实验五禽流感血清学诊断.ppt

实验五实验五禽流感的血清学诊断禽流感的血清学诊断（血凝与血凝抑制试验）（血凝与血凝抑制试验）实验课内容1234567禽流感概述病原分离实验原理器材与试剂病原分离接种鸡胚HA-HI禽流感病毒（AIV）感染禽后可引起各种综合征，从无临诊症状感染到呼吸道疾病和产蛋下降，到死亡率接近100%的严重全身性疾病。迄今为止，高致病性AIV都是H5和H7血清亚型，而所有其它亚型毒株对禽类均为低致病性（MP）。病禽和带毒禽是主要传染源。鸭、鹅等和野生水禽在本病传播中起重要作用，候鸟也可能起一定作用。感染途径为呼吸道和消化道。本病虽无明显季节性，但常常以冬春季多发。流行病学低致病性禽流感（MPAI）MPAI病毒在野禽中大多数不产生临诊症状。鸡和火鸡的表现为呼吸、消化、泌尿和繁殖器官的异常。高致病性禽流感（HPAI）急性败血性，呼吸困难、腹泻、高热、神经症状。发病率和死亡率很高（5090%），有的鸡群可达100%。临床症状因宿主种类和免疫状态、病毒致病性等不同而有很大差异。MPAI 病理变化主要在呼吸道，尤其是窦的损害，以卡他、纤维性、脓性或纤维脓性炎症为特征。HPAI 在内脏器官和皮肤有各种水肿、出血和坏死，最急性型可能无大体病理变化。病理变化有些病毒具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，利用这种特性设计的试验称血球凝集(HA)试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(HI)试验，具有特异性。通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。实验原理掌握掌握HAHA和和HIHI试验的基本操作技术，了解其实用价值。试验的基本操作技术，了解其实用价值。目的与要求1.96孔“V”形微量反应板,100 uL加样器，枪头。2.生理盐水，0.5%鸡红细胞悬液，禽流感病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），禽流感阳性血清，被检鸡血清。器材与试剂在感染初期或发病急性期从死禽或活禽采取。死禽采集气管、肺、肝、肾、脾、泄殖腔等组织样品。组织样品先用肉汤培养基或PBS制成1020（W/V）的悬液，1000 r离心10 min，取上清液作为试验样品。为防止细菌污染，应加入以下抗生素：青霉素2 000 g，链霉素2000g，卡那霉素1000 g（每毫升培养液中所含）。样品离心后也可用细菌过滤器过滤除菌。病毒分离病毒分离活禽用大小不等的灭菌棉拭子涂擦喉头、气管或泄殖腔，然后将带有分泌物的棉拭子放入每毫升含有1000 g青霉、2000 g链霉素pH7.27.6的肉汤中，无肉汤时可用Hanks液或25%50%的甘油盐水。小珍禽用拭子取样易造成损伤可取而代之以采集新鲜粪便。将棉拭子充分捻动、拧干后除去拭子，样品液经1000 r离心10 min，取上清液作为接种材料。常用910日龄的鸡胚，每份病料至少注入5个鸡胚，接种于绒毛尿囊膜或尿囊内，操作方法如下。1照蛋，划出气室位置，在鸡胚胎面观看胚胎活动，选择无大血管处标一记号。2在气室顶部和标记处用碘酊和酒精消毒，并各钻一小孔。3用较干的碘酊棉球涂布小孔。接种鸡胚4用1毫升注射器吸取上述处理过的材料，插入小孔内约3mm，缓缓注入0.10.2毫升，拔出针头。5用融化石腊封口，在蛋壳上标明日期。6置37温箱培养，每天照蛋二次，至全部或大部分鸡胚发生死亡为止（24小时内死亡的胚弃之）。7将死胚收藏于4冰箱内，气室向上，624小时获尿囊液。接种鸡胚1.在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50 L生理盐水。2.于左侧第1孔加50 L病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），混合均匀后，吸50 L至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃50 L；第12孔为红细胞对照。3.自右至左依次向各孔加入0.5%鸡红细胞悬液50 L，在振荡器上振荡，室温下静置后观察结果。血凝（HA）试验9696孔板孔号孔板孔号 1 12 23 34 5 6 7 8 94 5 6 7 8 9101011 11 对照对照 生生 理盐水理盐水 5050 50 50 50 50.50 50 50 50 50 50病病 毒毒 5050 50 50 50 50.50 50 50 50 红细胞红细胞 5050 50 50 50 50.50 50 50 50 50 50病毒稀释倍病毒稀释倍数数 1 1：2 2 1 1：4 4 1 1：8 8.1:1024 1:1024 1:20481:2048结果判定结果判定#+弃去50L以以100%100%凝集病毒最大稀释孔为该病毒的凝集价凝集病毒最大稀释孔为该病毒的凝集价血凝（HA）试验4.结果判定：结果判定：从静置后10 min开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100%凝集（#），不凝集者（-）红细胞沉于孔底呈点状。以100%凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。例如表中，该禽流感病毒液的血凝价为1:128，则l:128为1个血凝单位，1:64、l:32分别为2、4个血凝单位，或将128/4=32，即1:32稀释的病毒液为4个血凝单位。血凝（HA）试验1.根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝单位的病毒液。2.在96孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，自第1孔至第11孔各加50 uL生理盐水。3.第1孔加被检鸡血清50 uL，吹吸混合均匀，吸50 uL至第2孔，依此倍比稀释至第10孔，吸弃50 uL，稀释度分别为：1:2、1:4、1:8 ；第12孔加禽流感阳性血清50 uL，作为血清对照。血凝抑制（HI）试验4.自第1孔至12孔各加50 uL 4个血凝单位的禽流感病毒液，其中第11孔为4单位禽流感病毒液对照，振荡混合均匀，置室温中作用10min。5.自第l孔至12孔各加0.5%鸡红细胞悬液50 uL，振荡混合均匀，室温下静置后观察结果。血凝抑制（HI）试验血凝抑制（HI）试验孔号孔号 1 1234 5 6 7 8 910病毒对照 血清对照 血清稀释倍数血清稀释倍数 1 1：2 21：4 1：8.1：1024生理盐水生理盐水 50505050.50 5050血清血清 50505050.50504 4单位病毒单位病毒 50505050.50150 振荡1分钟，室温10分钟 弃 50L红细胞悬液红细胞悬液 50 50 505050.5050 振荡1分钟，室温10分钟结果判定结果判定#以100%抑制凝集的血清最大稀释度为该血清的滴度，即血清效价 6.结果判定：待病毒对照孔（第11孔）出现红细胞100%凝集（#），而 血清对照孔（第12孔）为完全不凝集（-）时，即可进行结果观察。以100%抑制凝集（完全不凝集）的被检血清最大稀释度为该血清的血凝抑制效价，即HI效价。凡被已知禽流感阳性血清抑制血凝者，该病毒为禽流感病毒。例如表中血清的HI效价为1:64，用以2为底的负对数(-log2)表示，即6log2。判定标准：HI效价小于或等于3lg2判定HI试验阴性；HI效价等于4lg2为可疑，需重复试验；HI效价大于或等于5lg2为阳性血凝抑制（HI）试验禽流感灭活疫苗免疫效果判断：HI抗体效价 4log2(1:16)为免疫合格。禽流感弱毒疫苗免疫效果判断：鸡群免疫抗体转阳率50%判定合格。正常合格为从高浓度到低浓度（从前到后）红细胞沉积依次减少，如1-4孔出现不完全沉积，即凝集现象，即无抗体或抗体水平较低，不合格；反之，5-10孔出现沉淀，则抗体水平较高，合格。农业部农业部20072007年发文年发文1HA和HI试验的基本原理是什么？2如何判定HA和HI试验的结果？3临床上HI和HA试验各自的作用是什么？思考题：THE END