外源基因表达调控2.ppt

三.转录调控序列对外源基因表达的影响n1.高等植物基因的分子结构特点.n2.5-端表达调控序列的基本特征.n3.启动子和增强子.n(1)组成型启动子:CaMV 35S启动子,NOS启动子,其他启动子.n(2)诱导型启动子:光诱导型启动子(如SSrbc or rbcS,LHCP a/b),损伤型启动子(如PI-II),其他诱导型启动子(如HSP70,对激素ABA敏感的启动子等)n(3)组织特异型启动子:叶特异表达启动子,花粉特异表达启动子,糊粉层特异表达启动子,其他组织特异性启动子.2.诱导型启动子诱导型启动子 所谓诱导型启动子就是在某些特定的物理或化学信号的刺激下，可以大幅度地提高基因转录水平的启动子。该类启动子常以诱导信号命名，如光诱导表达基因启动子；热诱导表达基因启动子；创伤诱导表达基因启动子；真菌诱导表达基因启动子等。损伤诱导型启动子nPI-II:蛋白酶抑制II基因,损伤信号如细胞壁释放的多糖等诱导.n例 PI-II 大约1000bp5调控区+cat 转化烟草叶组织中表现损伤诱导活性.P6B+cat 组成嵌合基因无损伤活性只有组成型表达.从而证实PI-II的启动自由RNA5帽位点-892一段序列组成.PI-II 5-端调控区-892 CAP site 糖反应 损伤反应 n +n-573 +_ n -453 _ _n -520 +n n -547 _ n -624 _ _n 注:Cat为报告基因 ,除了具有损伤诱导特性外也能被六碳糖,双糖,三糖所激活,有机酸及三羧酸循环代谢物也有为弱作用.损伤反应因子位于序列-573 -624之间.其它诱导型启动子n来自果蝇的HSP70基因的热诱导启动子.n菜豆的几丁质酶(chitinase)启动子,对真菌侵染敏感.n马铃薯块茎蛋白基因I(Class I Patatin)启动子糖诱导.n水稻对激素,ABA敏感的启动子等.(3).组织特异性启动子组织特异性启动子 也称为器官特异性启动子，在这类启动子的调控下，基因的表达往往只发生在某些特定的器官或组织部位，并往往表现出发育调节的特性。这种特异性通常以特定的组织细胞结构和化学物理信号为存在的基础。典型的组织特异性启动子有：马铃薯块茎蛋白基因启动子；小麦胚乳特异表达的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因启动子；番茄果实成熟特异性表达的多聚半乳糖醛酸酶基因启动子；花粉特异表达基因（lat52）启动子和木质部特异表达的苯丙氨酸脂肪酶基因（pal）启动子等。(3)组织特异性组织特异性(Tissue-specific)启动子启动子和器官特异性和器官特异性(organ specific)启动子启动子n1.叶特异表达启动子 LHCP a/b(Cab):光诱导叶组织中特异表达.光合有关的基因，叶绿体特有的基因只在叶片中而且依赖叶绿体才能表达.马铃薯块茎蛋白I基因(Class I Patatin)启动子具有块茎特异表达和损伤蔗糖诱导活性.马铃薯的叶/茎特异表达基因(ST-LST)的5上游调控序列与马铃薯块茎结构蛋白基因及3-末端形成嵌合基因可以在转化烟草的茎叶内特异表达.而该结构蛋白基因通常只在马铃薯的块茎中表达.组织特异性组织特异性(Tissue-specific)启动子和器官特异性启动子和器官特异性(organ specific)启动子启动子2.花粉特异性表达启花粉特异性表达启动子子花药的TA29(1.1Kb)和TA13(1.2Kb)的mRNA互补,绒毡层特异表达.分别在TA29和TA13上游5端克隆到1.5Kb的启动子片断,分别与GUS融合(PTA29-GUS,PTA13-GUS)转化烟草,检查花药，子房，花瓣，叶，根，茎不同组织表达情况,结果：花药中检测到,而且TA29探针只与花药第二阶段的绒毡层细胞强烈杂交.说明：TA29和TA13 5端调控序列有器官，发育特异性,TA29 5端上游含有绒毡层细胞特异表达的全部信息.组织特异性组织特异性(Tissue-specific)启动子和器官特异性启动子和器官特异性(organ specific)启动子启动子人工创造雄性不育TA291.5 kb promoter+黑曲霉RNase T1或芽孢杆菌RNase(Barnase)融合基因转化烟草,结果转化株与对照相比表型没有差别,但无花粉亦不能结种子,而花柱正常,雌性的育性不受影响.生物学特征表明表型的雄性不育是由于导入TA29-RNase T1(Barnase),转化植株中的RNase基因在绒毡层细胞内特异地大量表达,从而降低了细胞中的RNA,抑制了绒毡层的形成引起花粉败育,导致雄性不育.组织特异性组织特异性(Tissue-specific)启动子和器官特异性启动子和器官特异性(organ specific)启动子启动子n3.糊粉层特异表达启动子大麦的-淀粉酶(-amylase)组分I 的基因通常amy 只在发芽大麦的糊粉层表达.（植物激素GA3 可诱导其表达,ABA可以抵消GA3 的作用）把P amy+NPT II融合,转化不同来源的原生质体,结果NPT II可以在糊粉层来源的原生质体内低水平表达,GA3可以是表达水平提高10倍,ABA可以抵消GA3 的作用;盾片来源的原生质体只能低水平表达,而且不受激素影响;在叶肉原生质体中根本不表达.对照用P35S-NPT II,在三种不同来源的原生质体中都高效表达,而且不受激素的影响.说明P amy不但具有激素诱导活性而且具有组织特异性.组织特异性组织特异性(Tissue-specific)启动子和器官特异性启动子和器官特异性(organ specific)启动子启动子n大麦的-淀粉酶(-amylase)启动子的诱导特性.n n大麦原生质体分别来自糊粉层,盾片及叶肉.GA3:赤霉素,ABA:脱落酸.GA3可诱导-amylase 的表达,ABA对GA3有抵消作用.说明：amy启动子不但具有激素诱导活性，而且有组织特异性嵌合基因组构 -GA3 +GA3 +GA3+ABA糊粉层盾片叶肉糊粉层盾片叶肉糊粉层盾片叶肉-amy-NPT II_+_35 S-NPT II+组织特异性组织特异性(Tissue-specific)启动子和器官特异性启动子和器官特异性(organ specific)启动子启动子n4.其他组织特异启动子小麦胚乳特异表达的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因P.番茄果实成熟特异性表达PG酶基因启动子.花粉特异表达基因LAT52启动子.木质部特异表达PAL(苯丙氨酸脂肪酶)基因启动子.三.mRNA3-端非编码区序列对外源基因表达的影响n真核生物中:hnRNA mRNA(加帽,加尾)n n1.3-端序列的基本特征（图）mRNA加尾过程三.mRNA3-端非编码区序列对外源基因表达的影响n3端调控序列对CAT基因在植物细胞内表达水平的影响n通过缺失突变发现位于PI-II终止子Poly(A)信号下游100bp 一段含8bp 组成的保守序列 CGTGTTTT 对于基因高效表达是必需的.这段序列广泛存在于动、植物的转录终止子内(YGTGTTYY),这段序列的缺失将极大地影响基因表达水平.3端来源5-端来源马铃薯PI-IIT-DNA gene 6BT-DNA gene7马铃薯PI-II高低低CaMV 35S高低低 9 CGTGTCTT15-20 AAUAAA 100 CGTGTTTT三.mRNA3-端非编码区序列对外源基因表达的影响n2.不同来源的3-端序列对外源基因表达的影响.由P35S-NPT II不同3端构成的嵌合基因在转化烟草中的转录水平,试验结果为8次平均值表达强弱相差最多60倍.尽管植物和动物基因3-端调控序列有许多共同点,但是植物细胞却不能有效地识别动物mRNA的PloyA信号,说明两者之间还存在尚未发现的本质上的差异.3-端来源长度NPT II相对活性章鱼碱合成酶基因(ocs)320bp12S种子蛋白基因(2S)650bp1/5rbcS基因(2S)600bp3伸展蛋白基因(Ext)735bp1/10查尔酮合成酶基因CHS)287bp1/22 不同来源的有着很大影响。使用35S启动子与NPTII结构基因形成共整合体，并于不同来源的终止子构建成融合基因，转化烟草。发现不同的终止子使NPTII基因的表达水平可相差60倍。植物基因的终止密码子多用UGA，而在双子叶植物中，UAA的使用频率高于UGA。四.5-端内含子对外源基因的表达调控作用n1.5-端内含子的特点.n2.5-端内含子对外源基因表达的促进n玉米SHI 5-端内含子,胚乳蔗糖酶基因(6kb)16exon,在启动子后面有一段非编码的外显子,并紧随着一个大的内含子(intron I,1028bp)nP exon intronI I intron intron n n +1 ATG 6kb四.5-端内含子对外源基因的表达调控作用n玉米shrunk基因内含子1(shi intron)的存在对cat 酶活性表达的影响nSh1 promoter intron I(1028bp)cat gene cat活性(rice)n 58n 0n 1nP35S 数10倍n 0n n 1四.5-端内含子对外源基因的表达调控作用n玉米shrunk gene 1 外显子1(exon 1)的作用n Promoter cat cat 在玉米,水稻细胞中的表达活性n 1n n intronl 100 n exoI 10n 1000nshrunk gene 1内含子的存在对cat gene在烟草植株内的表达有抑制作用.四.5-端内含子对外源基因的表达调控作用n3.作用机理:n 5-端内含子并不具有增强子那样的结构和序列,内含子促进基因表达是通过增加mRNA活性以及提高mRNA含量来实现的.可能还包括增加mRNA稳定性既促进mRNA成熟等作用.五.外源基因在转(翻)译水平的调控n1.mRNA结构对翻译的影响n S-D序列(Shine-Dalgarno)核糖体结合位点.原核mRNA翻译起始所必需,细菌中3-9bp 组成.在mRNA上与16S核糖体RNA3端互补，从而控制翻译的起始.n真核生物中无此结构,但有帽子到AUG之间的先导序列(leader),可以形成二级结构被核糖体识别,依此来调节翻译的速度。往往二级结构多对翻译不利.五.外源基因在转翻译水平的调控n2.翻译增强因子对转录的影响n(1)TMV 因子来自TMV126KD 蛋白基因的转录序列5-末端的非翻译区,68nt 组成.在AUG 之前,并有3个8nt 组成的重复序列.在AUG 前51处,因子提供了另外一个核糖体结合位点.推测因子促进mRNA翻译是通过提供一个额外的核糖体结合位点实现的.体外实验证明:5含因子的GUS基因的mRNA在烟草细胞内的翻译水平比不用因子高64倍.而且对植物动物和微生物细胞的翻译都有促进作用.五.外源基因在转翻译水平的调控n2.翻译增强因子对转录的影响n(2)AMV的样因子 AMV RNA 的436nt的先导序列也具有提高外源基因的翻译活性的功能.推测是由于这段序列不形成特定的二级结构,从而提高翻译的效率。这与因子正好相反.常用及样因子提高翻译效率,使外源基因有效表达.五.外源基因在转翻译水平的调控n因子对翻译的促进n GUS mRNA GUS活性n 1n 因子 GUS mRNA n 64n因子:68nt 组成来源于TMV 126KD 的转录序列5-端非翻译区,含有3个8nt 的重复序列-51处可能提供了一个额外的核糖体结合位点.五.外源基因在转翻译水平的调控n3.碱基组成 植物基因的GC含量显著高于细菌.n4.密码子的偏好性n密码子的通用性.植物基因在编码氨基酸的同义密码子之间的选择上是有偏好的(codon bias).由于密码的兼并性和摆动性而产生选择偏好即第三位选择G,C 还是A,U.n例:植物叶绿体线粒体基因同义密码子第三位更偏爱AU NNA/U 65%n绿藻,氰化细菌爱GC,NNG/C90%,n植物核基因单子叶GC NNG/C75%,n 双子叶轻微偏好NNG/C55%.五.外源基因在转翻译水平的调控n5.起始密码周边序列的影响n不同类型的细胞对mRNA起始周边序列有不同的要求,植物倾向于 AXA*ATGGC.n有资料显示，ATG之前第三位的A对翻译效率影响很大。n例:向植物中引入Bt基因的改造6.信号肽序列对转化外源基因翻译产物的调控作用信号肽序列对转化外源基因翻译产物的调控作用 翻译的完成不是基因表达的结束，初级翻译产物并不具有生物活性，称之为前体蛋白。它通常还需要加工、修饰和正确折叠才能成为有活性的蛋白。前体蛋白的信号肽与活性蛋白的成熟有关、也与蛋白质的运输和分泌有关。五.外源基因在转翻译水平的调控n6.信号肽序列对外源基因的翻译蛋白的运输和定向作用翻译的完成不是基因表达的结束，初级翻译产物并不具有生物活性，称之为前体蛋白。它通常还需要加工、修饰和正确折叠才能成为有活性的蛋白。前体蛋白的信号肽与活性蛋白的成熟有关、也与蛋白质的运输和分泌有关。分泌型运转型根据目的基因的蛋白起作用的部位选择相应的信号肽DNA序列，构成融合基因，使其融合表达六.转基因植物中外源DNA整合的遗传效应对基因表达的影响n遗传效应：n位置效应（position effect）n重组（重排）效应（recombination）n甲基化（methylation）n 转基因沉默（transgene silencing）六.转基因植物中外源DNA整合的遗传效应对基因表达的影响（一）位置效应Hilder认为，位置效应是由于插入位点附近染色体的微环境影响了外源基因启动子的表达所致。等容线（isochore):在染色体的各个区段，碱基组成是不均匀的，在某些区段常含有固定的较高的GC碱基对，这样的组成方式，称为等容线。产生易于识别的甲基化位点例：玉米al基因转化的烟草株系之一，al失活测序结果显示，al基因与插入位点两侧碱基组成差异太大。Al基因47.5AT 烟草插入点574AT 3 77 ATIglesias等烟草试验：六.转基因植物中外源DNA整合的遗传效应对基因表达的影响(二）重组（重排）效应转基因很容易被植物基因组的重组和修复系统所识别，结果将使外源DNA不同程度的重排。转基因的同源和非同源的重组必然引起DNA的易位、缺失、重复等结构变化。Peerbolte(1996)用Ti质粒转化烟草DNA结构分析证明基因在转化细胞中发生缺失、重排和扩增，导致表型变异。Southern 杂交除了目的基因的杂交带外，还有大小不一的条带。说明外源基因在受体细胞内存在结构、拷贝数等有差异，是由于整合时引起的DNA重组造成的。六.转基因植物中外源DNA整合的遗传效应对基因表达的影响（三）甲基化作用（Methylation)高等植物DNA中大约30的胞嘧啶核苷酸残基被甲基化，抑制基因的表达。是由于甲基化酶作用，真核细胞中多发生在CG二核苷酸对。对基因表达的作用1.影响DNA与蛋白质的相互识别2.影响DNA的构像。ZDNA去甲基化试剂如：5azac 可以认为去甲基化实验例证：朱祯发生甲基化的机理或原因：限制修饰系统、基因组免疫功能（genomic immune function)识别，(等容线差异识别）六.转基因植物中外源DNA整合的遗传效应对基因表达的影响（四）（四）转基因沉默基因沉默转基因在受体植物中往往不能稳定表达，有时甚至完全不表达，出现了所谓的转基因沉默现象（transgene silencing）。是指利用遗传转化方法导入并稳定整合进受体细胞中的完整的外源基因在当代转化体或在其后代中表达受到抑制的现象。转基因沉默的机理基因沉默的机理外源基因进入受体细胞核后，会受到多种因素的作用，根据其作用机制和水平不同可分为三种：位置效应（position effect）、转录水平的基因沉默（transcriptional gene silencing，TGS）和转录后水平的基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）。涉及DNA-DNA DNA-RNA RNA-RNA 分子之间的相互作用n转录水平的基因沉默 n转录水平的基因沉默是DNA水平上基因调控的结果，主要是由启动子甲基化或导入基因异染色质化所造成的。二者都和转基因重复序列有密切关系。重复序列可导致自身甲基化。外源基因如果以多拷贝的形式整合到同一位点上，形成首尾相连的正向重复（direct repeat）或头对头、尾对尾的反向重复（inverted repeat），则不能表达。而且拷贝数越多，基因沉默现象越严重。这种重复序列诱导的基因沉默（repeat-induced gene silencing，RIGS）可能是重复序列间自发配对，甲基化酶特异性地识别这种配对结构而使其甲基化，从而抑制其表达。此外，重复序列间的相互配对还可以导致自身的异染色质化。其机理可能是异染色质化相关蛋白质识别重复序列间配对形成的拓扑结构，与之结合，并将重复序列牵引到异染色质区，或直接使重复序列局部异染色质化。n转录后水平的基因沉默 n转录后水平的基因沉默是RNA水平基因调控的结果，比转录水平的基因沉默更普遍。特别是共抑制（cosuppression）共抑制是指在外源基因沉默的同时，与其同源的内源DNA的表达也受到抑制。转录后水平的基因沉默的特点是外源基因能够转录成mRNA，但正常的mRNA不能积累，也就是说mRNA一经合成就被降解或被相应的反义RNA或蛋白质封闭，从而失去功能。可能是由于同源或重复的基因表达了过量mRNA的结果。有人提出，细胞内可能存在一种RNA监视机制用以排除过量的RNA。当mRNA超过一定的域值后，就引发了这一机制。特异性的降解与外源基因同源的所有RNA。此外，过量的RNA也可能和同源的DNA相互作用导致重新甲基化，使基因失活。共抑制，矮牵牛CHS（四）（四）转基因沉默基因沉默n转基因沉默的机理基因沉默的机理重复序列是基因沉默的普遍诱因，甲基化是基因沉默的直接原因n上述三种机制并不是独立的，而是相互关联的。基因沉默机制在核酸水平上均是DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA相互作用的结果，所以人们认为对基因沉默机制的研究开启了认识DNA水平及RNA水平上调节基因表达的新纪元，并提出了基因免疫，即基因组对外源基因入侵有抵抗能力的新观念。六.转基因植物中外源DNA整合的遗传效应对基因表达的影响克服克服转转基因沉默的策略基因沉默的策略1、转基因密码子优化及转化载体的合理修饰，使用具有组织和发育特异性调控作用的增强子：由于转基因DNA序列与受体植物基因组DNA碱基不同是引发DNA甲基化的重要原因，所以在开展遗传转化前非常有必要对转基因进行密码子的优化工作，尽量使用植物偏爱密码子。为避免反式失活及共抑制，转化载体中应尽量避免使用相同的启动子及重复序列并保证载体上的构建序列应在同一个方向阅读以免产生异常或反义RNA。六.转基因植物中外源DNA整合的遗传效应对基因表达的影响2、在有性生殖后代中筛选单拷贝转基因个体，避免多拷贝引起的转基因沉默：如利用southern杂交，反向PCR等来确定，如采用常规的杂交、回交等，通过分析后代分离比来确定。筛选到单拷贝转基因个体后，要对转基因纯合株系转基因表达的稳定性进行鉴定。可以通过组培来了解环境胁迫引起的转基因的甲基化，并结合不同田间条件及不同遗传背景开展转基因表达稳定性的鉴定。六.转基因植物中外源DNA整合的遗传效应对基因表达的影响3、选择合适转化方法以及在遗传转化方法上的改进：基因直接转化法极易导致多拷贝转基因在宿主细胞中的整合，最终导致转基因沉默。农杆菌介导的遗传转化法由于其产生的拷贝数相对较少，可以在一定程度上避免这个问题。（1）选用基于Ac/Ds转座系统建立的转化载体：该转化载体能扩大寄主范围，提高转化效率及转基因位点的质量。（2）利用细菌噬菌体P1 Cre-lox、酿酒酵母FLP-FRT和接合酵母R-rs位点特异性重组系统，将转基因以单拷贝、位点特异地整合到事先整合有lox、FRT、rs位点的植物上。克服克服转基因沉默的策略基因沉默的策略3、遗传转化方法上的改进：（3）利用双元细菌人工染色体（binary bacterial artificial chromosome，BIBAC）载体系统使大片段外源DNA稳定整合到宿主细胞基因组中：据报道，利用BIBAC载体把150kb的外源DNA整合到烟草中，并且整合的完整外源DNA能在后代中稳定遗传。克服克服转基因沉默的策略基因沉默的策略4、利用MAR（Matrix attachment region）或SAR（Scaffold attachment region）：MAR或SAR指是被限制性内切酶消化后仍与核骨架结合的DNA序列，位于染色体的端粒附近，长度一般为30bp-1000bp，通常富含AT，两个MAR之间的染色质区域可形成大小为5kb-200kb的DNA环，构成独立的表达结构。MAR通过对染色质结构的直接限制而起作用，使转基因不能形成稳定的凝聚染色质结构，保证了转录的正常进行，使RNA酶聚合酶容易接近这种结构，从而提高了转基因的表达效率，而且由于MAR能使转基因形成一个独立区域，不受周围宿主染色质顺式调控元件的影响，使相邻的转录单元保持相对的独立性，从而使转基因稳定表达，避免了转基因表达的位置效应。克服克服转基因沉默的策略基因沉默的策略5、去甲基化试剂5-氮胞苷的使用：5-氮胞苷是一种去甲基化试剂，它能使因甲基化而失活的转基因恢复表达活性。水稻研究中发现：5-氮胞苷虽然能使10%左右的转基因沉默植株恢复表达活性，但是经5-氮胞苷处理过的转基因水稻普遍出现植株矮小、结实率、分蘖数大幅度下降、生育期延迟等不利性状。再加上5-氮胞苷价格昂贵且具有致癌性，其实用价值不高。转基因沉默现象的发生与外界环境条件及人为因素紧密相关。不同光照、温度、培养条件、环境胁迫、以及有性杂交、嫁接等处理等都会造成转基因沉默。克服克服转基因沉默的策略基因沉默的策略 转基因沉默现象已经成为生物遗传工程体走向商品化和实用化的巨大障碍，同时它也向从事分子生物学及植物分子遗传育种研究的专家提出了严峻的挑战。如何减少并克服转基因沉默已经成为世界各国生物界亟待解决的问题。随着人们对转基因沉默机理研究的不断深入以及分子生物学和分子育种学科的不断发展，将来转基因沉默的问题一定能得到很好的控制和解决