微生物资源讲义——第三章.ppt

1897年以后，年以后，Buchner二发现酶的细胞外作用现象，从而二发现酶的细胞外作用现象，从而导致了酶的商品化生产、最初的商品酶制剂主要以动植物为原料导致了酶的商品化生产、最初的商品酶制剂主要以动植物为原料提取，如从牛胃中提取凝乳酶、从胰脏中提取胰酶、从血液中提提取，如从牛胃中提取凝乳酶、从胰脏中提取胰酶、从血液中提取凝血酶及从植物材料中提取淀粉酶等。之后，取凝血酶及从植物材料中提取淀粉酶等。之后，Takamiine利用利用霉菌来生产淀粉酶使得酶制剂工业取得突破。其方法甚至在今天霉菌来生产淀粉酶使得酶制剂工业取得突破。其方法甚至在今天仍被采用。第二次世界大战以后，随着微生物培养技术、发酵工仍被采用。第二次世界大战以后，随着微生物培养技术、发酵工艺和设备的日臻完善，利用微生物来获得商品化酶制剂已形成规艺和设备的日臻完善，利用微生物来获得商品化酶制剂已形成规模化产业，并开辟了广阔的市场。模化产业，并开辟了广阔的市场。20世纪世纪90年代以后，随着基因工程的广泛介入，一年代以后，随着基因工程的广泛介入，一些原来只能由动物或植物生产的酶，经过酶基因重组，些原来只能由动物或植物生产的酶，经过酶基因重组，可以在微生物上得到表达。由于在发酵过程中很容易对可以在微生物上得到表达。由于在发酵过程中很容易对微生物进行控制，因此微生物进行控制，因此“基因工程基因工程+发酵工艺发酵工艺+先进发先进发酵设备酵设备”可以算是酶上业的第三次飞跃。在这次飞跃中，可以算是酶上业的第三次飞跃。在这次飞跃中，微生物作为酶制剂来源的地位得到了进一步的加强，显微生物作为酶制剂来源的地位得到了进一步的加强，显示出了动植物无法与其比拟的巨大优越性。示出了动植物无法与其比拟的巨大优越性。第二节第二节 微生物酶的开发微生物酶的开发一一 应用微生物来开发酶的优点应用微生物来开发酶的优点1 微生物生长繁殖快、生活周期短微生物生长繁殖快、生活周期短2 微生物种类繁多，代谢方式多样，几乎能生产几乎任何一种酶微生物种类繁多，代谢方式多样，几乎能生产几乎任何一种酶二二 微生物酶开发的一般程序微生物酶开发的一般程序菌种的分离是整个工作的第一个关键步骤。分离应注意以下几个问题：菌种的分离是整个工作的第一个关键步骤。分离应注意以下几个问题：分离培养基的确定；分离培养基的确定；分离培养条件的选择，如培养温度、湿度、好氧或厌氧培养等；分离培养条件的选择，如培养温度、湿度、好氧或厌氧培养等；在分离的最初阶段一般不给予严密的培养条件，尽可能分离到尽可能在分离的最初阶段一般不给予严密的培养条件，尽可能分离到尽可能 多的纯菌种。在这种情况下，在菌种的分离阶段可以选用广泛的分离多的纯菌种。在这种情况下，在菌种的分离阶段可以选用广泛的分离 培养基培养基(各种分离培养基中还应针对性地加人目的酶产生菌的作用底各种分离培养基中还应针对性地加人目的酶产生菌的作用底 物物)。分离对象可包括细菌、真菌、酵母菌及放线菌等，并且分离条。分离对象可包括细菌、真菌、酵母菌及放线菌等，并且分离条 件也应做到多样化，比如吸取的土样稀释液量的控制、不同的培养温件也应做到多样化，比如吸取的土样稀释液量的控制、不同的培养温 度选择等。分离到的单菌落应立即转移到与分离成分一致的新鲜斜面度选择等。分离到的单菌落应立即转移到与分离成分一致的新鲜斜面 上，待获得纯培养之后就可着手进行初筛。上，待获得纯培养之后就可着手进行初筛。(二二)菌种的分离菌种的分离(三三)菌种的初筛菌种的初筛方法：方法：用简单的定性反应进行初筛；用简单的定性反应进行初筛；定性反应定性反应可以包括可以包括颜色反应、有无水解圈、有无特殊气体生成颜色反应、有无水解圈、有无特殊气体生成 等等(其中，其中，平板培养透明圈法平板培养透明圈法是筛选水解酶类常用的有效方法。是筛选水解酶类常用的有效方法。一般是将所需目的酶的作用底物加人适当的平板培养基内，在一般是将所需目的酶的作用底物加人适当的平板培养基内，在 培养结束之后，直接根据透明圈的直径与菌落直径的比值来判培养结束之后，直接根据透明圈的直径与菌落直径的比值来判 断菌体的产酶能力断菌体的产酶能力)。目的：目的：就是要用最简单和最快捷的方法来对大量的待筛菌进行测试。就是要用最简单和最快捷的方法来对大量的待筛菌进行测试。因此因此：为提高工作效率，对于初筛而言，建立有效的初筛模型是最为为提高工作效率，对于初筛而言，建立有效的初筛模型是最为 重要的一个环节。重要的一个环节。斜面菌种斜面菌种挑入挑入EP管中管中超声破碎超声破碎吸取吸取200ul上清液于上清液于定性测定平板内定性测定平板内记录水解圈与菌记录水解圈与菌落直径比的大小落直径比的大小蛋白酶蛋白酶生产菌生产菌的初筛的初筛以脂肪酶产生菌的初筛为例，以脂肪酶产生菌的初筛为例，其分离培养基的成分为：乳化橄榄油其分离培养基的成分为：乳化橄榄油2%，硫酸铵，硫酸铵 0.5%，磷酸氢二钾，磷酸氢二钾0.5%，硫酸镁，硫酸镁0.1%，酵母浸膏，酵母浸膏0.05%，去氧胆酸盐，去氧胆酸盐0.1%，琼脂，琼脂2%,pH5.8。与常规的分离培养基不同，这种脂肪酶产生菌筛选培养基中的作用底物橄榄与常规的分离培养基不同，这种脂肪酶产生菌筛选培养基中的作用底物橄榄油得到了充分的乳化且其中还加人了去氧胆酸盐，这样就可以保证当有适合油得到了充分的乳化且其中还加人了去氧胆酸盐，这样就可以保证当有适合的胞外脂肪酶产生菌生长时，菌落周围就会出现清晰的水解圈。但这种方法的胞外脂肪酶产生菌生长时，菌落周围就会出现清晰的水解圈。但这种方法往往还得在获得所需纯培养之后补做定性测定，因为这个方法忽略了能产生往往还得在获得所需纯培养之后补做定性测定，因为这个方法忽略了能产生胞内酶的菌株。胞内酶的菌株。在最初分离阶段就给予特殊的培养基或培养条件，进而让目的在最初分离阶段就给予特殊的培养基或培养条件，进而让目的 菌株得以繁殖，尽可能地把只成为目的菌的菌株或只将其最适菌株得以繁殖，尽可能地把只成为目的菌的菌株或只将其最适 菌株的一株纯化分离。菌株的一株纯化分离。初筛的第初筛的第2种方法常常与菌种的分离工作同步进行种方法常常与菌种的分离工作同步进行(四四)菌种的复筛菌种的复筛目的：目的：是在初筛的基础上，筛选产酶量高、性能更符合生产要求是在初筛的基础上，筛选产酶量高、性能更符合生产要求的菌种的菌种复筛通常要进行摇瓶液体培养，即在接近发酵罐培养条件下培养菌体并复筛通常要进行摇瓶液体培养，即在接近发酵罐培养条件下培养菌体并检测其产酶能力。检测其产酶能力。在复筛阶段，酶活测定方法的建立十分重要。在复筛阶段，酶活测定方法的建立十分重要。在在初筛时初筛时，往往采用间接的，往往采用间接的“底物类似物底物类似物”测定法，这种方法的最大特测定法，这种方法的最大特点就是简便，酶的用量少，反应时间也较短点就是简便，酶的用量少，反应时间也较短:而在而在复筛阶段复筛阶段，由于接近生，由于接近生产的条件，故在酶的测定过程中需要用真正的底物。产的条件，故在酶的测定过程中需要用真正的底物。以脂肪酶为例以脂肪酶为例：在初筛定性测酶活的过程中，我们可以选用三酰甘油酯作为底物，这时在初筛定性测酶活的过程中，我们可以选用三酰甘油酯作为底物，这时生成的水解圈就很明显，易于对各菌种进行比较，但在复筛过程中就必生成的水解圈就很明显，易于对各菌种进行比较，但在复筛过程中就必须用橄榄油来进行实验。须用橄榄油来进行实验。最后，应该指出，除了可以从自然界中分离获最后，应该指出，除了可以从自然界中分离获得目的酶产生菌外，也可以从得目的酶产生菌外，也可以从已经保藏的菌种中筛选已经保藏的菌种中筛选产酶菌种。产酶菌种。这样做不仅可以节约大量的人力和物力，这样做不仅可以节约大量的人力和物力，而且可以根据前人的资料和经验，了解产酶微生物的而且可以根据前人的资料和经验，了解产酶微生物的类别，然后有目的地加以寻找，搜集有关菌种或相类类别，然后有目的地加以寻找，搜集有关菌种或相类似的微生物，则可达到事半功倍的效果。从保藏菌种似的微生物，则可达到事半功倍的效果。从保藏菌种中筛选产酶菌种，可以省去平板分离纯化这一步，直中筛选产酶菌种，可以省去平板分离纯化这一步，直接进行初筛和复筛。接进行初筛和复筛。对于经过复筛之后获得的高产菌株还应在此阶段进行考察。考察的对于经过复筛之后获得的高产菌株还应在此阶段进行考察。考察的指标包括以下一些内容：指标包括以下一些内容：不能是致病菌。其在系统发生上，应与病原体无关，也不产生毒不能是致病菌。其在系统发生上，应与病原体无关，也不产生毒 素。故在采用一个新的产酶菌株时，应有大量的病理或动物饲养素。故在采用一个新的产酶菌株时，应有大量的病理或动物饲养 实验资料以确证其卫生安全性。实验资料以确证其卫生安全性。所获菌株应不易变异和退化，不易感染噬菌体。所获菌株应不易变异和退化，不易感染噬菌体。微生物产酶量高，生长繁殖快。酶的性质符合应用的需要，而且微生物产酶量高，生长繁殖快。酶的性质符合应用的需要，而且 最好是产胞外酶的菌株。最好是产胞外酶的菌株。产生的酶便于分离和提纯，得率高。产生的酶便于分离和提纯，得率高。营养要求低。最好能利用廉价的农副产品作为营养物，这样可以营养要求低。最好能利用廉价的农副产品作为营养物，这样可以 降低生产成本。降低生产成本。(五五)对复筛获得的菌株的要求对复筛获得的菌株的要求1：培养方式的确定：培养方式的确定 在此阶段应从未来生产的成本、原料来源、生产工艺等在此阶段应从未来生产的成本、原料来源、生产工艺等一些因素出发，先确定一个适当的培养方式。一些因素出发，先确定一个适当的培养方式。液体法液体法 液体培养法就是用三角瓶装适量的液体培养基，液体培养法就是用三角瓶装适量的液体培养基，接种后，在摇床上振荡培养一段时间。液体法根据通气接种后，在摇床上振荡培养一段时间。液体法根据通气方法的不同，又可分为液体表面培养法和液体深层培养方法的不同，又可分为液体表面培养法和液体深层培养法两种。其中，液体深层通气培养条件与发酵罐相似，法两种。其中，液体深层通气培养条件与发酵罐相似，所以适应该法的目的菌株适合于发酵罐扩大培养。所以适应该法的目的菌株适合于发酵罐扩大培养。(六六)最佳产酶条件的初步确定最佳产酶条件的初步确定固体法固体法 固体培养法也叫做麸曲法，一般用麸皮、稻草、米糠等固体培养法也叫做麸曲法，一般用麸皮、稻草、米糠等农副产品为原料，加少量水，做成固体形式的培养基，让微生农副产品为原料，加少量水，做成固体形式的培养基，让微生物在其中生长并产生酶。用这种方法来培养菌体，在保温培养物在其中生长并产生酶。用这种方法来培养菌体，在保温培养期间，随着有机物质氧化成二氧化碳和水，麸皮培养基的重量期间，随着有机物质氧化成二氧化碳和水，麸皮培养基的重量会大大减轻。此时，间隔一段时间测量温度、会大大减轻。此时，间隔一段时间测量温度、pH、湿度、重量、湿度、重量损失及酶活，并且对温度和湿度进行人工控制。当酶量达到最损失及酶活，并且对温度和湿度进行人工控制。当酶量达到最大时就可以收获。该法广泛用于各种商品酶制剂的生产，如真大时就可以收获。该法广泛用于各种商品酶制剂的生产，如真菌淀粉酶、真菌蛋白酶、真菌葡萄糖酶、真菌纤维素酶、真菌菌淀粉酶、真菌蛋白酶、真菌葡萄糖酶、真菌纤维素酶、真菌凝乳酶等。凝乳酶等。2：最佳培养条件组合：最佳培养条件组合 在确定了培养方式之后，还必须确定最佳的培养条件在确定了培养方式之后，还必须确定最佳的培养条件组合。培养条件包括培养基中关键成分的用量、碳氮比、组合。培养条件包括培养基中关键成分的用量、碳氮比、培养温度、培养温度、pH等。最佳培养条件的确定可以通过设计工等。最佳培养条件的确定可以通过设计工作量适合的正交试验或均匀试验来进行。作量适合的正交试验或均匀试验来进行。3：胞内酶和胞外酶：胞内酶和胞外酶在进行扩大实验之前，还应注意到微生物所产酶的特性。一般说来，在几在进行扩大实验之前，还应注意到微生物所产酶的特性。一般说来，在几种微牛物产生的酶的性质大体相同的情况下，胞外酶是首选。种微牛物产生的酶的性质大体相同的情况下，胞外酶是首选。胞外酶具有以下一些胞外酶具有以下一些优点优点：分离提取容易，几不必破碎细胞，因而也就省去了去除核酸的工艺；分离提取容易，几不必破碎细胞，因而也就省去了去除核酸的工艺；胞外酶的生产不受可获得生物量的限制，因而容易得到较高的酶产量；胞外酶的生产不受可获得生物量的限制，因而容易得到较高的酶产量；胞外酶活性显现的最适条件与产酶菌株的最适生长条件往往一致，例如，胞外酶活性显现的最适条件与产酶菌株的最适生长条件往往一致，例如，来源于碱性环境的枯草芽袍杆菌的蛋白酶，其酶活性的最适来源于碱性环境的枯草芽袍杆菌的蛋白酶，其酶活性的最适pH就要比来源就要比来源 于中性环境的枯草芽抱杆菌蛋白酶高好几个单位。于中性环境的枯草芽抱杆菌蛋白酶高好几个单位。与之相反：与之相反：以胞内酶为商品酶生产的酶源，不仅生产工艺复杂，而且酶合成量的以胞内酶为商品酶生产的酶源，不仅生产工艺复杂，而且酶合成量的提高往往受提高往往受“饱和饱和”效应的限制，甚至给细胞带来毒性。胞内酶活性显现效应的限制，甚至给细胞带来毒性。胞内酶活性显现的最适条件与产酶菌株的最适生长条件并不一致的最适条件与产酶菌株的最适生长条件并不一致(如耐热菌的胞内酶，其热如耐热菌的胞内酶，其热稳定温度就常常低于产酶菌的生长温度稳定温度就常常低于产酶菌的生长温度)。并非所有的酶都可找到其相应的胞外酶产生菌，少数一些酶就只并非所有的酶都可找到其相应的胞外酶产生菌，少数一些酶就只能在微生物细胞内生成。比如葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、蔗糖酶、能在微生物细胞内生成。比如葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、蔗糖酶、乳糖酶等。另外，用于分子生物学研究的多聚核昔酸磷酸化酶、核糖乳糖酶等。另外，用于分子生物学研究的多聚核昔酸磷酸化酶、核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶核酸酶、脱氧核糖核酸酶,DNA聚合酶等也属于胞内酶。聚合酶等也属于胞内酶。产胞内酶的微生物多用深层培养法进行培养。在实验室水平上多产胞内酶的微生物多用深层培养法进行培养。在实验室水平上多用冻融、研磨或超声波法来破碎细胞壁，使细胞壁裂解以回收其中的用冻融、研磨或超声波法来破碎细胞壁，使细胞壁裂解以回收其中的酶。在工业应用丘还可通过控制培养温度的办法使细胞自溶来获取目酶。在工业应用丘还可通过控制培养温度的办法使细胞自溶来获取目的酶。的酶。4：微生物酶收集的时间顺序：微生物酶收集的时间顺序 酶的积累发生在菌体生活周期中的哪一个阶段，随着各菌种和酶的不酶的积累发生在菌体生活周期中的哪一个阶段，随着各菌种和酶的不同有很大变化。同有很大变化。除了延迟期外，在生长周期中的任何一个阶段，都可以大量除了延迟期外，在生长周期中的任何一个阶段，都可以大量出现所需要的酶。在某些情况下，胞外酶在对数生长期的早期就开始出现，出现所需要的酶。在某些情况下，胞外酶在对数生长期的早期就开始出现，并且在以后的几个阶段中继续增加数量。胞内酶可能主要产生于对数生长期，并且在以后的几个阶段中继续增加数量。胞内酶可能主要产生于对数生长期，但是，只有在衰亡期，当细胞被溶解时才释放到培养基中，因此，通常在对但是，只有在衰亡期，当细胞被溶解时才释放到培养基中，因此，通常在对数生长期的末期收集细胞以回收胞内酶最为合适，然后再利用菌体自溶、机数生长期的末期收集细胞以回收胞内酶最为合适，然后再利用菌体自溶、机械研磨或超声波处理使酶释放到提取液中。械研磨或超声波处理使酶释放到提取液中。图：细菌生长的典型曲线图：细菌生长的典型曲线(.延延迟迟期期，.对对数数期期，.稳稳定定期期，.衰亡期衰亡期)在以上工作结束之后，为了让微生物菌种的产酶能力得到进在以上工作结束之后，为了让微生物菌种的产酶能力得到进一步的提高，其方法一般有：一步的提高，其方法一般有：1.获得高产菌种的突变体；获得高产菌种的突变体；2.利用代谢调节机理来提高微生物的酶产量；利用代谢调节机理来提高微生物的酶产量；3.运用遗传、基因工程的手段将原有菌株中的目的酶基因转移运用遗传、基因工程的手段将原有菌株中的目的酶基因转移到另外一些对生产环境更具有适应性的微生物细胞之内使其到另外一些对生产环境更具有适应性的微生物细胞之内使其高效表达。高效表达。(七七)微生物产酶性能的进一步提高微生物产酶性能的进一步提高 1：目的酶产生菌高产突变体的获得：目的酶产生菌高产突变体的获得 高产突变菌种有着十分重要的意义。首先，高产突变株常常能够比高产突变菌种有着十分重要的意义。首先，高产突变株常常能够比亲株产生高出很多倍数量的酶。在另外一些情况下，突变株能够产生亲株产生高出很多倍数量的酶。在另外一些情况下，突变株能够产生比较少的不需要的酶或其他代谢产物，因而有利于酶的回收和提纯。比较少的不需要的酶或其他代谢产物，因而有利于酶的回收和提纯。而获得高产突变株的方法有以一下一些：而获得高产突变株的方法有以一下一些：物理和化学诱变该物理和化学诱变该 方法实际就是采用物理和化学因子来处理微方法实际就是采用物理和化学因子来处理微生物，并使其发生变异。常用的化学诱变剂有氮介子气、亚硝生物，并使其发生变异。常用的化学诱变剂有氮介子气、亚硝酸、硫酸二乙酯、环氧乙烷、乙烯亚胺等。物理因子有：紫外酸、硫酸二乙酯、环氧乙烷、乙烯亚胺等。物理因子有：紫外线、线、X射线、射线、射线等。诱变的基本流程如下所示：射线等。诱变的基本流程如下所示：利用代谢调节机理来获得突变株利用代谢调节机理来获得突变株 这实际上是一种定向选择获得原有微这实际上是一种定向选择获得原有微生物类群中可能存在的突变株的方法。生物类群中可能存在的突变株的方法。定向选择定向选择其实就是在某种只适其实就是在某种只适合于所需突变株生长的营养环境中来处理微生物，以达到富集突变株合于所需突变株生长的营养环境中来处理微生物，以达到富集突变株的目的。以选择不需要诱导物的大肠杆菌的目的。以选择不需要诱导物的大肠杆菌-半乳糖昔酶组成型突变株半乳糖昔酶组成型突变株为例，其方法如下为例，其方法如下:首先让大肠杆菌在含有葡萄糖的培养基中生长一段首先让大肠杆菌在含有葡萄糖的培养基中生长一段时期，这时候少数的组成型突变体和绝大多数时期，这时候少数的组成型突变体和绝大多数-半乳糖昔酶诱导型细半乳糖昔酶诱导型细胞并存。然后，将此混合培养物转移到乳糖培养基中，在这种条件下，胞并存。然后，将此混合培养物转移到乳糖培养基中，在这种条件下，由于诱导型细胞要经过一段诱导时间才能适应新的碳源，组成型突变由于诱导型细胞要经过一段诱导时间才能适应新的碳源，组成型突变体优先得到生长。这样经过几次重复之后，就可以将组成型突变体选体优先得到生长。这样经过几次重复之后，就可以将组成型突变体选择出来。择出来。2、利用代谢调节机理来提高微生物的酶产量、利用代谢调节机理来提高微生物的酶产量 由于微生物产生的各种酶均受诱导、终产物阻遏等许多调控机理由于微生物产生的各种酶均受诱导、终产物阻遏等许多调控机理来协调，因此，我们可以利用这些机理来达到我们提高微生物酶产来协调，因此，我们可以利用这些机理来达到我们提高微生物酶产量的目的。比如，许多分解代谢的酶类，一般都处于受阻遏状态，量的目的。比如，许多分解代谢的酶类，一般都处于受阻遏状态，为了达到解阻遏状态，就可以向微生物培养物中添加诱导物或诱导为了达到解阻遏状态，就可以向微生物培养物中添加诱导物或诱导物类似物物类似物:以大肠杆菌为例，当培养基中加入了异丙基以大肠杆菌为例，当培养基中加入了异丙基-D-硫代半硫代半乳糖苷后，可以使它的乳糖苷后，可以使它的-乳糖苷酶活性提高乳糖苷酶活性提高1000倍。另外，对于倍。另外，对于有终产物阻遏的酶而言，为获得较高的酶产量，首先在生长培养基有终产物阻遏的酶而言，为获得较高的酶产量，首先在生长培养基中就应尽量减少阻遏化合物的量，同时也应避免使用丰富的、复杂中就应尽量减少阻遏化合物的量，同时也应避免使用丰富的、复杂的或如葡萄糖一类能被快速分解利用的原料。的或如葡萄糖一类能被快速分解利用的原料。3.基因水平上的改造基因水平上的改造 酶的生成最终是受微生物细胞内酶基因的控制，而微生物可以借助酶的生成最终是受微生物细胞内酶基因的控制，而微生物可以借助结合、转化、转染、转导等途径来改变或重新组合遗传物质。因此，结合、转化、转染、转导等途径来改变或重新组合遗传物质。因此，最初人们就是利用了微生物的这个特性来对其进行基因改造的。但是，最初人们就是利用了微生物的这个特性来对其进行基因改造的。但是，这些方法还只能认为是在细胞水平上对微生物中的遗传物质进行操作。这些方法还只能认为是在细胞水平上对微生物中的遗传物质进行操作。之后，随着生物化学、微生物遗传学等学科的迅速发展，人们在基因之后，随着生物化学、微生物遗传学等学科的迅速发展，人们在基因水平进行基因改造取得了巨大进步。水平进行基因改造取得了巨大进步。基因工程基因工程(重组重组DNA技术技术)技术已技术已延伸到了生物学科的各个领域，其目标就是要从商业角度上充分利用延伸到了生物学科的各个领域，其目标就是要从商业角度上充分利用基因操作技术，从而能够更廉价、更清洁地生产现有的主要蛋白质产基因操作技术，从而能够更廉价、更清洁地生产现有的主要蛋白质产品，酶也是其中之一到目前为止，基因克隆已在酶生产菌的改良方面品，酶也是其中之一到目前为止，基因克隆已在酶生产菌的改良方面发挥了很大的作用，前景诱入。应用基因工程技术改良的工业酶已有发挥了很大的作用，前景诱入。应用基因工程技术改良的工业酶已有十余种，用于洗涤剂、淀粉加工、奶酪生产等。十余种，用于洗涤剂、淀粉加工、奶酪生产等。使酶基因在另一微生物上得到表达使酶基因在另一微生物上得到表达 酶基因的克隆和表达在原理上是比酶基因的克隆和表达在原理上是比 较简单的。首先是制备含有目的酶的较简单的。首先是制备含有目的酶的DNA片段，同时选择适当的载体片段，同时选择适当的载体(如质粒、如质粒、噬菌体等噬菌体等)，选用只有一个切点的限制性内切酶去切割环状，选用只有一个切点的限制性内切酶去切割环状质粒质粒DNA或者其他载体或者其他载体DNA分子，形成具有粘性末端的线形分子，然后，分子，形成具有粘性末端的线形分子，然后，用同种限制性内切酶切割外源用同种限制性内切酶切割外源DNA(通常是酶基因通常是酶基因)，形成相同的粘性末，形成相同的粘性末端。在联接酶的作用下，线状的载体端。在联接酶的作用下，线状的载体DNA分子与外源的分子与外源的DNA片段重组，片段重组，再用重组再用重组DNA分子去转化新的宿主细胞分子去转化新的宿主细胞(通常是一些生长周期短、营养要通常是一些生长周期短、营养要求低、可以利用发酵技术来大规模培养的微生物求低、可以利用发酵技术来大规模培养的微生物)。常用的转化方法是将。常用的转化方法是将克隆到质粒载体上的克隆到质粒载体上的DNA与经过与经过Ca2+处理过的感受态细胞一起保温，然处理过的感受态细胞一起保温，然后涂布到选择件培养基上，根据质粒卜标记基因的功能后涂布到选择件培养基上，根据质粒卜标记基因的功能(如对某种抗生素如对某种抗生素的抗性改变的抗性改变)来判断重组是否成功。转化之后，最常用的筛选方法就是利来判断重组是否成功。转化之后，最常用的筛选方法就是利用放射性标记的核酸探针进行杂交，鉴别出相应的重组体。之后，这样用放射性标记的核酸探针进行杂交，鉴别出相应的重组体。之后，这样的重组体就可以大量生产所需要的目的克隆酶。以淀粉酶为例，将支链的重组体就可以大量生产所需要的目的克隆酶。以淀粉酶为例，将支链淀粉酶编码的基因，引人到液化淀粉芽孢杆菌中，从而得到了能同时产淀粉酶编码的基因，引人到液化淀粉芽孢杆菌中，从而得到了能同时产生生a一淀粉酶和支链淀粉酶的产生菌，对生产非常有用。一淀粉酶和支链淀粉酶的产生菌，对生产非常有用。大幅度提高酶基因在细胞内的量大幅度提高酶基因在细胞内的量 由于酶量实际是受基因控制的，由于酶量实际是受基因控制的，因此我们也可以通过提高酶基因的量来促进酶的生成。以淀粉因此我们也可以通过提高酶基因的量来促进酶的生成。以淀粉酶为例，将淀粉液化芽饱杆菌的酶为例，将淀粉液化芽饱杆菌的-淀粉酶基因，克隆到多复制淀粉酶基因，克隆到多复制型质粒中，再转移到芽抱杆菌中。这时，酶基因复制的拷贝数型质粒中，再转移到芽抱杆菌中。这时，酶基因复制的拷贝数增加了增加了50倍，因而大大提高了酶的产量。倍，因而大大提高了酶的产量。(八八)微生物酶的提取方法微生物酶的提取方法 微生物酶的提取工作是为进一步了解酶的特性、完善酶开发后续工微生物酶的提取工作是为进一步了解酶的特性、完善酶开发后续工艺的一前提和基础。酶的提取按照不同的提纯要求又可分为艺的一前提和基础。酶的提取按照不同的提纯要求又可分为酶的粗提及酶的粗提及酶的精提酶的精提。1.酶的粗提酶的粗提 工业生产上用到的微生物酶一般用量都很大，纯度要求也不很高。工业生产上用到的微生物酶一般用量都很大，纯度要求也不很高。如果待开发的酶是工业用途的话，则提取方法可以比较粗放。具体的提如果待开发的酶是工业用途的话，则提取方法可以比较粗放。具体的提取流程如下：取流程如下：2.酶的精制酶的精制用于结构鉴定或其他特殊用途的酶，通常需要精制，其基用于结构鉴定或其他特殊用途的酶，通常需要精制，其基本流程如下本流程如下:一般流程一般流程结晶结晶 1、物物质质从从液液态态（溶溶液液或或溶溶融融状状态态）或或气气态态形形成成晶晶体体的的过过程程。2、晶晶体体，即即原原子子、离离子子或或分分子子按按一一定定的的空空间间次次序序排排列列而而形形成的固体。也叫结晶体。成的固体。也叫结晶体。结晶方法结晶方法 溶溶质质从从溶溶液液中中析析出出的的过过程程，可可分分为为晶晶核核生生成成（成成核核）和和晶晶体体生生长长两两个个阶阶段段，两两个个阶阶段段的的推推动动力力都都是是溶溶液液的的过过饱饱和和度（溶液中溶质的浓度超过其饱和溶解度之值）度（溶液中溶质的浓度超过其饱和溶解度之值）按按产产生生过过饱饱和和度度的的手手段段分分以以下下三三种种：冷冷却却结结晶晶。将将溶溶液液冷冷却却，使使之之成成为为过过饱饱和和。此此法法对对于于溶溶解解度度随随温温度度降降低低而而显显著著减减小小的的物物系系尤尤为为适适用用。蒸蒸发发结结晶晶。除除去去部部分分溶溶剂剂使使溶溶液液成成为为过过饱饱和和。此此法法适适用用于于温温度度变变化化对对溶溶解解度度影影响响不不大大或或具具有有逆逆溶溶解解度度（溶溶解解度度随随温温度度下下降降而而增增大大）的的物物系系。真真空空结结晶晶。将将溶溶液液在在真真空空下下闪闪急急蒸蒸发发，溶溶液液在在浓浓缩缩和和冷冷却却双双重重作作用用下下达达到到过过饱饱和和，此此法法在在工工业业结结晶晶中中应应用用最最广广。此此外外，还还有有盐盐析析结结晶晶（向向溶溶液液中中加加入入溶溶解解度度大大的的盐盐类类，以以降低被结晶溶质的溶解度，使达到过饱和）等其他方法降低被结晶溶质的溶解度，使达到过饱和）等其他方法尽管该方法有以上一些优点，但也存在以下一些不足之处：尽管该方法有以上一些优点，但也存在以下一些不足之处：微生物粗提酶液不适合用该法进行处理。因为粗提酶液中的其他杂微生物粗提酶液不适合用该法进行处理。因为粗提酶液中的其他杂蛋白会蛋白会 沉集在分离胶表面，影响电泳的效果。因此，在用该方法来纯沉集在分离胶表面，影响电泳的效果。因此，在用该方法来纯化目的酶之前，粗酶液应首先用凝胶过滤法或离子交换法进行纯化化目的酶之前，粗酶液应首先用凝胶过滤法或离子交换法进行纯化预处理。预处理。由于在电泳过程中温度往往会超过由于在电泳过程中温度往往会超过25，而且分离胶的，而且分离胶的pH也很高，也很高，通常达到通常达到8.9或或9.0,故一些对温度或故一些对温度或PH敏感的微生物酶就不适合用敏感的微生物酶就不适合用该方法来进行处理。该方法来进行处理。一种新型的微生物酶纯化手段一种新型的微生物酶纯化手段制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳 与常规的柱层析如凝胶过滤或离子交换层析相比，与常规的柱层析如凝胶过滤或离子交换层析相比，PAGE具有更具有更高的分辨效果。另外，它还适用于分离及纯化其他可活性染色的脱高的分辨效果。另外，它还适用于分离及纯化其他可活性染色的脱氢酶、氢酶、.还原酶、氧化酶、异构酶、转移酶、水解酶等。还原酶、氧化酶、异构酶、转移酶、水解酶等。(九九)菌种保藏菌种保藏 对于无论用什么方法所获得的酶高产菌株，都必须对其进行有效的对于无论用什么方法所获得的酶高产菌株，都必须对其进行有效的菌种保藏。这是因为在人工培养条件下，任何微生物菌株通过一系菌种保藏。这是因为在人工培养条件下，任何微生物菌株通过一系列的传代接种后，都可能发生菌种的退化，使得菌种的一个或多个列的传代接种后，都可能发生菌种的退化，使得菌种的一个或多个特性逐步消失，最终导致营养细胞的死亡。常见的菌种保藏有以下特性逐步消失，最终导致营养细胞的死亡。常见的菌种保藏有以下一些方法：一些方法：1.斜面菌种斜面菌种4低温保藏低温保藏 该方法只能作为菌种的短期保藏。一般有泡该方法只能作为菌种的短期保藏。一般有泡子的霉菌或放线菌及有芽抱的细菌可以保存子的霉菌或放线菌及有芽抱的细菌可以保存4-9个月，酵母菌大约个月，酵母菌大约4个月，细菌个月，细菌2个月左右。个月左右。2.液体石蜡油保藏液体石蜡油保藏 此法是采用灭菌的液体石蜡油覆盖在菌种斜面上此法是采用灭菌的液体石蜡油覆盖在菌种斜面上(高出斜面高出斜面1.5 cm以达到隔绝空气进行保护的目的。用此法保藏时以达到隔绝空气进行保护的目的。用此法保藏时间在间在1年以上。霉菌、酵母菌、细菌及放线菌均可采用液体石蜡保年以上。霉菌、酵母菌、细菌及放线菌均可采用液体石蜡保藏法。藏法。1.沙土管保藏法沙土管保藏法 其基本过程就是将沙子其基本过程就是将沙子(60%的沙的沙+40%的土的土)过过60目目筛，用筛，用10%的盐酸浸泡的盐酸浸泡2h，水洗至中性晒干，转入小安培瓶或小试，水洗至中性晒干，转入小安培瓶或小试管内灭菌。然后将培养好的保存对象移人沙土管内，干燥处理后，管内灭菌。然后将培养好的保存对象移人沙土管内，干燥处理后，低温保藏即可。此法适用于保藏放线菌、芽孢杆菌和霉菌。保存时低温保藏即可。此法适用于保藏放线菌、芽孢杆菌和霉菌。保存时间间1年至数年。为保证保藏质量，最好能年至数年。为保证保藏质量，最好能1年转代年转代1次。次。2.冷冻保藏法冷冻保藏法此法是在低温下将细胞置于脱脂牛奶中，并快速冷冻使此法是在低温下将细胞置于脱脂牛奶中，并快速冷冻使细胞保持完整。然后用真空干燥法使微生物的生长和一切酶的作用细胞保持完整。然后用真空干燥法使微生物的生长和一切酶的作用都暂时停止。用该法来保藏微生物菌株，保藏期可达都暂时停止。用该法来保藏微生物菌株，保藏期可达5-10年。年。三、实验室操作与工业化生产之间的差别三、实验室操作与工业化生产之间的差别 实验室小规模操作与工业化大规模生产微生物酶的一般实验室小规模操作与工业化大规模生产微生物酶的一般原理是相同的，但两者在可能遇到的问题及操作要求和方法原理是相同的，但两者在可能遇到的问题及操作要求和方法上，通常有很大差异：上，通常有很大差异：(1)、用摇瓶来培养微生物时，在培养过程中很容易保持无杂、用摇瓶来培养微生物时，在培养过程中很容易保持无杂菌菌污染污染状态，而在工业发酵过程中，防止污染却是一项经常状态，而在工业发酵过程中，防止污染却是一项经常性任务，因为污染源往往是多方面的，如搅拌器轴封漏气、性任务，因为污染源往往是多方面的，如搅拌器轴封漏气、冷却盘管漏水或阀门及空气无菌过滤器出现无菌状态不严格冷却盘管漏水或阀门及空气无菌过滤器出现无菌状态不严格等，都会导致在发酵过程中的杂菌污染。等，都会导致在发酵过程中的杂菌污染。(2)、与工业化生产不同，实验室水平上的微生物发酵往、与工业化生产不同，实验室水平上的微生物发酵往往需要更长的时间。一般说来，根据菌种和所需目的酶的往需要更长的时间。一般说来，根据菌种和所需目的酶的不同，实验室规模的发酵时间通常为不同，实验室规模的发酵时间通常为2-14天天，而工业化生，而工业化生产则只需产则只需12h至至6天天。另外，在实验室进行操作时，由子。另外，在实验室进行操作时，由子培养液的体积小，一旦方法确定，几小时内就可将酶提取培养液的体积小，一旦方法确定，几小时内就可将酶提取出来，但对大型发酵而言，遇到最大难题，往往不会出现出来，但对大型发酵而言，遇到最大难题，往往不会出现在发酵阶段，而是在随后的酶提取时期，即发酵液的后处在发酵阶段，而是在随后的酶提取时期，即发酵液的后处理阶段。理阶段。(3)、实验室条件下的摇瓶试验甚至是微型发酵罐的发酵经验，、实验室条件下的摇瓶试验甚至是微型发酵罐的发酵经验，对于大型的工业化发酵生产来说所能提供的参考价值也是很对于大型的工业化发酵生产来说所能提供的参考价值也是很有限的，因此，在任何一家工厂的规模发酵过程中有限的，因此，在任何一家工厂的规模发酵过程中(包括生产包括生产目的酶的中型试验目的酶的中型试验)，为了获得最佳目的酶产量，一些重要的，为了获得最佳目的酶产量，一些重要的发酵参数，如搅拌转速、通气量、功率输人等都必须依靠操发酵参数，如搅拌转速、通气量、功率输人等都必须依靠操作入员的经验来确定。作入员的经验来确定。第三节第三节 微生物酶的应用微生物酶的应用 用微生物生产的商业化酶已有百余种。但产量大、应用广、经济效用微生物生产的商业化酶已有百余种。但产量大、应用广、经济效益高的酶品种主要是各种分解酶。另外，基因工程工具酶日新月异的进益高的酶品种主要是各种分解酶。另外，基因工程工具酶日新月异的进步也从根本上改变了人们的生活。步也从根本上改变了人们的生活。一、蛋白酶一、蛋白酶 从经济学的角度看，蛋白酶要算是最重要的一类工业酶了。在当代，从经济学的角度看，蛋白酶要算是最重要的一类工业酶了。在当代，商业化蛋白酶的应用主要集中在去污剂工业。在该领域，碱性丝氨酸蛋商业化蛋白酶的应用主要集中在去污剂工业。在该领域，碱性丝氨酸蛋白酶被广泛使用。此外，毛霉蛋白酶在乳酪制造业中所起的作用也不容白酶被广泛使用。此外，毛霉蛋白酶在乳酪制造业中所起的作用也不容忽视。从市场占有率看，蛋白酶约占整个商品酶销售量的忽视。从市场占有率看，蛋白酶约占整个商品酶销售量的40%。二、芳基乙醚酶二、芳基乙醚酶 木质素是纤维素发酵后的主要副产品。全世界陆生生物量木质素是纤维素发酵后的主要副产品。全世界陆生生物量中木质纤维占了中木质纤维占了95%，其中木质素又占，其中木质素又占1/4左右。科学家们通左右。科学家们通过遗传工程方法将欧文氏菌编码的芳基乙醚酶基因克隆到大过遗传工程方法将欧文氏菌编码的芳基乙醚酶基因克隆到大肠杆菌内，后者即可大量分泌能降解木质素的芳基乙醚酶。肠杆菌内，后者即可大量分泌能降解木质素的芳基乙醚酶。木质素经过该酶降解后能转换出有用的高档药品、染料、能木质素经过该酶降解后能转换出有用的高档药品、染料、能源及生物降解塑料聚羟丁酯的原料。这样既可消除污染，又源及生物降解塑料聚羟丁酯的原料。这样既可消除污染，又创造了财富，可谓一举两得。创造了财富，可谓一举两得。三、脂肪酶三、脂肪酶 自然界中有许多微生物可以通过它们分泌的脂肪酶来利用自然界中有许多微生物可以通过它们分泌的脂肪酶来利用油脂作为生长所需的碳源物质油脂作为生长所需的碳源物质:由于微生物脂肪酶的种类很多，由于微生物脂肪酶的种类很多，具有比动植物酶更广的具有比动植物酶更广的pH适应性、温度范围及对底物的专一适应性、温度范围及对底物的专一性，又便于生产，更容易获得高纯度制剂，因此其在研究和性，又便于生产，更容易获得高纯度制剂，因此其在研究和应用上的进展相当迅速。微生物脂肪酶已有多种商品化制剂应用上的进展相当迅速。微生物脂肪酶已有多种商品化制剂供应市场，用途也相当广泛，特别是其可以起到药物作用，供应市场，用途也相当广泛，特别是其可以起到药物作用，帮助进行消化，降低血脂及治疗局部炎症等帮助进行消化，降低血脂及治