菊花的组织培养.ppt

课题课题1 菊花的组织培养菊花的组织培养菊菊花花的的品品种种繁繁多多123 菊菊花花是是菊菊科科菊菊属属的的多多年年生生宿宿根根草草本本植植物物,是是我我国国的的传传统统名名花花和和世世界界四四大大切切花花之之一。一。长长期期以以来来菊菊花花采采用用分分株株、扦扦插插等等无无性性繁繁殖殖方方法法进进行行繁繁殖殖。但但是是传传统统的的繁繁殖殖方方法法易易受受环环境境影影响响,繁繁殖殖周周期期长长,随随着着市市场场需需求求的的急急剧剧增增加加,已已经经不不能能满满足足市市场场日日益益发发展展的的需要。需要。植物组织培养属于无性生殖中营养生植物组织培养属于无性生殖中营养生殖殖 营养生殖包括：营养生殖包括：4扦插扦插5嫁接6压条压条 7植物组织培养：植物组织培养：植物组织培养：植物组织培养：当当植物细胞植物细胞脱离了原来所在植物体的脱离了原来所在植物体的器官或组织器官或组织而处于而处于离体状态离体状态时，在一定的时，在一定的营养物质营养物质、激素激素（细胞分裂素、生长素）（细胞分裂素、生长素）和其他和其他外外界条件界条件（温度、（温度、pHpH、光照、无菌等）、光照、无菌等）的作用下，就的作用下，就可能表现出可能表现出全能性全能性，发育成完整的植株，发育成完整的植株，这种培育新植株的方法，叫做植物的组织这种培育新植株的方法，叫做植物的组织培养。培养。820世纪初，曾有人提出能否将植物的薄壁细胞培养成完整植株？研究者从胡萝卜根的韧皮部取下一块组织，并在液体培养基中培养，使其分化出了愈伤组织，从愈伤组织又得到胚状体，胚状体转移到固体培养基上继续培养后，获得了完整的胡萝卜试管植株。经过栽培，此植株能够正常生长并开花结果，其种子繁衍出来的后代与正常植株的种子所繁衍出的后代别无二致。根据此实验可以得出以下结论：即不经过有性生殖过程也能将植物的薄壁细胞培养出与母体一样的完整植株。由于植物的每个有核细胞都携带着母体的全部基因，故在一定条件下，它们均能发育成完整植株，这就是所谓的植物细胞全能性。植物组织培养发展简史9科学家在植物激素对器官建成，及改进培养基配方等方面所取得的成果，极大地推动了组织培养技术的发展，使这项技术可以实际应用于快速繁殖、品种改良等方面。20世纪50年代初期，法国科学家利用组织培养技术成功地脱除了染病大丽花植株所携带的病毒，从而为脱毒苗的生产提供了一种可行的途径。现在凭借组织培养技术来脱除植物的病毒已经在生产中广泛应用。20世纪50年代中期，由于细胞分裂素的发现，使组织培养状态下外植体芽的形态建成成为可人为调控的因素，从而使在组织培养状况下进行植株再生成为现实。进入60年代以后，组织培养技术在基础理论、实际操作方面不断取得进展，相继在植物体细胞杂交、单倍体育种、种质资源保存、快速育苗、人工种子制造、次生代谢物生产等方面有了可喜的成果。时至今日，组织培养技术已经成为基础坚实、易于掌握、应用面广的一种技术手段。10 （一）植物组织培养的（一）植物组织培养的 理论基础理论基础n概念：高度分化的植物细胞，仍然具有发育成概念：高度分化的植物细胞，仍然具有发育成n 完整新个体完整新个体的潜能。的潜能。n基础：生物体的每一个细胞都包含有基础：生物体的每一个细胞都包含有该物种该物种所所n 特有特有全套遗传物质全套遗传物质，都有发育成为完整，都有发育成为完整n 个体所必需的个体所必需的全部基因全部基因。因为它们都是。因为它们都是n 由由同一个同一个受精卵细胞受精卵细胞有丝分裂分化而来。有丝分裂分化而来。基础知识：基础知识：细胞全能性细胞全能性11细胞全能性的特点：高度分化的植物细胞在离体的情况下，在一定的营养物质、激素和其他适宜的外界条件下，才能表现其全能性。动物已分化的体细胞全能性受限制，但细胞核仍具有全能性植物细胞要表现全能性，步骤：植物细胞要表现全能性，步骤：1.成熟细胞成熟细胞 分生细胞分生细胞 胚状体胚状体 完整植株完整植株2.成熟细胞成熟细胞 愈伤组织愈伤组织 出根出芽出根出芽完整植株完整植株12n需要条件：1.离体 2.一定的营养物质 3.植物激素：主要是生长素和细胞分裂素 4.适宜温度和pH细胞全能性大小：细胞全能性大小：受精卵受精卵 生殖细胞生殖细胞 体细胞体细胞 植物细胞植物细胞 动物细胞动物细胞 分化程度低的细胞分化程度低的细胞 分化程度高的细胞分化程度高的细胞13植物组织培养过程：植物组织培养过程：离离离离体体体体的的的的植植植植物物物物器器器器官官官官组组组组织织织织或或或或细细细细胞胞胞胞植植植植物物物物体体体体 脱分化脱分化脱分化脱分化（细胞分裂）（细胞分裂）（细胞分裂）（细胞分裂）愈愈愈愈伤伤伤伤组组组组织织织织芽芽芽芽根根根根细胞分裂细胞分裂细胞分裂细胞分裂素素素素 生长素生长素生长素生长素细胞分裂细胞分裂细胞分裂细胞分裂素素素素 生长素生长素生长素生长素细胞分裂素细胞分裂素细胞分裂素细胞分裂素 生长素生长素生长素生长素细胞分裂素细胞分裂素细胞分裂素细胞分裂素 有利于根的分化，有利于根的分化，有利于根的分化，有利于根的分化，抑制芽的形成抑制芽的形成抑制芽的形成抑制芽的形成有利于芽的分化，抑制根的形成有利于芽的分化，抑制根的形成有利于芽的分化，抑制根的形成有利于芽的分化，抑制根的形成促进愈伤组织的形成促进愈伤组织的形成促进愈伤组织的形成促进愈伤组织的形成v v激素的使用顺序、使用量及比例影响植物细胞的发育方向：激素的使用顺序、使用量及比例影响植物细胞的发育方向：激素的使用顺序、使用量及比例影响植物细胞的发育方向：激素的使用顺序、使用量及比例影响植物细胞的发育方向：先使用生长素，后使用细胞分裂素先使用生长素，后使用细胞分裂素先使用生长素，后使用细胞分裂素先使用生长素，后使用细胞分裂素 有利于细胞分裂，但不利分化有利于细胞分裂，但不利分化有利于细胞分裂，但不利分化有利于细胞分裂，但不利分化先使用细胞分裂素，后使用生长素先使用细胞分裂素，后使用生长素先使用细胞分裂素，后使用生长素先使用细胞分裂素，后使用生长素同时使用同时使用同时使用同时使用细胞既分裂也分化细胞既分裂也分化细胞既分裂也分化细胞既分裂也分化分化频率提高分化频率提高分化频率提高分化频率提高29菊花的组织培养程序：菊花的组织培养程序：制备制备MSMS固体培养基固体培养基 外植体消毒外植体消毒接种接种培养培养移栽移栽栽培栽培实验流程图：实验流程图：30课外拓展课外拓展nMS培养基是Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。基于此，这种培养基就用他们的名字来命名了。31MSMS培养基主要成分：培养基主要成分：大量元素大量元素:N:N、P P、K K、CaCa、S S、MgMg等等微量元素微量元素:B:B、MnMn、CuCu、ZnZn、FeFe、MoMo、I I、CoCo等等有机物：甘氨酸、烟酸、肌醇、有机物：甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等维生素、蔗糖等植物激素：生长素、细胞分裂素、植物激素：生长素、细胞分裂素、赤霉素等赤霉素等323334微生物培养基的配方和MS培养基的配方相比，有哪些明显的不同？微生物培养基以有机营养为主。与微生物的培养不同，MS培养基则需提供大量无机营养，无机盐混合物包括植物生长必须的大量元素和微量元素两大类。35（一）制备（一）制备MSMS固体培养基：固体培养基：MS MS培养基包括培养基包括2020多种营养成分，实验室多种营养成分，实验室一般使用一般使用44保存配制好的保存配制好的培养基母液培养基母液来制备。来制备。1 1配制各种母液：配制各种母液：无机物中大量元素浓缩无机物中大量元素浓缩1010倍，微量元素浓缩倍，微量元素浓缩 100100倍，常温保存。倍，常温保存。激素类、维生素类以及用量较小的有机物一激素类、维生素类以及用量较小的有机物一 般可按般可按1mg/mL1mg/mL的质量浓度单独配制成母液。的质量浓度单独配制成母液。用母液配制培养基时，需要根据各种母液的用母液配制培养基时，需要根据各种母液的 浓缩倍数，计算用量。浓缩倍数，计算用量。实验操作实验操作362 2配制培养基：配制培养基：分装到锥形瓶中，每瓶分装分装到锥形瓶中，每瓶分装50mL50mL或或100mL100mL。配制培养液：配制培养液：配制培养液：配制培养液：配制配制配制配制1LMS1LMS1LMS1LMS培养基时，先将称好的琼培养基时，先将称好的琼培养基时，先将称好的琼培养基时，先将称好的琼 脂加入脂加入脂加入脂加入800mL800mL800mL800mL蒸馏水，加热使琼脂熔化，然后加入蒸馏水，加热使琼脂熔化，然后加入蒸馏水，加热使琼脂熔化，然后加入蒸馏水，加热使琼脂熔化，然后加入 蔗糖蔗糖蔗糖蔗糖30g30g30g30g，取配制好的大量元素、微量元素、有机，取配制好的大量元素、微量元素、有机，取配制好的大量元素、微量元素、有机，取配制好的大量元素、微量元素、有机 物和植物激素的母液，依次加入，加蒸馏水定容物和植物激素的母液，依次加入，加蒸馏水定容物和植物激素的母液，依次加入，加蒸馏水定容物和植物激素的母液，依次加入，加蒸馏水定容 至至至至1000mL1000mL1000mL1000mL。调调pHpH：培养基的分装培养基的分装:由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因 此不必添加植物激素。此不必添加植物激素。3 3灭菌：灭菌：将分装好的培养基连同其他将分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌。器械一起进行高压蒸汽灭菌。371 1 1 1选材：选材：选材：选材：菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝。菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝。菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝。菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝。（二）外植体消毒：（二）外植体消毒：2 2 2 2消毒：消毒：消毒：消毒：流水冲洗：流水冲洗：流水冲洗：流水冲洗：菊花茎段用菊花茎段用菊花茎段用菊花茎段用流水冲洗流水冲洗流水冲洗流水冲洗后可少许洗衣粉，用软后可少许洗衣粉，用软后可少许洗衣粉，用软后可少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20min20min20min20min左右。左右。左右。左右。酒精处理：酒精处理：酒精处理：酒精处理：用用用用无菌吸水纸无菌吸水纸无菌吸水纸无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入吸干外植体表面的水分，放入吸干外植体表面的水分，放入吸干外植体表面的水分，放入体积分数为体积分数为体积分数为体积分数为70707070的酒精的酒精的酒精的酒精中摇动中摇动中摇动中摇动2 2 2 23 3 3 3次，次，次，次，持续持续持续持续6 6 6 67s7s7s7s，立即将外植体取出，在，立即将外植体取出，在，立即将外植体取出，在，立即将外植体取出，在无菌水无菌水无菌水无菌水中清洗。中清洗。中清洗。中清洗。消毒液处理：消毒液处理：消毒液处理：消毒液处理：取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入放入放入放入质量分数为质量分数为质量分数为质量分数为0.10.10.10.1的氯化汞溶液的氯化汞溶液的氯化汞溶液的氯化汞溶液中中中中1 1 1 12min2min2min2min，取出后，在取出后，在取出后，在取出后，在无菌水无菌水无菌水无菌水中至少清洗中至少清洗中至少清洗中至少清洗3 3 3 3次，漂净次，漂净次，漂净次，漂净消毒液。消毒液。消毒液。消毒液。(外植体：用于离体培养的植物外植体：用于离体培养的植物器官器官或或组织组织片段。片段。)38（三）接种：（三）接种：接种前用接种前用接种前用接种前用体积分数为体积分数为体积分数为体积分数为70707070的酒精的酒精的酒精的酒精将工作台擦拭将工作台擦拭将工作台擦拭将工作台擦拭一遍，然后点燃酒精灯。因为污染的主要来源是空一遍，然后点燃酒精灯。因为污染的主要来源是空一遍，然后点燃酒精灯。因为污染的主要来源是空一遍，然后点燃酒精灯。因为污染的主要来源是空气中的气中的气中的气中的细菌和孢子细菌和孢子细菌和孢子细菌和孢子。1 1接种室消毒：接种室消毒：2 2无菌操作要求：无菌操作要求：所有的接种操作都必须在酒精灯火焰旁完成，所有的接种操作都必须在酒精灯火焰旁完成，所有的接种操作都必须在酒精灯火焰旁完成，所有的接种操作都必须在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼烧灭菌。每次使用器械后，都需要用火焰灼烧灭菌。每次使用器械后，都需要用火焰灼烧灭菌。每次使用器械后，都需要用火焰灼烧灭菌。393 3材料的切取和接种：材料的切取和接种：将消过毒的菊花茎段在将消过毒的菊花茎段在无菌培养皿无菌培养皿中切成中切成0.50.51cm的小段，用的小段，用镊子镊子夹取夹取菊花茎段接种。菊花茎段接种。4 4接种注意事项：接种注意事项：每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数为每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数为每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数为每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数为 70707070的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火 焰上烧一遍，冷却后再接种。焰上烧一遍，冷却后再接种。焰上烧一遍，冷却后再接种。焰上烧一遍，冷却后再接种。40 外植体在培养基中要分布均匀，放置外植外植体在培养基中要分布均匀，放置外植外植体在培养基中要分布均匀，放置外植外植体在培养基中要分布均匀，放置外植 体数量根据锥形瓶的大小确定，一般体数量根据锥形瓶的大小确定，一般体数量根据锥形瓶的大小确定，一般体数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝胡萝胡萝胡萝 卜卜卜卜3 3 3 34 4 4 4块，菊花块，菊花块，菊花块，菊花6 6 6 68 8 8 8块块块块，也不要太少，以，也不要太少，以，也不要太少，以，也不要太少，以 充分利用培养基中的营养成分和光照条件。充分利用培养基中的营养成分和光照条件。充分利用培养基中的营养成分和光照条件。充分利用培养基中的营养成分和光照条件。插入时应注意茎段方向，插入时应注意茎段方向，插入时应注意茎段方向，插入时应注意茎段方向，形态学上端朝上，形态学上端朝上，形态学上端朝上，形态学上端朝上，形态学下端朝下，形态学下端朝下，形态学下端朝下，形态学下端朝下，不要倒插。茎段、茎尖不要倒插。茎段、茎尖不要倒插。茎段、茎尖不要倒插。茎段、茎尖 基部插入培养基利于吸收水分和养分。基部插入培养基利于吸收水分和养分。基部插入培养基利于吸收水分和养分。基部插入培养基利于吸收水分和养分。41（四）培养：（四）培养：n n 接接接接种种种种后后后后的的的的锥锥锥锥形形形形瓶瓶瓶瓶最最最最好好好好放放放放在在在在无无无无菌菌菌菌箱箱箱箱中中中中培培培培养养养养，培培培培养养养养期间应定期消毒。培养温度控制在期间应定期消毒。培养温度控制在期间应定期消毒。培养温度控制在期间应定期消毒。培养温度控制在1818181822222222。n n每日用日光灯每日用日光灯每日用日光灯每日用日光灯光照光照光照光照12h12h12h12h。（五）移栽：（五）移栽：1 1打开封口膜：打开封口膜：移栽生根的菊花试管苗之前，应先打移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的封口膜，让试管苗在培养间生开培养瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日。一般放置在长几日。一般放置在20202525的的遮荫环境遮荫环境中，适应中，适应5 57d7d。试管苗不萎蔫，有新生长试管苗不萎蔫，有新生长的趋势，便可移栽。的趋势，便可移栽。422 2清洗转移：清洗转移：用流水清洗根部的培养基，将幼苗移植用流水清洗根部的培养基，将幼苗移植到消过毒的到消过毒的蛭石或珍珠岩蛭石或珍珠岩等环境下生活一段等环境下生活一段时间。时间。3 3移栽：移栽：待幼苗长壮后再移栽到土壤中。待幼苗长壮后再移栽到土壤中。43珍珠岩珍珠岩：珍珠岩是一种火山喷发的珍珠岩是一种火山喷发的酸性熔岩，经急剧冷却而成的酸性熔岩，经急剧冷却而成的玻璃质岩石，有弧形或圆形裂玻璃质岩石，有弧形或圆形裂隙，如珍珠的结构，所以被命隙，如珍珠的结构，所以被命名为珍珠岩名为珍珠岩。蛭石：蛭石：是一种天然、无毒是一种天然、无毒的矿物质，在高温作用下的矿物质，在高温作用下会膨胀的矿物。它是一种会膨胀的矿物。它是一种比较少见的矿物，属于硅比较少见的矿物，属于硅酸盐。酸盐。44（六）栽培：（六）栽培：将幼苗移栽后，每天观察记录幼苗生将幼苗移栽后，每天观察记录幼苗生长情况，适时浇水、施肥，直至开花。长情况，适时浇水、施肥，直至开花。45n1、培养基的配置。要根据不同的材料，不同的物种，选择合适的培养基，最好有一组实验取得。做培养基的过程中注意调剂培养基的PH值，有些高温分解的激素要过滤灭菌等。n2、培养材料的选择，需要选择生长较好材料植物组织培养的注意事项：463 严格无菌操作，无菌技术是植物组织培养获得成功关键。1）无菌技术包括对培养基、器械、和植物材料的灭菌消毒。对培养材料进行表面消毒时，一方面要考虑到要药剂消毒效果，另方面要考虑到植物材料的耐受性。2）妥善处理被污染培养物。3）有毒物质要妥善处理，以免造成环境污染。外植体可以用酒精消毒；操作前手需用酒精消毒；培养基 需用高压蒸汽灭菌。47n4接种时注意：n 1）每接种一块外植体前，镊子要放入体积分数为70%的酒精中消毒一次，然后再酒精灯火焰上烧灼一遍，冷却后再接种。2）外植体在培养基重要分布均匀，以充分利用培养基中的营养成分和光照条件。3）插入时应注意方向，不要倒插。茎段 茎尖基部插入培养基有利于吸收水分和养分。4）接种后几十个瓶盖好瓶盖，做好标记，写明接种材料，接种日期。n5、培养条件的选择，包括光照、温度、湿度等。48植物组织培养的优点：植物组织培养的优点：n1.不受生长季节限制地繁殖植物。n2.不携带病毒。n3.培养周期短。n4.可用组培中的愈伤组织制取特殊的生化制品。n5.可短时间大量繁殖，用于拯救濒危植物。n6.可诱导之分化成需要的器官，如根和芽。n7.解决有些植物产种子少或无的难题。如将香蕉进行组培得到人工种以方便移种。49植物组织培养的用途：植物组织培养的用途：n快速繁殖优良植物株系n培育作物新品种n获得无病植株n保存和运输种质CNgeli认为在生殖细胞成分中可区别为二种，其中在雌雄两生殖细胞中等量存在的为遗传的基本物质称种质。而在雌性生殖细胞中多量存在的与营养有关的物质称营养质Ernhrungsplasma认为种质是被限定了方向的胶囊之集合AWeismann将核的染色质看成是种质种质有时又称基因是连续的遗传物质501 1培育无病毒植物：如脱毒马铃薯、菊花、草培育无病毒植物：如脱毒马铃薯、菊花、草 莓等的培育。莓等的培育。2 2大规模培养愈伤组织：用于生产药物、食品大规模培养愈伤组织：用于生产药物、食品 添加剂、香料、色素、杀虫剂等，如从愈伤添加剂、香料、色素、杀虫剂等，如从愈伤 组织中提取的紫草素，是用于治疗烫伤和割组织中提取的紫草素，是用于治疗烫伤和割 伤的药物以及染料和化妆品的原料。伤的药物以及染料和化妆品的原料。4 4基因工程中也要用到植物组织培养的方法：基因工程中也要用到植物组织培养的方法：受体细胞为植物细胞时。受体细胞为植物细胞时。植物组织培养的应用：植物组织培养的应用：3 3制成人工种子：解决有些作物品种繁殖能力制成人工种子：解决有些作物品种繁殖能力 差，结子困难或发芽率低等问题。差，结子困难或发芽率低等问题。51