免疫技术检测食品微生物专家讲座.pptx

第一节第一节免疫荧光抗体技术检测食品微生物免疫荧光抗体技术检测食品微生物经典免疫分析技术经典免疫分析技术凝集反应、沉淀反应、溶血反应、补体结合试验凝集反应、沉淀反应、溶血反应、补体结合试验特点：特点：成本低、技术简单、结果易于判断，但不易于实成本低、技术简单、结果易于判断，但不易于实现自动化。现自动化。当代免疫分析技术当代免疫分析技术荧光免疫标识、放射性免疫标识、酶免疫标识、镧系荧光免疫标识、放射性免疫标识、酶免疫标识、镧系（稀土）元素免疫标识、临床化学免疫分析技术、发光免（稀土）元素免疫标识、临床化学免疫分析技术、发光免疫标识、流式免疫微球技术及生物传感器技术等。疫标识、流式免疫微球技术及生物传感器技术等。特点：特点：灵敏、特异、快速、易于测定及实现自动化。灵敏、特异、快速、易于测定及实现自动化。免疫技术检测食品微生物第2页第一节第一节免疫荧光抗体技术检测食品微生物免疫荧光抗体技术检测食品微生物一、免疫荧光抗体技术定义及其发展一、免疫荧光抗体技术定义及其发展免疫荧光抗体技术免疫荧光抗体技术（Fluorescent-labelledantibodytechnic）是指用荧光素反抗体或抗原进行标识，然）是指用荧光素反抗体或抗原进行标识，然后用荧光显微镜观察所标识荧光以分析示踪对应抗后用荧光显微镜观察所标识荧光以分析示踪对应抗原或抗体方法。原或抗体方法。免疫荧光技术（免疫荧光技术（Immunofluorescencetechnique）包）包含荧光抗体技术和荧光抗原技术。含荧光抗体技术和荧光抗原技术。主要特点主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点主要缺点是：非特异性染色问题还未完全处理，结果判定客是：非特异性染色问题还未完全处理，结果判定客观性不足，技术程序也还比较复杂观性不足，技术程序也还比较复杂免疫技术检测食品微生物第3页发展：发展：1930年年Reiner1933年年Heidelberger1934年年Marrack普通染料，标识，普通染料，标识，效果不理想效果不理想破坏破坏Ab活性活性1941年年Coons合成荧光化合物，合成荧光化合物，异氰蒽异氰蒽既可标既可标记记Ab，又不破坏其活性，又不破坏其活性1950年年Coons合成合成异氰酸荧光素异氰酸荧光素（FIC）1958年年Coons合成合成异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素（FITC）1958年年Coons合成合成罗丹明罗丹明B-200（RB200）70年代：年代：发展为定量技术：荧光免疫测定（发展为定量技术：荧光免疫测定（FIA）近年来：流式细胞仪：活细胞分类检测。近年来：流式细胞仪：活细胞分类检测。1958年年Riggs等合成性能较为优良异硫氰酸荧光黄，等合成性能较为优良异硫氰酸荧光黄，Mashall等对荧光抗体标识方法又进行改进等对荧光抗体标识方法又进行改进开创了免疫开创了免疫荧光技术荧光技术使免疫荧光使免疫荧光技术逐步推技术逐步推广应用广应用免疫技术检测食品微生物第4页第一节第一节免疫荧光抗体技术检测食品微生物免疫荧光抗体技术检测食品微生物二、基本原理二、基本原理抗体与荧光素结合后，并不影响其和对应抗原抗体与荧光素结合后，并不影响其和对应抗原发生特异性结合反应，事先将待测抗原固定于载玻发生特异性结合反应，事先将待测抗原固定于载玻片上，滴加荧光标识抗体，若荧光标识抗体与对应片上，滴加荧光标识抗体，若荧光标识抗体与对应抗原发生特异性结合反应，不能被缓冲液冲掉，在抗原发生特异性结合反应，不能被缓冲液冲掉，在荧光显微镜下可观察到荧光，不然荧光抗体被缓冲荧光显微镜下可观察到荧光，不然荧光抗体被缓冲液冲掉，在荧光显微镜下观察不到荧光。液冲掉，在荧光显微镜下观察不到荧光。免疫技术检测食品微生物第5页第一节第一节免疫荧光抗体技术检测食品微生物免疫荧光抗体技术检测食品微生物三、荧光抗体制备三、荧光抗体制备（一）荧光色素（一）荧光色素化学物质化学物质释放能量：发光释放能量：发光吸收能量吸收能量激发态激发态基态基态荧光特点：荧光特点：1)可产生荧光分子或原子在接收能量后即刻引发发光可产生荧光分子或原子在接收能量后即刻引发发光(余辉：余辉：10-810-9S)2)一量停顿供能，荧光随之瞬间消失一量停顿供能，荧光随之瞬间消失种类：种类：1.光致荧光光致荧光2.化学荧光化学荧光3.X线荧光线荧光荧光效率荧光效率1、荧光现象、荧光现象免疫技术检测食品微生物第6页2、荧光色素、荧光色素能产生显著荧光并能作染料使用有机化合物称为荧能产生显著荧光并能作染料使用有机化合物称为荧光色素光色素异硫氰酸荧光素：异硫氰酸荧光素：(fluoresceinisothiocyanate,FITC)四乙基罗丹明四乙基罗丹明(Rhodamine,RB200)四甲基异硫氰酸罗丹明四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethylrhodamineisothiocyanate,TRITC)3.荧光色素要求荧光色素要求（1）应含有能与蛋白质分子形成共价键化学基因）应含有能与蛋白质分子形成共价键化学基因（2）荧光效率高荧光效率高（3）荧光色泽与背景组织色泽对比鲜明）荧光色泽与背景组织色泽对比鲜明（4）与蛋白质结合后不影响蛋白质原有生化与免疫性质）与蛋白质结合后不影响蛋白质原有生化与免疫性质（5）标识方法简单，安全无毒）标识方法简单，安全无毒（6）与蛋白质结合物稳定，易于保留）与蛋白质结合物稳定，易于保留免疫技术检测食品微生物第7页四甲基异硫氰酸罗丹明四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素(FITC)四乙基罗丹明四乙基罗丹明(RB200)最大吸收最大吸收光波长光波长490495570550最大发射最大发射光波长光波长520530595600620荧光颜色荧光颜色橘红色橘红色黄绿色黄绿色橙红色橙红色免疫技术检测食品微生物第8页荧光抗体制备程序：荧光抗体制备程序：制备免疫血清或制备免疫血清或McAb抗体纯化抗体纯化抗体标识：抗体标识：搅拌法、透析法搅拌法、透析法方法方法标识物提纯：标识物提纯：去除游离荧光素去除游离荧光素去除过分标识或未结合抗体去除过分标识或未结合抗体标识物判定：标识物判定：含量、特异性、效价、含量、特异性、效价、F/P判定判定实际应用实际应用4.荧光抗体制备荧光抗体制备免疫技术检测食品微生物第9页搅拌法搅拌法抗体溶液抗体溶液逐滴加入逐滴加入FITC溶液溶液搅拌搅拌46h离心离心搅拌法：搅拌法：适于体积较大，蛋白含量较高抗体溶液适于体积较大，蛋白含量较高抗体溶液优点：标识时间短，荧光素用量少优点：标识时间短，荧光素用量少缺点：影响原因多缺点：影响原因多易引发较强非特异性荧光染色易引发较强非特异性荧光染色免疫技术检测食品微生物第10页透析法透析法TITC抗体溶液抗体溶液FITC标识标识抗体溶液抗体溶液反应过夜反应过夜PBS搅拌法：搅拌法：适于标识抗体量少，蛋白含量低抗体溶液适于标识抗体量少，蛋白含量低抗体溶液优点：标识比较均匀，非特异性荧光少优点：标识比较均匀，非特异性荧光少缺点：所需荧光素量多，时间较长缺点：所需荧光素量多，时间较长免疫技术检测食品微生物第11页第一节第一节免疫荧光抗体技术检测食品微生物免疫荧光抗体技术检测食品微生物四、基本步骤四、基本步骤1.制片制片可制作涂片、印片、细胞单层培养物、组织切片，可制作涂片、印片、细胞单层培养物、组织切片，经适当固定或不固定经适当固定或不固定（微生物：涂片（微生物：涂片干燥干燥固定固定冲洗）冲洗）2.洗片洗片用用PBS（pH值值7.4）充分水洗标本）充分水洗标本3.染色染色切片经固定后，滴加对应荧光抗体，在室温或切片经固定后，滴加对应荧光抗体，在室温或37染色染色30min，切片置入能保持潮湿染色盒内，预防干燥。，切片置入能保持潮湿染色盒内，预防干燥。4.洗片洗片倾去存留荧光抗体，将切片浸入倾去存留荧光抗体，将切片浸入pH7.4或或ph7.2PBS中洗两次，搅拌，每次中洗两次，搅拌，每次5min，再用蒸馏水洗，再用蒸馏水洗1min，除去，除去盐结晶。盐结晶。5.封片封片用用50%缓冲（缓冲（0.5mol/l碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液ph9.09.5）甘油封固、镜检甘油封固、镜检6对照染色对照染色7.荧光显微镜观察荧光显微镜观察待检抗原待检抗原荧光标识抗体荧光标识抗体免疫技术检测食品微生物第12页第一节第一节免疫荧光抗体技术检测食品微生物免疫荧光抗体技术检测食品微生物五、免疫荧光抗体技术类型免疫荧光抗体技术类型（1）直接法）直接法优点：方法简便优点：方法简便特异性高特异性高非特异性荧光染色少非特异性荧光染色少缺点：敏感度偏低缺点：敏感度偏低检测每一个抗原需制备对应荧光抗体检测每一个抗原需制备对应荧光抗体应用：病原微生物快速检测应用：病原微生物快速检测；活检标本免疫病理检验；活检标本免疫病理检验免疫技术检测食品微生物第13页第一节第一节免疫荧光抗体技术检测食品微生物免疫荧光抗体技术检测食品微生物（2）间接法）间接法优点：敏感度高于直接法优点：敏感度高于直接法制备一个荧光抗体可用来检测各种抗原制备一个荧光抗体可用来检测各种抗原既可用于检测抗原，也可检测抗体既可用于检测抗原，也可检测抗体缺点：易出现非特异性荧光；方法较麻烦；缺点：易出现非特异性荧光；方法较麻烦；操作时间较长操作时间较长应用：本身抗体检测应用：本身抗体检测免疫技术检测食品微生物第14页第一节第一节免疫荧光抗体技术检测食品微生物免疫荧光抗体技术检测食品微生物（3）补体结正当：）补体结正当：优点：含有间接法全部优点优点：含有间接法全部优点缺点：非特异性荧光很多缺点：非特异性荧光很多;每次检测都需每次检测都需要新鲜补体要新鲜补体;操作复杂操作复杂应用：适合用于任何动物抗原抗体系统应用：适合用于任何动物抗原抗体系统免疫技术检测食品微生物第15页（4）双重染色法）双重染色法在同一标本上有两个抗原需要同时在同一标本上有两个抗原需要同时显示（如显示（如A抗原和抗原和B抗原），抗原），A抗原抗体抗原抗体用用FITC标识，标识，B抗原抗体用罗达明标识，抗原抗体用罗达明标识，可采取两种方法。可采取两种方法。一步法双染色：先将两种标识抗体按一步法双染色：先将两种标识抗体按适当百分比混合（适当百分比混合（A+B），按直接法进），按直接法进行染色：行染色：二步法双染色：先用二步法双染色：先用RB200标识标识B抗体抗体染色，无须洗去，再用染色，无须洗去，再用FITC标识标识A抗体抗体染色，按间接法进行。染色，按间接法进行。结果：结果：A抗原阳抗原阳性荧光展现绿色，性荧光展现绿色，B抗原阳性展现桔红色抗原阳性展现桔红色荧光。荧光。第一节第一节免疫荧光抗体技术检测食品微生物免疫荧光抗体技术检测食品微生物FITCRB200免疫技术检测食品微生物第16页第二节第二节 酶免疫技术检测微生物酶免疫技术检测微生物一、酶免疫技术定义及其发展一、酶免疫技术定义及其发展（一）定义（一）定义酶免疫技术酶免疫技术:用酶标识抗原或抗体作为诊疗试剂检测用酶标识抗原或抗体作为诊疗试剂检测标本中对应抗体或抗原。标本中对应抗体或抗原。特点：特点：灵敏度高，可与放射免疫相比，检测能力可达灵敏度高，可与放射免疫相比，检测能力可达ng水平。水平。应应用用范范围围广广，既既能能检检测测抗抗体体又又能能检检测测抗抗原原，既既能能定性又能定量、定位及抗原分析定性又能定量、定位及抗原分析免疫技术检测食品微生物第17页（二）发展19711971年瑞典学者年瑞典学者EngvailEngvail和和Perlmann,Perlmann,荷兰学者荷兰学者Van Van WeermanWeerman和和SchuursSchuurs分别报道将免疫技术发展为检分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质固相免疫测定方法，即酶联免测体液中微量物质固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent (enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)assay,ELISA)。ELISAELISA现在已成为当前分析化现在已成为当前分析化学领域中前沿课题学领域中前沿课题 ，它是一个特殊试剂分析方法，它是一个特殊试剂分析方法，是在免疫酶技术是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques(immunoenzymatic techniques)基础上发展起来一个新型免疫测定技术基础上发展起来一个新型免疫测定技术 。免疫技术检测食品微生物第18页二、酶联免疫吸附测定原理二、酶联免疫吸附测定原理(enzyme-linkedimmunosorbentassay简称简称ELISA)抗体（抗原）与酶结合后，依然能和对应抗原（抗体）发抗体（抗原）与酶结合后，依然能和对应抗原（抗体）发生特异性结合反应，将待检样品事先吸附在固相载体表面称生特异性结合反应，将待检样品事先吸附在固相载体表面称为包被，加入酶标抗体（抗原），酶标抗体（抗原）与吸附为包被，加入酶标抗体（抗原），酶标抗体（抗原）与吸附在固相载体上对应抗原（抗体）发生特异性结合反应，形成在固相载体上对应抗原（抗体）发生特异性结合反应，形成酶标识免疫复合物，不能被缓冲液冲掉，当加入酶底物时，酶标识免疫复合物，不能被缓冲液冲掉，当加入酶底物时，底物发生化学反应，展现颜色改变，颜色深浅与待测抗原或底物发生化学反应，展现颜色改变，颜色深浅与待测抗原或抗体量相关，借助分光光度计光吸收计算抗原（抗体）量，抗体量相关，借助分光光度计光吸收计算抗原（抗体）量，也可用肉眼定性观察，所以可定量或定性测定抗原或抗体。也可用肉眼定性观察，所以可定量或定性测定抗原或抗体。免疫技术检测食品微生物第19页三、酶标识物制备三、酶标识物制备（一）惯用酶（一）惯用酶1.要求：要求：（1）催化活性高、催化专一性强；）催化活性高、催化专一性强；（2）与抗原抗体偶联后不影响抗原抗体免疫反应性和酶活）与抗原抗体偶联后不影响抗原抗体免疫反应性和酶活性；性；（3）催化底物易于配制、保留；）催化底物易于配制、保留；（4）催化底物产生信号产物易于观察和检测；）催化底物产生信号产物易于观察和检测；（5）对人无害且价廉、易得。）对人无害且价廉、易得。2.种类：种类：辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，等，其中以其中以HRP应用最广应用最广免疫技术检测食品微生物第20页免疫技免疫技术惯术惯用用酶酶及其底物及其底物酶酶底底物物显色反应显色反应测定波长测定波长/(nm)辣根过氧辣根过氧化物酶化物酶(HRP)邻苯二胺邻苯二胺(OPD)3，3，5，5四甲基联苯胺四甲基联苯胺(TMB)5-氨基水杨酸氨基水杨酸(5-AS)邻联苯甲胺邻联苯甲胺(OT)2,2-连胺基连胺基-2(3-乙基乙基-并噻并噻唑啉磺酸唑啉磺酸-6)铵盐铵盐(ABTS)橘红色橘红色黄色黄色棕色棕色兰色兰色蓝绿色蓝绿色492*,460*450449425642碱性磷酸碱性磷酸酯酶酯酶4-硝基酚磷酸盐硝基酚磷酸盐(PNP)萘酚萘酚-ASMx磷酸盐磷酸盐+重氮盐重氮盐黄色黄色红色红色400500葡萄糖氧葡萄糖氧化酶化酶ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪甲硫酚嗪+噻唑兰噻唑兰黄色黄色深蓝色深蓝色405,420-半半乳糖苷乳糖苷4-甲基伞酮基甲基伞酮基-半乳糖苷半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光荧光黄色黄色360,450420免疫技术检测食品微生物第21页（1）辣根过氧化物酶）辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)国产国产ELISA试剂普通都用试剂普通都用HRP制备结合物。制备结合物。HRP是一个糖蛋白，含糖量约为是一个糖蛋白，含糖量约为18%，分子量为，分子量为44000，是一，是一个复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合个复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成，是一个卟啉蛋白质。而成，是一个卟啉蛋白质。特点：价格低廉和性质较稳定特点：价格低廉和性质较稳定（2）碱性磷酸酶）碱性磷酸酶(alkalinephosohatase,AP)国外很多国外很多ELISA试剂采取碱性磷酸酶（试剂采取碱性磷酸酶（AP）作为标识酶。）作为标识酶。起源：从大肠杆菌和小牛肠膜中提取。起源：从大肠杆菌和小牛肠膜中提取。不一样起源酶生化特征特征略不相同，从大肠杆菌中提取不一样起源酶生化特征特征略不相同，从大肠杆菌中提取AP分子量为分子量为80000，酶作用最适合，酶作用最适合pH为为8.0；用小牛肠膜中；用小牛肠膜中提取提取AP分子量为分子量为100000，最适，最适pH为为9.6。特点：敏感度普通高于特点：敏感度普通高于HRP，空白值也较低，但，空白值也较低，但AP价格昂贵，价格昂贵，制备结合物所得率也较制备结合物所得率也较HRP低。低。免疫技术检测食品微生物第22页3.酶标识物制备方法酶标识物制备方法1）戊二醛交联法：）戊二醛交联法：戊二醛是一个双功效团试剂，它能够使酶与蛋白质氨基经过戊二醛是一个双功效团试剂，它能够使酶与蛋白质氨基经过它而联结。碱性磷酸普通用此法进行标识。它而联结。碱性磷酸普通用此法进行标识。优点：优点：操作简便、有效（结合率达操作简便、有效（结合率达60%-70%）和重复性好。）和重复性好。缺点：缺点：交联反应是随机，酶与抗体交联时分子间百分比不严交联反应是随机，酶与抗体交联时分子间百分比不严格，结合物大小也不均一，酶与酶，抗体与抗体之间也有格，结合物大小也不均一，酶与酶，抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。可能交联，影响效果。方法：方法：一步法一步法;两步法两步法;免疫技术检测食品微生物第23页（2）过碘酸盐氧化法：）过碘酸盐氧化法：本法只适合用于含糖量较高本法只适合用于含糖量较高酶。辣根过氧化物酶标识惯用酶。辣根过氧化物酶标识惯用此法。此法。反应时，过碘酸钠将反应时，过碘酸钠将HRP分子表面多糖氧化为醛基很活分子表面多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上氨基形成泼，可与蛋白质上氨基形成Schiff氏碱而结合。酶标识物按氏碱而结合。酶标识物按克分子百分比联结，其最正确克分子百分比联结，其最正确百分比为：酶百分比为：酶/抗体抗体=1-2/1。免疫技术检测食品微生物第24页（二）ELISA种类1.直接法（测定抗原）（1）将待测抗原吸附在固相载体表面，洗除未吸附抗原；（2）加入一定量酶标识抗体，形成抗原-抗体-酶复合物，洗除多出部分；（3）加入酶底物。底物降解量与抗原量呈正相关 免疫技术检测食品微生物第25页2.间接法（测定抗体）（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原；（2）加待测抗体，形成抗原-抗体复合物（3）加酶标二抗（抗抗体）；（4）加入酶底物。底物降解量与抗体量呈正相关 免疫技术检测食品微生物第26页3.双抗体夹心法（测抗原）（1）将特异性抗体与固相载体连接，（2）加待测抗原，形成抗原-抗体复合物（3）加酶标抗体，形成抗体-抗原-抗体复合物；（4）加入酶底物。底物降解量与抗原量呈正相关 免疫技术检测食品微生物第27页4.竞争法测定抗原（1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原混合溶液，使之与固相抗体反应。参考管中只加酶标抗原，洗涤。（3）加底物显色：样品孔底物降解量与待测抗原量呈负相关免疫技术检测食品微生物第28页 免疫技术检测食品微生物第29页（三）ELISA反应系统完整ELISA试剂盒包含以下各组分：（1）已包被抗原或抗体固相载体（免疫吸附剂）；（2）酶标识抗原或抗体（结合物）；（3）酶底物；（4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制血清（定量测定中）；（5）结合物及标本稀释液；（6）洗涤液；（7）酶反应终止液。免疫技术检测食品微生物第30页（四）ELISA测定方法 1.标本采取和保留标本采取和保留2.试剂准备试剂准备按试剂盒说明书要求准备试验中需用试剂。按试剂盒说明书要求准备试验中需用试剂。3.加样加样在在ELISA中普通有中普通有4-5次加样步骤次加样步骤要求：应将所加物加在要求：应将所加物加在LEISA板孔底部，防止加在孔壁上部，板孔底部，防止加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。并注意不可溅出，不可产生气泡。方法：加标本普通用微量加样器，按要求量加入板孔中。方法：加标本普通用微量加样器，按要求量加入板孔中。4.保温保温在在ELISA中普通有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合中普通有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。物后。抗原抗体反应完成需要有一定温度和时间，这一保温过程称抗原抗体反应完成需要有一定温度和时间，这一保温过程称为温育为温育(incubation)，免疫技术检测食品微生物第31页为何为何ELISAELISA反应总是需要一定时间温育。反应总是需要一定时间温育。ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体结合只在固相表面属固相免疫测定，抗原、抗体结合只在固相表面上发生。以抗体包被夹心法为例，加入板孔中标本，其中抗上发生。以抗体包被夹心法为例，加入板孔中标本，其中抗原并不是都有均等和固相抗结合机会，只有最贴近孔壁一层原并不是都有均等和固相抗结合机会，只有最贴近孔壁一层溶液中抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡过程，所以溶液中抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡过程，所以需经扩散才能到达反应终点。在其后加入酶标识抗体与固相需经扩散才能到达反应终点。在其后加入酶标识抗体与固相抗原结合也一样如此。抗原结合也一样如此。温育常采取温度有温育常采取温度有43、37、室温和、室温和4（冰箱温度）（冰箱温度）等。等。保温方式除有保温方式除有ELISA仪器附有特制电热块外，普通均采仪器附有特制电热块外，普通均采取水浴；若用保温箱，取水浴；若用保温箱，ELISA板应放在湿盒内，板应放在湿盒内，免疫技术检测食品微生物第32页5.显色显色洗涤决定着试验成败。洗涤决定着试验成败。目标：去除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合物质，目标：去除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体干扰物质。以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体干扰物质。6显色和比色显色和比色（1）显色显色OPD底物显色普通在室外或底物显色普通在室外或37反应反应20-30分钟分钟TMB经经HRP作用后，约作用后，约40分钟显色达顶峰分钟显色达顶峰（2）比色比色比色结果表示以往通用光密度（比色结果表示以往通用光密度（oplicaldensity，OD），），现按要求用吸光度（现按要求用吸光度（absorbence，A）（3）酶标比色仪酶标比色仪免疫技术检测食品微生物第33页第三节第三节放射免疫分析测定技术检测食品微生物放射免疫分析测定技术检测食品微生物一、放射免疫分析技术定义及其发展一、放射免疫分析技术定义及其发展（一）定义（一）定义放射免疫分析技术（放射免疫分析技术（Radioimmunoassay，RIA）凡是利用放射性同位素标识抗原或抗体，经过免疫凡是利用放射性同位素标识抗原或抗体，经过免疫反应测定技术，都可称为放射免疫技术反应测定技术，都可称为放射免疫技术（二）发展（二）发展美国免疫学家美国免疫学家Pressmen和和Eisen于于1950年首先使用放射年首先使用放射性碘标识抗原来研究抗原性碘标识抗原来研究抗原-抗体免疫反应。抗体免疫反应。美国科学家美国科学家Berson和女科学家和女科学家R.Yalow（美（美,1921）1950末创建了放射免疫测定法末创建了放射免疫测定法（胰岛素），（胰岛素），1977年获诺贝尔医学奖年获诺贝尔医学奖免疫技术检测食品微生物第34页（三）特点（三）特点优点：操作简便、快速、灵敏度高、准确可靠，重优点：操作简便、快速、灵敏度高、准确可靠，重复性好，应用范围广泛，可用自动化仪器或计算复性好，应用范围广泛，可用自动化仪器或计算机处理。机处理。缺点：含有一定危害性并造成环境污染；所需设备缺点：含有一定危害性并造成环境污染；所需设备和仪器比较复杂；反抗原抗体纯度要求也十分严和仪器比较复杂；反抗原抗体纯度要求也十分严格。格。检测方法检测方法检测范围检测范围生化、常规免疫生化、常规免疫mgg（10-310-6g）荧光免疫、酶免疫荧光免疫、酶免疫gng（10-610-9g）放射免疫放射免疫、发光免疫、发光免疫ngpg（10-910-12g）PCRpgfg（10-1210-15g）免疫技术检测食品微生物第35页二、基本原理二、基本原理RIA是标识抗原和未标识抗原对有限量抗体是标识抗原和未标识抗原对有限量抗体竞争性结竞争性结合或竞争性抑制反应。合或竞争性抑制反应。在在RIA反应系统中，标识抗原反应系统中，标识抗原(Ag*)、末标识抗原、末标识抗原(Ag)和特异性抗体和特异性抗体(Ab)三者同时存在时，因为两种抗原含有三者同时存在时，因为两种抗原含有相同决定簇，相互竞争结合抗体能力相同，结果形成相同决定簇，相互竞争结合抗体能力相同，结果形成Ag*-Ab和和Ag-Ab复合物。当复合物。当Ag*和和Ab量固定时，二者结量固定时，二者结合形成免疫复合物就受到合形成免疫复合物就受到Ag含量制约。如反应系统中含量制约。如反应系统中Ag含量高时，对含量高时，对Ab竞争结合能力就强，竞争结合能力就强，Ag-Ab复合物形成复合物形成量就增加，量就增加，Ag*-Ab复合物则相对降低；反之，当复合物则相对降低；反之，当Ag含量含量低时，对低时，对Ab竞争结合能力弱，竞争结合能力弱，Ag*-Ab复合物形成量即增复合物形成量即增多。所以，多。所以，Ag*-Ab复合物形成量与复合物形成量与Ag含量之间呈一定负含量之间呈一定负相关函数共系。相关函数共系。免疫技术检测食品微生物第36页一、放射免疫分析基本原理一、放射免疫分析基本原理竞争性结合反应经竞争性结合反应经典标识抗原（典标识抗原（Ag*Ag*）和）和非标识抗原（非标识抗原（AgAg）与限）与限量抗体量抗体(Ab)(Ab)竞争性结合竞争性结合Ag*Ag*和和AgAg含有等同含有等同与与AbAb结合能力结合能力免疫技术检测食品微生物第37页AbAb限量，限量，Ag*Ag*定量定量,Ag*Ag*和和AgAg量大于量大于AbAb结合位点，二者结合位点，二者经过竞争方式与经过竞争方式与AbAb结合；伴随结合；伴随AgAg增加，增加，Ag*Ag*与与AbAb结合形成结合形成Ag*AbAg*Ab复合物放复合物放射量降低射量降低,二者改变二者改变成函数关系。成函数关系。免疫技术检测食品微生物第38页以未结合以未结合Ag*Ag*为为F F，Ag*AbAg*Ab复合物复合物为为B B，则，则B/FB/F或或B/(BB/(BF)F)与与AgAg量变存在着函数量变存在着函数关系剂量反应关系剂量反应曲线曲线 注：注：T即是即是B与与F总和总和标准曲线（标准曲线（StandardCurve）：又称剂量反应曲线，是将一系列）：又称剂量反应曲线，是将一系列不一样量已知标准品与恒量标识抗原、抗体进行反应后分离不一样量已知标准品与恒量标识抗原、抗体进行反应后分离B与与F，以参数，以参数B/F或或B%或或BB0%等为纵坐标，以标准品浓度为横等为纵坐标，以标准品浓度为横坐标绘制成一条竞争抑制曲线，即为标准曲线。坐标绘制成一条竞争抑制曲线，即为标准曲线。免疫技术检测食品微生物第39页Ag*+Ag=Ag*-Ab+AgAg-Ab假设受检样品中不含抗原：假设受检样品中不含抗原：4Ag*+2Ab2Ag*-Ab+2Ag*在样品中含有抗原：在样品中含有抗原：4Ag*+4Ag+2Ab1Ag*-Ab+3Ag*+1Ag-Ab+3Ab免疫技术检测食品微生物第40页免疫技术检测食品微生物第41页三、免疫分析测定步骤三、免疫分析测定步骤用放射免疫分析进行测定时分三个步骤：用放射免疫分析进行测定时分三个步骤：（一）抗原抗体竞争抑制反应（一）抗原抗体竞争抑制反应（二）（二）B和和F分离分离（三）放射性测量（三）放射性测量免疫技术检测食品微生物第42页（一）抗原抗体竞争抑制反应（一）抗原抗体竞争抑制反应将抗原（标准品或受检样品）、标识抗原和抗体按次序将抗原（标准品或受检样品）、标识抗原和抗体按次序按照一定量加入到反应体系中，在一定温度下进行反应一定按照一定量加入到反应体系中，在一定温度下进行反应一定时间，使竞争抑制反应到达平衡。时间，使竞争抑制反应到达平衡。条件：条件：较高温度（较高温度（1537）较短时间温育；低温（）较短时间温育；低温（4）下较长时间温育下较长时间温育加样方法：加样方法：（1）平衡饱和加样程序加样次序平衡饱和加样程序加样次序:普通先加标准品或被测样普通先加标准品或被测样品，再加抗体，最终加标识抗原。品，再加抗体，最终加标识抗原。（2）次序饱和加样程序次序饱和加样程序：是先将标准品与抗体混匀，使抗是先将标准品与抗体混匀，使抗原与抗体充分结合，甚至到达平衡，然后再加入标识抗原，原与抗体充分结合，甚至到达平衡，然后再加入标识抗原，使之与抗体反应，最终分离使之与抗体反应，最终分离B与与F，这称为次序饱和分析法。，这称为次序饱和分析法。免疫技术检测食品微生物第43页（二）（二）B、F分离技术分离技术在放射免疫测定反应中，标识抗原和特异性抗体含量极在放射免疫测定反应中，标识抗原和特异性抗体含量极低，形成标识抗原抗体复合物（低，形成标识抗原抗体复合物（B）不能自行沉淀，所以需）不能自行沉淀，所以需要一个适当沉淀剂使它彻底沉淀，以完成与游离标识抗原要一个适当沉淀剂使它彻底沉淀，以完成与游离标识抗原（F）分离。）分离。1.非特异性分离法包含吸附法、过滤法、沉淀法等。非特异性分离法包含吸附法、过滤法、沉淀法等。2.特异性分离法包含双抗法、固相分离法等。特异性分离法包含双抗法、固相分离法等。B、F分离法分离方法分离方法(B)(B)抗原抗体复合物抗原抗体复合物(F)(F)游离抗原游离抗原平衡透析平衡透析活性炭吸附活性炭吸附凝胶过滤凝胶过滤微孔滤膜过滤微孔滤膜过滤电泳和层析电泳电泳和层析电泳双抗体法双抗体法固相分离法固相分离法硫酸胺沉淀法硫酸胺沉淀法聚乙二醇聚乙二醇(分子量分子量6 000)6 000)在透析袋内在透析袋内不被活性炭吸附离心不被活性炭吸附离心先被洗脱先被洗脱在醋酸纤维膜上在醋酸纤维膜上在球蛋白电泳带在球蛋白电泳带被第二抗体沉淀被第二抗体沉淀结合到固相物上结合到固相物上离心后于沉淀中离心后于沉淀中离心后于沉淀中离心后于沉淀中袋内外浓度相等被活性炭吸附于沉淀中后被洗脱经过滤膜被洗掉以其自己电泳泳动度移动离心后在上清液中在溶解相中在溶液中在溶液中免疫技术检测食品微生物第44页分离结合、游离标识物分离结合、游离标识物二抗体沉淀法二抗体沉淀法 PEG PEG 沉淀法沉淀法 PR PR 试剂法试剂法 活性炭吸附法活性炭吸附法 分离彻底，快速分离彻底，快速分离试剂和过程不分离试剂和过程不影响反应平衡影响反应平衡效果不受反应介质效果不受反应介质影响影响 操作应简单、重复操作应简单、重复性好性好经济经济 免疫技术检测食品微生物第45页（三）放射性强度测定（三）放射性强度测定B、F分离后，即能够进行放射性强度测定。测量分离后，即能够进行放射性强度测定。测量仪器有两类仪器有两类;液体闪烁计数仪（液体闪烁计数仪（射线，如射线，如3H、32P、14C等）等）晶体闪烁计数仪（晶体闪烁计数仪（射线，如射线，如125I、131I、57Cr等）。等）。免疫技术检测食品微生物第46页三、惯用放射性同位素三、惯用放射性同位素 选择同位素标准：选择同位素标准：放射性同位素选择首先考虑比活性，普通来说比活性放射性同位素选择首先考虑比活性，普通来说比活性越高越好。越高越好。标定方法简单、经济、便于推广应用。标定方法简单、经济、便于推广应用。易于防护。易于防护。同位素与标识物结合牢靠，不易从标识物上脱落。同位素与标识物结合牢靠，不易从标识物上脱落。对标识物不引发辐射损伤。对标识物不引发辐射损伤。含有较高计数效率。含有较高计数效率。免疫技术检测食品微生物第47页表表3-2各种各种标识标识同位素性同位素性质质比比较较同位素同位素毒性分类毒性分类衰变类型衰变类型半衰期半衰期3H14C35S32P131I125I低毒低毒低毒低毒中毒中毒中毒中毒高毒高毒低毒低毒EC12.26年年5730年年67.48天天14.26天天8.07天天6020天天125I半衰期较半衰期较131I长，同位素丰度大，辐射损伤小，计数效长，同位素丰度大，辐射损伤小，计数效率也较高，所以率也较高，所以125I比比131I更为惯用更为惯用免疫技术检测食品微生物第48页放射免疫测定法放射免疫测定法固相放射免疫测定法固相放射免疫测定法液相放射免疫测定法液相放射免疫测定法双层竞争法法双层竞争法法单层竞争法单层竞争法竞争性竞争性非竞争性非竞争性双层非竞争法双层非竞争法单层非竞争法单层非竞争法四、放射免疫测定技术种类四、放射免疫测定技术种类免疫技术检测食品微生物第49页四、放射免疫测定技术种类四、放射免疫测定技术种类（一）液相放射免疫测定（一）液相放射免疫测定基本过程：基本过程：适当处理待测样品适当处理待测样品按一定要求加样，使待测抗原与标识抗原竞相按一定要求加样，使待测抗原与标识抗原竞相与抗体结合或次序结合与抗体结合或次序结合反应平衡后，加入分离剂，将反应平衡后，加入分离剂，将B(标识抗原抗体标识抗原抗体复合物）和复合物）和F（抗原抗体复合物）分开（抗原抗体复合物）分开分别测定分别测定B和和F脉冲数；脉冲数；计算计算B/F、B%等值；等值；在标准曲线上查出抗原量在标准曲线上查出抗原量免疫技术检测食品微生物第50页（二）固相放射免疫测定（二）固相放射免疫测定（SPRIA）固相放射免疫测定原理：固相放射免疫测定原理：经过固相载体把特异经过固相载体把特异抗体连接起来，组成不溶性固相抗体。固相抗体再抗体连接起来，组成不溶性固相抗体。固相抗体再与抗原与抗原(标识抗原和未标识抗原标识抗原和未标识抗原)结合形成固相抗体结合形成固相抗体抗原复合物，经离心弃去上清液，测沉淀物放射抗原复合物，经离心弃去上清液，测沉淀物放射性强度，即可算出待测物浓度。性强度，即可算出待测物浓度。免疫技术检测食品微生物第51页1.抗体同位素标识方法抗体同位素标识方法标识物标识物放射放射射线：射线：131I、125I、57Cr和和60Co射线射线：14C、3H和和32P125I是当前惯用是当前惯用RIA标识物标识物敏感度高、有适当半衰期、易标识敏感度高、有适当半衰期、易标识直接标识法和间接标识法直接标识法和间接标识法免疫技术检测食品微生物第52页（1）直接标识法）直接标识法将将125I直接结合于蛋白质侧链残基酪氨酸上。直接结合于蛋白质侧链残基酪氨酸上。优点：操作简便，标识物含有高度比放射性。优点：操作简便，标识物含有高度比放射性。缺点：只能用于标识含酪氨酸化合物；蛋白质特异缺点：只能用于标识含酪氨酸化合物；蛋白质特异性和生物活性，易因标识而受损伤。性和生物活性，易因标识而受损伤。2.间接标识法（又称连接法）间接标识法（又称连接法）以以125I标识在载体上，纯化后再与蛋白质结合。标识在载体上，纯化后再与蛋白质结合。优点：可标识缺乏酪氨酸肽类及一些蛋白质。优点：可标识缺乏酪氨酸肽类及一些蛋白质。缺点：操作较复杂；比放射性显著低于直接法；标缺点：操作较复杂；比放射性显著低于直接法；标识反应较为温和，识反应较为温和，免疫技术检测食品微生物第53页最惯用氯胺最惯用氯胺T直接标识法。直接标识法。氯胺氯胺T是一个氧化剂。在偏碱溶液中（是一个氧化剂。在偏碱溶液中（pH7.5），氯胺），氯胺T将将125II氧化为氧化为I+，I+取代蛋白质酪氨酸苯环氢，形成二碘酪取代蛋白质酪氨酸苯环氢，形成二碘酪氨酸。反应式以下：氨酸。反应式以下：标识方法：将纯化抗原和标识方法：将纯化抗原和125I加入小试加入小试管底部，然后将新鲜配制氯胺管底部，然后将新鲜配制氯胺T快速快速冲入，混匀振荡数十秒冲入，混匀振荡数十秒2min后加入后加入偏重亚硫酸钠终止反应。再加