的影响及其可能的作用机制。方法 选取2 0 2 0年2月至2 0 2 1年7月遵义医科大学第三附属医院收治的3 0例多发性骨髓瘤患者为研究组,同时选取在该院体检的5 5例健康志愿者为对照组;q R T-P C R法检测血清中c i r c_N E K 6、m i R-5 0 3-5 p的表达量;体外培养人多发性骨髓瘤U 2 6 6细胞,分为s i-c i r c_N E K 6组、m i R-5 0 3-5 p组和s i-c i r c_N E K 6+a n t i-m i R-5 0 3-5 p组以及相应的对照组(s i-N C组、m i R-N C组、s i-c i r c_N E K 6+a n t i-m i R-N C组);细胞增殖、凋亡及迁移用MT T法、克隆形成实验、流式细胞术与T r a n s w e l l实验测定;双荧光素酶报告基因实验验证c i r c_N E K 6与m i R-5 0 3-5 p之间的靶向关系;W e s t e r nb l o t检测B a x、B c l-2蛋白表达量。结果 与对照组比较,研究组患者血清中c i r c_N E K 6高表达(P0.0 5),m i R-5 0 3-5 p低表达(P0.0 5);s i-c i r c_N E K 6组U 2 6 6细胞m i R-5 0 3-5 p的表达、细胞增殖抑制率、凋亡率和B a x水平增加(均P0.0 5),而克隆数、迁移数和B c l-2水平降低(均P0.0 5);c i r c_N E K 6可靶向结合m i R-5 0 3-5 p;在m i R-5 0 3-5 p组U 2 6 6细胞,细胞增殖抑制率、凋亡率和B a x水平上升(均P0.0 5),而克隆数、迁移数和B c l-2水平降低(均P0.0 5);此外,s i-c i r c_N E K 6+a n t i-m i R-5 0 3-5 p组细胞增殖抑制率、凋亡率和B a x水平降低(均P0.0 5),而克隆数、迁移数和B c l-2水平升高(P0.0 5)。结论 敲低c i r c_N E K 6可以通过靶向m i R-5 0 3-5 p降低多发性骨髓瘤细胞生长和迁移能力。关键词:多发性骨髓瘤;c i r c_N E K 6;m i R-5 0 3-5 p;细胞增殖;迁移;凋亡中图分类号:R 7 3 3.3 D O I:1 0.3 8 7 0/j.i s s n.1 6 7 2-0 7 4 1.2 0 2 3.0 4.0 1 2E f f e c t o f c i r c_N E K 6/m i R-5 0 3-5 po nt h eP r o l i f e r a t i o n,A p o p t o s i sa n dM i g r a t i o no fM u l t i p l eM y e l o m aC e l l sG eJ i n l i,L iH a n g,L iQ i a n ge t a lD e p a r t m e n t o fH e m a t o l o g y,t h eT h i r dA f f i l i a t e dH o s p i t a l o fZ u n y iM e d i c a lU n i v e r s i t y(T h eF i r s tP e o p l esH o s p i t a l o fZ u n y i),Z u n y i 5 6 3 0 0 0,C h i n aA b s t r a c t O b j e c t i v e T oe x p l o r e t h ee f f e c to f c i r c_N E K 6/m i R-5 0 3-5 pa x i so nt h ep r o l i f e r a t i o n,a p o p t o s i sa n dm i g r a t i o no fm u l t i p l em y e l o m a(MM)c e l l sa n di t sp o s s i b l em e c h a n i s m.M e t h o d s T h i r t yp a t i e n t sw i t h MMa d m i t t e di no u rh o s p i t a lf r o mF e b r u a r y2 0 2 0t oJ u l y2 0 2 1w e r es e l e c t e da st h es t u d yg r o u p,a n d5 5h e a l t h yv o l u n t e e r sw h or e c e i v e dp h y s i c a l e x a m i n a t i o ni no u r h o s p i t a lw e r e s e l e c t e da s t h e c o n t r o l g r o u p.T h e q R T-P C Rm e t h o dw a su s e d t od e t e c t t h e e x p r e s s i o no f c i r c_N E K 6a n dm i R-5 0 3-5 p i ns e r u m.U 2 6 6c e l l sw e r e c u l t u r e d f o ri n v i t r oa s s a y,a n dc e l l sw e r e r a n d o m l yd i v i d e d i n t ot h e f o l l o w i n gg r o u p s:s i-c i r c_N E K 6g r o u p,m i R-5 0 3-5 pg r o u p,s i-c i r c_N E K 6+a n t i-m i R-5 0 3-5 pg r o u pa n dn e g a t i v ec o n t r o lg r o u p(s i-N Cg r o u p,m i R-N Cg r o u p,a n ds i-c i r c_N E K 6+a n t i-m i R-N Cg r o u p).MT Ta s s a y,c o l o n yf o r m a t i o na s s a y,f l o wc y t o m e t r ya s s a ya n dT r a n s w e l l a s s a yw e r eu s e d t od e t e c t c e l l p r o l i f e r a t i o n,a p o p t o s i s a n dm i g r a t i o n.D u a l-l u c i f e r a s e r e p o r t e r a s s a yw a su s e d t od e t e c t t h e t a r g e t i n gr e-l a t i o n s h i pb e t w e e nc i r c_N E K 6a n dm i R-5 0 3-5 p.W e s t e r nb l o tw a su s e d t od e t e c t t h e e x p r e s s i o no fB a xa n dB c l-2p r o t e i n.R e s u l t sC o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o l g r o u p,t h ee x p r e s s i o no fc i r c_N E K 6w a s i n c r e a s e d(P0.0 5),w h i l et h ee x p r e s s i o no fm i R-5 0 3-5 pw a sd e c r e a s e d(P0.0 5)i nt h es e r u mo fMMp a t i e n t s.T h em i R-5 0 3-5 pe x p r e s s i o n,c e l lp r o l i f e r a t i o ni n h i b i t i o nr a t e,a p o p t o s i sr a t ea n dB a x l e v e lw e r e i n c r e a s e d(a l lP0.0 5),w h i l e c e l l c o l o n yn u m b e r,c e l lm i g r a t i o nn u m b e r a n dB c l-2l e v e lw e r ed e c r e a s e d(a l lP0.0 5)i nt h es i-c i r c_N E K 6g r o u p.T h ec i r c_N E K 6c o u l dt a r g e tm i R-5 0 3-5 p.C e l lp r o l i f e r a t i o ni n h i b i t i o nr a t e,a p o p t o s i sr a t ea n dB a x l e v e lw e r e i n c r e a s e d(a l lP0.0 5),w h i l e c e l l c o l o n yn u m b e r,c e l lm i g r a t i o nn u m b e r a n dB c l-2l e v e lw e r ed e c r e a s e d(a l lP0.0 5)i n t h em i R-5 0 3-5 pg r o u p.B e s i d e s,c e l l p r o l i f e r a t i o n i n h i b i t i o nr a t e,a p o p t o s i s r a t e a n dB a x l e v e lw e r ed e c r e a s e d(a l lP0.0 5),w h i l ec e l l c o l o n yn u m b e r,c e l lm i g r a t i o nn u m b e ra n dB c l-2l e v e lw e r e i n c r e a s e d(a l lP0.0 5)i nt h es i-c i r c_N E K 6+a n t i-m i R-5 0 3-5 pg r o u p.C o n c l u s i o n K n o c k d o w no f c i r c_N E K 6c o u l d i n h i b i t t h eg r o w t ha n dm i g r a t i o no fMMc e l l sb y t a r g e t i n gm i R-5 0 3-5 p.K e yw o r d s m u l t i p l em y e l o m a;c i r c_N E K 6;m i R-5 0 3-5 p;c e l lp r o l i f e r a t i o n;m i g r a t i o n;a p o p t o s i s 多发性骨髓瘤是一种成熟B淋巴细胞恶性增生性疾病,严重威胁患者生命安全,但其发病机制尚未阐明1-2。环状R NA(c i r c u l a rR NA,c i r c R NA)可以充当微小R NA(m i R NA)的海绵调控m i R NA水平。多项研究显示,c i r c R NA在多发性骨髓瘤中表达异常,并可在多发性骨髓瘤发生及发展过程中发挥癌基因或抑癌基因作用3。c i r c_N E K 6在非小细胞肺癌中表达水平升高,并可通过竞争性结合m i R-3 8 2-5 p而促进乳腺癌扩增序列2(B C A S 2)的表达从而促进非小细胞肺癌的发展4。但c i r c_N E K 6在多发性骨髓瘤进程中的作用尚不清楚。既往的报道显示,m i R-5 0 3-5 p对卵巢癌细胞的生长有抑制作用5,但其是否调控多发性骨髓瘤进程还未见报道。S t a r b a s e软件分析结果显示c i r c_N E K 6可以与m i R-5 0 3-5 p互补结合。因此,我们推测c i r c_N E K 6可能靶向m i R-5 0 3-5 p而调节多发性骨髓瘤恶性进展。1 材料与方法1.1 材料与试剂招募3 0例多发性骨髓瘤患者为研究组,其中男1 8例,女1 2例,年龄4 76 8岁,平均年龄(6 0.3 24.2 6)岁。同时选取在本院体检的5 5例健康志愿者为对照组,其中男3 5例,女2 0例,年龄4 27 0岁,平均年龄(5 9.3 65.1 2)岁。所有受试者均签署了知情同意书,且本研究获得了遵义医科大学第三附属医院伦理委员会的批准。人多发性骨髓瘤U 2 6 6细胞购自上海通派公司;DMEM培养液(货号:1 1 9 6 5 0 9 2)与胎牛血清(货号:1 0 1 0 0 1 4 7)购自美国G i b c o公司;T r i z o l试剂(货号:1 5 5 9 6 0 2 6)、L i p o f e c t a m i n e 3 0 0 0(货号:L 3 0 0 0 0 7 5)购自美国T h e r m oF i s h e r公司;反转录(货号:K R 1 0 7)与荧光定量P C R试剂盒(货号:F P 2 1 7)购自北京天根公司;s i-c i r c_N E K 6、m i R-5 0 3-5 pm i m i c s、a n t i-m i R-5 0 3-5 p及 相 应 的 对 照(s i-N C、m i R-N C、a n t i-m i R-N C)由广州锐博公司合成;MT T试剂(货号:C 0 0 0 9S)、细胞凋亡检测试剂盒(货号:C 1 0 6 2 S)购自上海碧云天公司;T r a n s w e l l小室(货号:3 4 2 2)购自美国C o r n i n g公司;双荧光素酶活性检测试剂盒(货号:E 1 9 1 0)购自美国P r o m e g a公司;兔抗人B a x(货号:a b 3 2 5 0 3)、B c l-2(货号:a b 3 2 1 2 4)、GA P DH(货号:#5 1 7 4)抗体与二抗(货号:a b 2 0 5 7 1 8)购自美国A b-c a m公司。1.2 方法1.2.1 采集血液样本 分别抽取多发性骨髓瘤患者和健康志愿者清晨空腹静脉血5m L,3 0 0 0r/m i n离心1 0m i n,吸取上清液后保存于-8 0 冰箱内。1.2.2 实验分组 U 2 6 6细胞接种于6孔板,按照L i p o f e c t a m i n e 3 0 0 0说明书采用脂质体转染法将s i-c i r c_N E K 6、m i R-5 0 3-5 pm i m i c s、a n t i-m i R-5 0 3-5 p及相应的对照(s i-N C、m i R-N C、a n t i-m i R-N C)转染入U 2 6 6细胞,随后将细胞分为s i-c i r c_N E K 6组、s i-N C组、m i R-5 0 3-5 p组、m i R-N C组、s i-c i r c_N E K 6+a n t i-m i R-N C组和s i-c i r c_N E K 6+a n t i-m i R-5 0 3-5 p组。1.2.3 q R T-P C R检测 根据试剂盒说明书,使用T r i z o l试剂提取总R NA,用反转录试剂盒合成c D-NA。用S Y B RG r e e n进行q R T-P C R反应,反应条件:9 5预变性2m i n,9 5变性3 0s,6 0退火3 0s,7 2延伸3 0s,共4 0个循环。采用2-C t法计算c i r c_N E K 6和m i R-5 0 3-5 p的相对表达量。1.2.4 MT T实验 U 2 6 6细胞接种于9 6孔板,每个孔中加入2 0L MT T(5m g/m L),孵育4h。去除上清液后,向每个孔中加入1 5 0LDM S O溶解结晶,最后应用酶标仪测量各孔4 9 0n m处吸光度值并计算细胞增殖抑制率。1.2.5 克隆形成实验 以每孔5 0 0个细胞将U 2 6 6细胞接种于含有完全培养液的6孔板中孵育。每3天更换1次培养液。培养1 4d,用甲醇固定形成的细胞克隆3 0m i n,用0.1%结晶紫染色1 5m i n,最后在显微镜下统计细胞克隆形成数。1.2.6 流式细胞术检测 收集各组U 2 6 6细胞加入胰蛋白酶消化,洗涤后,将细胞用结合缓冲液重悬,然后依次与5LA n n e x i n-F I T C和2 0LP I黑暗中染色1 5m i n。应用F A C SC a l i b u r流式细胞仪检测凋亡率。1.2.7 T r a n s w e l l实验 将51 05U 2 6 6细胞用无血清培养液重悬后加入T r a n s w e l l小室的上室,并将含有1 0%血清的培养液用作化学引诱剂加入下室中。2 4h后,将细胞膜下侧的迁移细胞用多聚4%甲醛固定3 0m i n,0.1%结晶紫染色1 5m i n,并在显微镜下随机计数5个区域的迁移细胞数。1.2.8 双荧光素酶报告基因实验 根据S t a r b a s e预测的结合位点,将预测的序列和通过点突变获得突变序列分别克隆到p m i r G L O双荧光素酶载体中,构建野生型载体w t-c i r c_N E K 6与突变型载体m u t-c i r c_215华中科技大学学报(医学版)2 0 2 3年8月第5 2卷第4期N E K 6。随后将构建的载体与m i R-N C或m i R-5 0 3-5 pm i m i c s共转染至U 2 6 6细胞。4 8h后,使用双荧光素酶报告基因试剂盒检测荧光素酶活性。1.2.9 W e s t e r nb l o t检测B a x、B c l-2蛋白表达量用R I P A裂解液提取蛋白并用B C A检测浓度。蛋白经S D S-P AG E胶分离,然后转移至P V D F膜。封闭后,膜 与a n t i-B a x(11 0 0 0)、a n t i-B c l-2(11 0 0 0)、a n t i-GA P DH(12 0 0 0)孵 育,然后用二 抗(13 0 0 0)处理。使用E C L发光液显示蛋白条带,并用I m a g eJ软件分析灰度值。1.3 统计学方法数据用S P S S2 1.0软件进行分析,计量资料以(xs)表示。两组间均数比较采用t检验,多组间均数比较采用单因素方差分析。以P0.0 5为差异具有统计学意义。2 结果2.1 c i r c_N E K 6和m i R-5 0 3-5 p的表达相较于对照组,c i r c_N E K 6在多发性骨髓瘤患者血清中高表达(2.5 30.3 0)v s.(0.9 30.1 7),P0.0 1,而m i R-5 0 3-5 p在 患 者 血 清 中 低 表 达(0.4 50.1 0)v s.(1.1 10.1 7),P0.0 5,相较于正常浆细胞(n P C s),c i r c_N E K 6在多发性骨髓瘤细胞U 2 6 6中 高 表 达 (2.8 40.2 6)v s.(1.0 00.0 8),P0.0 1,而m i R-5 0 3-5 p在U 2 6 6中低表达(0.3 60.1 8)v s.(1.0 50.0 9),P0.0 1,高表达c i r c_N E K 6或低表达m i R-5 0 3-5 p与患者预后差相关(均P0.0 5)。2.2 抑制c i r c_N E K 6对U 2 6 6细胞功能的影响相较于s i-N C组,s i-c i r c_N E K 6转染显著降低U 2 6 6细胞中c i r c_N E K 6的表达量(P0.0 1),同时伴随着细胞中m i R-5 0 3-5 p表达升高(P0.0 1)。进一步功能实验显示,s i-c i r c_N E K 6转染导致U 2 6 6细胞增殖抑制率升高,凋亡率升高,克隆形成数量以及细胞迁移数量减少(均P0.0 1)。此外,s i-c i r c_N E K 6转染抑制U 2 6 6细胞中B c l-2的表达,促进B a x蛋白表达(均P0.0 1),见图1、表1。A:W e s t e r nb l o t检测B a x和B c l-2的蛋白表达;B:流式细胞术检测细胞凋亡图1 c i r c_N E K 6抑制对U 2 6 6细胞凋亡及相关蛋白表达的影响F i g.1E f f e c t so f c i r c_N E K 6 i n h i b i t i o no nU 2 6 6c e l l a p o p t o s i sa n dr e l a t e dp r o t e i ne x p r e s s i o n表1 c i r c_N E K 6抑制对U 2 6 6细胞增殖、凋亡及迁移的影响T a b l e1 E f f e c t so f c i r c_N E K 6 i n h i b i t i o no np r o l i f e r a t i o n,a p o p t o s i sa n dm i g r a t i o no fU 2 6 6c e l l s(xs,n=9)组别c i r c_N E K 6表达量m i R-5 0 3-5 p表达量增殖抑制率(%)凋亡率(%)克隆形成数迁移细胞数B a x表达量B c l-2表达量s i-N C1.0 00.0 01.0 00.0 00.0 00.0 06.7 70.5 61 2 1.4 49.0 3 1 8 7.8 97.8 90.2 60.0 30.7 80.0 5s i-c i r c_N E K 6 0.4 30.0 5*2.4 00.0 9*4 0.1 73.4 5*1 9.6 90.8 9*7 2.8 94.3 1*9 9.1 14.5 3*0.5 70.0 5*0.3 80.0 4*与s i-N C组比较,*P0.0 12.3 c i r c_N E K 6靶向m i R-5 0 3-5 p通过生 物 信 息 学 方 法 预 测 出m i R-5 0 3-5 p在c i r c_N E K 6上存在互补序列,见图2。双荧光素酶实验 结 果 显 示m i R-5 0 3-5 p过 表 达 抑 制w t-c i r c_N E K 6的荧光素酶活性(0.4 40.0 5)v s.(0.9 90.0 7),P0.0 5,证明m i R-5 0 3-5 p是c i r c_N E K 6下游靶标。2.4 m i R-5 0 3-5 p对U 2 6 6细胞功能的影响相较于m i R-N C组,m i R-5 0 3-5 p转染后U 2 6 6细胞中m i R-5 0 3-5 p含量显著升高(P0.0 1)。进一步功能试验结果显示,上调m i R-5 0 3-5 p后U 2 6 6细胞增殖抑制率升高,凋亡率升高,克隆形成数量以及细胞迁移数量减少(均P 0.0 1)。此外,上调m i R-5 0 3-5 p抑制U 2 6 6细胞中B c l-2的表达,促进B a x蛋白表达(均P 0.0 1),见图3、表2。315葛金丽等.c i r c_N E K 6/m i R-5 0 3-5 p对多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡及迁移的影响图2 c i r c_N E K 6和m i R-5 0 3-5 p的互补序列F i g.2T h ec o m p l e m e n t a r ys e q u e n c eo f c i r c_N E K 6a n dm i R-5 0 3-5 pA:W e s t e r nb l o t检测B a x和B c l-2的蛋白表达;B:流式细胞术检测细胞凋亡图3 m i R-5 0 3-5 p对U 2 6 6细胞凋亡及相关蛋白表达的影响F i g.3E f f e c t so fm i R-5 0 3-5 po nU 2 6 6c e l l a p o p t o s i sa n dr e l a t e dp r o t e i ne x p r e s s i o n表2 m i R-5 0 3-5 p对U 2 6 6细胞增殖、凋亡和迁移的影响(xs,n=9)T a b l e2 E f f e c t so fm i R-5 0 3-5 po nU 2 6 6c e l l p r o l i f e r a t i o n,a p o p t o s i sa n dm i g r a t i o n(xs,n=9)组别m i R-5 0 3-5 p表达量增殖抑制率(%)凋亡率(%)克隆形成数迁移细胞数B a x表达量B c l-2表达量m i R-N C1.0 00.0 00.0 00.0 06.8 60.5 71 2 2.6 77.6 0 1 8 3.8 99.6 00.2 80.0 30.7 50.0 6m i R-5 0 3-5 p2.8 50.1 6*4 6.7 62.3 6*2 2.9 51.2 8*6 2.1 12.5 6*8 0.3 33.0 6*0.6 60.0 5*0.2 30.0 2*与m i R-N C组比较,*P0.0 12.5 抑制m i R-5 0 3-5 p影响s i-c i r c_N E K 6介导的U 2 6 6细胞增殖和迁移 s i-c i r c_N E K 6+a n t i-m i R-5 0 3-5 p组U 2 6 6细胞中m i R-5 0 3-5 p含 量 相 较 于s i-c i r c_N E K 6+a n t i-m i R-N C组显著降低,证明转染成功。随后我们发现敲低m i R-5 0 3-5 p逆转s i-c i r c_N E K 6介导的增殖抑制率升高、克隆形成数量以及细胞迁移数量减少(均P0.0 1),见表3。表3 m i R-5 0 3-5 p抑制剂对s i-c i r c_N E K 6介导的U 2 6 6细胞增殖和迁移的影响T a b l e3 E f f e c t so fm i R-5 0 3-5 p i n h i b i t o ro ns i-c i r c_N E K 6-m e d i a t e dp r o l i f e r a t i o na n dm i g r a t i o no fU 2 6 6c e l l s(xs,n=9)组别m i R-5 0 3-5 p表达量增殖抑制率(%)克隆形成数迁移细胞数s i-c i r c_N E K 6+a n t i-m i R-N C1.0 00.0 04 0.4 11.8 57 0.8 93.3 99 9.7 87.0 8s i-c i r c_N E K 6+a n t i-m i R-5 0 3-5 p0.3 10.0 5*1 5.8 81.0 3*1 0 5.4 47.6 6*1 6 4.0 08.8 4*与s i-c i r c_N E K 6+a n t i-m i R-N C组比较,*P0.0 12.6 抑制m i R-5 0 3-5 p影响s i-c i r c_N E K 6介导的U 2 6 6细胞凋亡 此外,我们还证实a n t i-m i R-5 0 3-5 p转染相较于a n t i-m i R-N C转染可以减弱s i-c i r c_N E K 6介导的凋亡率升高(P0.0 1),B a x高表达以及B c l-2低表达(均P0.0 1),见图4、表4。表4 m i R-5 0 3-5 p抑制剂对s i-c i r c_N E K 6介导的U 2 6 6细胞凋亡的影响T a b l e4 E f f e c t so fm i R-5 0 3-5 p i n h i b i t o ro ns i-c i r c_N E K 6-m e d i a t e dU 2 6 6c e l l a p o p t o s i s(xs,n=9)组别凋亡率(%)B a xB c l-2s i-c i r c_N E K 6+a n t i-m i R-N C1 9.8 61.2 80.5 80.0 50.3 70.0 4s i-c i r c_N E K 6+a n t i-m i R-5 0 3-5 p9.7 90.5 6*0.3 40.0 3*0.5 70.0 6*与s i-c i r c_N E K 6+a n t i-m i R-N C组比较,*P0.0 13 讨论c i r c R NA在各种组织中高度丰富,并由于其环状结构,相较于其他线性R NA非常稳定6。近年来,已有研究表明,c i r c R NA s具有多种生物学功能,并与包括癌症在内的多种疾病的发病机制相关7。415华中科技大学学报(医学版)2 0 2 3年8月第5 2卷第4期A:W e s t e r nb l o t检测B a x和B c l-2的蛋白表达;B:流式细胞术检测细胞凋亡图4 m i R-5 0 3-5 p抑制剂对s i-c i r c_N E K 6介导的U 2 6 6细胞凋亡及相关蛋白表达的影响F i g.4E f f e c t so fm i R-5 0 3-5 p i n h i b i t o ro ns i-c i r c_N E K 6-m e d i a t e dU 2 6 6c e l l a p o p t o s i sa n dr e l a t e dp r o t e i ne x p r e s s i o n多发性骨髓瘤约占所有血液系统恶性肿瘤的1 0%,目前,尽管该疾病的治疗已取得重大进展,使多发性骨髓瘤患者的生存率在过去的1 5年里有了显著的改善8,但患者仍然面临着疾病的复发,其治愈仍然难以实现。靶向治疗是一种针对控制癌细胞生长、分裂和扩散的蛋白质的癌症治疗方法。它是精准医疗的基础。越来越多的证据表明c i r c R NA s是靶向治疗的潜在靶点9。c i r c R NA在多发性骨髓瘤组织中差异表达,可能作为多发性骨髓瘤治疗、诊断和预后的生物标志物1 0。研究表明c i r c R NA可通过调控m i R NA/mR NA分子轴而参与多发性骨髓瘤发生及发展过程1 1。因此,本文对c i r c_N E K 6在多发性骨 髓 瘤 中 的 作 用 进 行 了 研 究,并 探 讨 了c i r c_N E K 6能否作为该病的治疗靶点。有研究表明,c i r c_N E K 6在甲状腺癌细胞中呈高表达,并可通过靶向调控m i R-3 7 0-3 p表达而促进甲状腺癌细胞增殖及侵袭1 2。c i r c_N E K 6高表达可通过调控m i R-3 7 0-3 p/MYH 9表达而促进甲状腺癌发展进程1 3。本研究结果显示,c i r c_N E K 6在多发性骨髓瘤患者血清中上调,敲低后可抑制细胞增殖和迁移,提示c i r c_N E K 6可促进多发性骨髓瘤细胞增殖和迁移。此外,我们还发现敲低c i r c_N E K 6表达导致细胞凋亡率升高。B a x和B c l-2都是细胞质蛋白,B a x蛋白是促凋亡蛋白,通过从线粒体释放细胞色素c激活级联反应,从而促进C a s p a s e的连续激活并最终导致细胞凋亡,而B c l-2属于抗凋亡蛋白,被认为可以阻止B a x释放细胞色素c,从而抑制凋亡机制的下游激活,诱导细胞存活1 4。在此,敲低c i r c_N E K 6提高了细胞凋亡率和B a x水平,而降低了B c l-2水平,进一步提示c i r c_N E K 6对多发性骨髓瘤细胞凋亡有抑制作用。因此c i r c_N E K 6s i R NA的使用可能是未来多发性骨髓瘤c i r c R NA靶向治疗的研究方向。c i r c R NA被广泛报道的功能是充当m i R NA海绵,m i R NA通常与靶mR NA结合诱导mR NA降解或翻译抑制,c i r c R NA通过广泛结合m i R NA,降低其活性,从而上调其靶mR NA s的表达1 5。在本次实验中,我们指出c i r c_N E K 6可靶向m i R-5 0 3-5 p。报 道 显 示,m i R-5 0 3-5 p可 通 过 靶 向 调 控T R A F 4表达而抑制宫颈癌细胞增殖及侵袭1 6。在本研究,m i R-5 0 3-5 p在多发性骨髓瘤患者血清中低表达,且能抑制细胞生长以及迁移。此外,m i R-5 0 3-5 p抑制剂可消除c i r c_N E K 6敲低对多发性骨髓瘤细胞生长和迁移的抑制作用,提示c i r c_N E K 6可充当m i R-5 0 3-5 p的海绵而促进多发性骨髓瘤细胞生长及 迁 移。m i R NA s最 近 被 发 现 在 癌 症 中 调 节J AK-S T AT信号,J AK 2/S T AT 3通路的磷酸化与抗凋亡有关1 7。在多发性骨髓瘤中,J AK/S T AT 3信号通路的激活依然发挥重要的促进作用。m i R-5 0 3-5 p能够抑制J AK/S T AT 3磷酸化,抑制J AK 2/S T AT 3信 号 通 路 的 激 活,从 而 抑 制 卵 巢 癌 的 恶化1 8。因此,m i R-5 0 3-5 p可能是通过调节J AK 2/S T AT 3信号通路抑制多发性骨髓瘤细胞生长及迁移,这还需要我们在后续的研究中进一步的探索和论证。综上所述,c i r c_N E K 6在多发性骨髓瘤患者血清中 表 达 上 调,而m i R-5 0 3-5 p表 达 下 调。c i r c_N E K 6可负向调控m i R-5 0 3-5 p的表达,进而促进多发性骨髓瘤细胞生长及迁移。本研究指出,靶向抑制c i r c_N E K 6可能是治疗多发性骨髓瘤的有效途径,填补了c i r c_N E K 6在多发性骨髓瘤发病机制中分子作用的知识空白。参 考 文 献1 S o n gY,H uN,S o n gX,e t a l.H s a_c i r c_0 0 0 7 8 4 1e n h a n c e sm u l t i p l em y e l o m ac