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欢迎各位参加分子生物学实验课的学习周晓晶中心法则中心法则 (The Central Dogma)转转录录翻翻 译译逆转录逆转录复复 制制实验主线实验主线实验内容基因工程目的基因在宿胞中宿胞中克隆或表达克隆或表达制备目的基因片段制备目的基因片段载体的选择和制备载体的选择和制备DNA片段的重组连接片段的重组连接DNA重组重组重组重组DNA导入导入宿主细胞宿主细胞重组子的筛选重组子的筛选重组子的鉴定重组子的鉴定实验一基因组DNA提取及鉴定实验仪器的使用注意事项实验仪器的使用注意事项加样器的使用方法加样器的使用方法：1、如何调节量程，两挡之间的关系；2、使用时应在量程之内调节，超过量程会损坏加样器3、不能将加样器倒置以防液体导流损坏加样器；离心机的使用注意事项：离心机的使用注意事项：1、样品平衡，设定离心时间，逐渐升到要求转速。2、离心管的盖子要盖严，以防液体漏到离心机内；提取基因组提取基因组DNADNA的原理：的原理：真核细胞基因组真核细胞基因组DNADNA存在的形式存在的形式白细胞白细胞白细胞基因组基因组DNA裂解细胞去除杂质提取？提取？基因组基因组DNA提取步骤提取步骤原理原理真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因组 DNA。真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚酚和和氯氯仿仿/异异戊戊醇醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。酚抽提法原理：酚抽提法原理：1、裂解细胞：用SDS溶解细胞膜、核膜上脂质成分；蛋白酶K消化细胞上包括组蛋白在内的蛋白成分。达到裂解细胞、分离DNA和组蛋白的目的。2.去除蛋白等杂质成分：酚和氯仿抽提样品，可以使样品中的蛋白质变性沉淀，可通过离心去除。酚对蛋白有强烈的变性作用，为防止其对后续试验的影响，一般再用氯仿抽提去除残留的酚。3.沉淀收集DNA:在单价阳离子存在的情况下，乙醇可以使DNA链之间发生聚集，出现沉淀。可离心收集。实验步骤实验步骤1、取0.3ml抗凝血置于1.5mlEppendorf中.2、加入1mlSTMT溶液，充分混匀，使其溶血。STMT溶液：四种成份的英文缩写S:Sugar8%T:TritonX-1001%M:Mgcl20.5mMT:Tris-HCL10mM(PH:8.0)作用：提供低渗环境及用Triton细胞膜上打孔，帮助裂解红细胞。3、12,000rpm,离心5分钟(统一离心),弃上清。反复三次。离心时要注意离心机内样品是否平衡离心时要注意离心机内样品是否平衡4、加0.4ml生理盐水，轻弹管底混匀。5、同上统一离心，弃上清。6、加450ulNE溶液，混匀。NE溶液：N:NACL50mME:EDTA.Na225mM(PH:8.0)作用：金属离子螯合剂，清除溶液中的DNA酶激活所需的2价阳离子，达到抑制DNA酶活性的目的。混匀时确认沉淀已被悬起。混匀时确认沉淀已被悬起。7、加30ul10%SDS,迅速混匀。SDS：十二烷基硫酸钠终浓度0.5%作用：a.阴离子型去污剂-溶脂性，有破胞作用b.对核酸酶有抑制作用；c.具有使核酸从组蛋白上游离出来的作用8、加50ul蛋白酶K(20mg/ml),混匀，置50C水浴1-2小时。蛋白酶K(或链霉蛋白酶)是广谱蛋白酶，能在SDS和EDTA的存在下保持很高的活性，在DNA提取反应体系中，SDS将细胞膜、核膜破坏,并将组氨酸从组蛋白分子上拆下；而EDTA则能抑制细胞中DNase的活性。注意30ul、50ul加样体积的准确。9、加入等体积TE饱和酚500ul，轻摇1min，12,000rpm,10min,将上层水相移至一新管中。TE饱和重蒸苯酚：重蒸酚：去除酚（无色）的氧化产物（黄、粉红色），如醌等，后者破坏磷酸二脂键。作用：变性蛋白质，而对DNA结构没有影响。TE溶液:Tris-Hcl10mM(pH:8.0)EDTA.Na21mM(pH:8.0)作用：提供略碱的pH值，保证DNA溶于水相。在酸性条件下，DNA分配于有机相。8-羟基喹啉：0.1%黄色酚相指示剂抗氧化剂1、TE饱和酚上层为水相，注意抽取下层酚相。2、抽取酚的加样器头用过即弃掉。3、转移水相时，要尽量抽尽，又不可吸起酚相。4、为避免DNA链由于物理因素断裂，轻柔操作。10、加入等体积酚氯仿混合液（1:1）,同步骤7离心。将上层水相移至一新管中。氯仿/异戊醇(24:1)氯仿作用：a.与酚共同使用可增强去蛋白效果；b.并对核酸酶有抑制作用；c.单独使用可去除溶液中残留的微量酚。异戊醇作用：减少操作过程中气泡的产生。11、加入等体积氯仿-异戊醇，轻摇1min，12,000rpm,10min。将上层水相移至一新管中。12、加入1/10体积（约50ul）醋酸钠于上清中。醋酸钠：3MpH:5.2作用：提供单价阳离子。13、加入2-2.5倍体积（约1ml）无水乙醇，混匀，置-20C1小时或-70C15min。无水乙醇：沉淀DNA14、12,000rpm,10min,弃上清。15、室温干燥10min。16、加入50ul双蒸水，溶解沉淀,17、取10ulDNA溶液，0.8%琼脂糖凝胶电泳。于样品中加1-2ul上样液，混合后加入上样孔内。1伏分钟18、电泳后照相，分析结果。19、取10ulDNA溶液，于紫外-可见分光光度计下定量。琼脂糖凝胶电泳原理琼脂糖凝胶电泳原理DNA分子在pH8.0的电泳环境中，带负电荷，在一定强度电场力的作用下，从负极向正极迁移。电泳样品载体琼脂糖是一种线性多糖聚合物，煮沸冷却后形成网格样结构，电泳中起分子筛作用。通常情况下，分子量大的DNA电泳过程中由于受到的阻力较大，泳动速率较慢，反之，分子量较小的DNA片断跑在前面。琼脂糖凝胶电泳常用试剂琼脂糖凝胶电泳常用试剂上样液成份：1）0.25%溴酚蓝或/和0.25%二甲苯酚-样品指示剂2）40%蔗糖或30%甘油-增加样品比重，利于加样。电泳缓冲液：TAE为例T:Tris碱A:冰乙酸E:EDTA提供有一定缓冲能力的pH值(8.0),EDTA尚可抑制DNA酶的作用。溴乙锭：染色剂一种荧光染料，分子呈扁平型，可嵌入到DNA或RNA的碱基之间。在紫外光激发下能发出红色的荧光。根据DNA片断的不同长度应采用不同浓度的琼脂糖才能达到较好的分离效果：线性DNA片断大小（kb）琼脂糖浓度（%）5600.40.8100.70.461.00.241.50.231.750.132.0Fig20-1:DNAseparationbygelelectrophoresislargemoderate smallAfter electrDNADNA浓度测定浓度测定原理：1、分光光度计的工作原理。2、DNA的紫外吸收特性。计算公式：C(ug/ml)=A260*稀释倍数*50ug/mlDNA纯度鉴定：OD260/OD2801.8，混有RNA OD260/OD2801.6，混有蛋白质或酚。1.6 OD260/OD2801.8 1.6 OD260/OD2801.8，样品较纯。，样品较纯。提取基因组的常见目的：提取基因组的常见目的：基因组基因组DNA一般用于一般用于Southern杂交、杂交、构建构建DNA文库或做文库或做PCR反应的模板。反应的模板。