LINC01224靶向miR-485-5p调节PAK4表达影响结直肠癌术后复发的研究.pdf

184国际消化病杂志 2023 年 6 月 25 日第 43 卷第 3 期 Int J Dig Dis，June 25，2023，Vol.43，No.3 论著 LINC01224 靶向 miR-485-5p 调节 PAK4 表达影响 结直肠癌术后复发的研究 马胜辉 王春华 李建华 王 翔【摘要】目的 探究长链非编码 RNA（lncRNA）LINC01224 靶向 miR-485-5p调节 p21 激活激酶 4（PAK4）的表达，继而影响结直肠癌（CRC）患者术后复发的分子机制。方法 选取 2019 年 1 月至 2022 年 1 月承德市中心医院病理科归档的病历资料完整的 96 例患者的 CRC 组织，其中 54 例未复发患者设为未复发组，42 例局部复发、转移患者设为复发组。采用实时荧光定量 PCR 法检测 2 组 CRC 组织中LINC01224、miR-485-5p 和 PAK4 的表达水平。将人 CRC 细胞 CACO-2 和 HCT116各分为 3 组，分别制备 2 种细胞的对照组（为正常培养细胞）、NC 组（为转染阴性组，转染 NC-siRNA 慢病毒质粒）和 LINC01224 下调组（转染 LINC01224-siRNA 慢病毒质粒）。采用 CCK-8 法、细胞划痕实验和 Transwell 实验分别检测各组细胞的增殖、迁移和侵袭能力，荧光素酶报告实验鉴定 LINC01224 与 miR-485-5p、miR-485-5p 与PAK4 的靶向关系，蛋白质印迹法检测 PAK4 蛋白的表达水平。结果 与未复发组患者相比，复发组患者 CRC 组织中 LINC01224 和 PAK4 表达水平均显著升高，miR-485-5p 表达水平显著降低（P 均0.01）。与 NC 组和对照组细胞相比，LINC01224下调组细胞的增殖、迁移和侵袭能力均显著减弱（P0.05，P0.01，P0.01），而NC 组与对照组细胞的差异均无统计学意义（P 均0.05）。荧光素酶报告实验结果显示，LINC01224 与 miR-485-5p、miR-485-5p 与 PAK4 均存在靶向关系。LINC01224下调组细胞的 PAK4 蛋白表达水平较 NC 组和对照组均显著降低（P 均0.01）。结论 下调 LINC01224 的表达可以抑制 CRC 细胞的增殖、迁移和侵袭，其机制可能是 LINC01224 靶向 miR485-5p 调节 PAK4 的表达，从而影响 CRC 术后复发。【关键词】LINC01224；人结直肠癌细胞；迁移；侵袭；靶向关系DOI:10.3969/j.issn.1673-534X.2023.03.010LINC01224 targeted miR-485-5p regulation of PAK4 expression and its impact on postoperative recurrence of colorectal cancer MA Shenghui,LI Jianhua,WANG Xiang.Department of Oncology,Chengde Central Hospital,Chengde 067000,China;WANG Chunhua.Department of General Surgery,Hengshui Eighth Hospital,Hengshui 053000,China【Abstract】Objective This paper intends to explore the molecular mechanism of long chain non-coding RNA(lncRNA)LINC01224 targeting miR-485-5p regulating the expression of p21 activated kinase 4(PAK4),which then affects the postoperative recurrence of colorectal cancer(CRC)patients.Methods From January 2019 to January 2022,the CRC tissues of 96 patients with complete medical records archived by the Pathology Department of Chengde Central Hospital were selected,of which,54 non recurrent patients were assigned to the non recurrent group,and 42 locally recurrent and metastatic patients were assigned to the recurrent group.Real time fluorescence quantitative PCR was used to detect the expression levels of LINC01224,miR-485-5p,and PAK4 in the two groups of CRC tissues.Human 基金项目：河北省医学科学研究课题（20211022）作者单位：067000 承德市中心医院肿瘤科（马胜辉、李建华、王翔）；053000 衡水市第八医院普外科（王春华）185国际消化病杂志 2023 年 6 月 25 日第 43 卷第 3 期 Int J Dig Dis，June 25，2023，Vol.43，No.3CRC cells CACO-2 and HCT116 were divided into three groups respectively,and the control group(normal cultured cells),the NC group(negative transfection group,transfected with NC siRNA lentivirus plasmid)and the LINC01224 down-regulation group(transfected with LINC01224 siRNA lentivirus plasmid)of the two kinds of cells were prepared respectively.The CCK-8 method,the cell scratch test,and the Transwell test were conducted to detect the proliferation,migration,and invasion of cells in each group.The luciferase report assay was used to identify the targeting relationship between LINC01224 and miR-485-5p,miR-485-5p and PAK4,while western blotting was used to detect the expression level of PAK4 protein.Results Compared with the non recurrent group,the expression levels of LINC01224 and PAK4 in the CRC tissue of the recurrent group are significantly increased,while the expression level of miR-485-5p is significantly reduced(P0.05,P0.01,P0.01).Compared with the cells of the NC group and the control group,the proliferation,migration,and invasion abilities of the cells of the LINC01224 downregulated group are significantly reduced(P0.05,P0.01,P0.01),while the differences between the cells of the NC group and the control group are not statistically significant(P0.05).The results of the luciferase report assay show that LINC01224 has a targeting relationship with miR-485-5p,while miR-485-5p has a targeting relationship with PAK4.Compared with the NC group and the control group,the expression level of PAK4 protein in the cells of the LINC01224 downregulated group is significantly reduced(P0.01).Conclusions Downregulating the expression of LINC01224 can inhibit the proliferation,migration,and invasion of CRC cells.The mechanism may be that LINC01224 targets miR485-5p to regulate the expression of PAK4,thereby affecting postoperative recurrence of CRC.【Key words】LINC01224;Human colorectal cancer cells;Migration;Invasion;Targeting relationship结直肠癌（CRC）的发病原因中，除了人口老龄化和饮食习惯因素外，肥胖、缺乏体育锻炼和吸烟等因素也会增高 CRC 的发病风险1。目前CRC 的临床治疗包括内镜下切除、外科手术切除、转移性肿瘤的局部消融治疗、放射治疗、化学治疗、靶向治疗和免疫治疗2。由于 CRC 患者多在晚期出现症状而贻误了诊断和治疗时机，因此提高早期诊断率可以显著降低 CRC 患者的病死率和改善预后。长链非编码 RNA（lncRNA）是长度大于200个核苷酸的非编码RNA，其在调控表观遗传、细胞周期和细胞分化中扮演着重要角色，在多种恶性肿瘤发生、发展中起着重要作用。研究表明CRC 组织中 lncRNA LINC01224 表达上调，并可分泌 miR-2467 促进 CRC 进展3。LINC01224 还可靶向子宫内膜癌组织中 miR-485-5p 调节丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 3（AKT3）的表达，以促进细胞增殖并抑制细胞凋亡4。目前 LINC01224 在 CRC 中作用机制尚不明确。表观遗传学研究表明，miR-485-5p 和 p21 激活激酶 4（PAK4）是 CRC 的潜在生物标志物和抑癌因子，其参与了多条信号通路，影响肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移及凋亡，对肿瘤的发生和发展起着重要作用5-6。本课题组推测在 CRC中，LINC01224 可能通过调控 miR-485 影响 CRC 细胞的恶性生物学行为，因此本研究分析了不同预后患者的 CRC 组织中 LINC01224 表达水平，并探究了下调 LINC01224 表达对 CRC 细胞增殖、迁移、侵袭和患者术后复发的影响，以及其作用机制。1 材料与方法1.1 材料选 取 2019 年 1 月 至 2022 年 1 月 承 德 市 中 心医院病理科归档的病历资料完整的 96 例患者的CRC 组织标本。患者年龄 4672 岁，平均年龄为（62.155.21）岁，平 均 病 程 为（2.131.19）年。96 例患者中，54 例未复发患者（男性 28 例，女性26 例）设为未复发组，42 例局部复发、转移患者（男性 27 例，女性 15 例）设为复发组。所有患者均签署知情同意书，本研究获得医院医学伦理委员会批准。本研究中应用的人 CRC 细胞 CACO-2和 HCT116 均购自中国科学院细胞库。1.2 主要试剂及仪器青 霉 素、链 霉 素 均 购 自 美 国 Gibco 公司，Transwell 实 验 耗 材 购 自 美 国 Corning 公 司。LINC01224-siRNA 慢 病 毒 质 粒、NC-siRNA 慢 病毒质粒均购自广州市锐博生物科技有限公司，引186国际消化病杂志 2023 年 6 月 25 日第 43 卷第 3 期 Int J Dig Dis，June 25，2023，Vol.43，No.3物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，LipofectamineTM 2000 转染试剂购自美国 Invitrogen公司。CCK-8 细胞增殖及毒性检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。抗 PAK4 抗体、抗 GAPDH抗体（稀释比例为 1 10 000）及辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG 抗体均购自美国 Abcam 公司。1.3 方法1.3.1 实时荧光定量 PCR 法检测 在液氮中研磨CRC 组织，采用 TRIzol 试剂提取组织总 mRNA，采 用 miRNA cDNA Synthesis Kit 反 转 录 试 剂 盒 和SYBR Green PCR Master Mix Kit PCR 反转录试剂盒检测 LINC01224、miR485-5p 及 PAK4 的表达水平，所有操作在冰上进行，并避免 RNA 酶污染。使用 7500 Fast 实时荧光定量 PCR 仪，反应条件为：95 预变性 10 min；95 变性 10 s，60 退火 30 s，72 延伸 20 s，共 35 个循环。分别以 GAPDH 和U6 作为内参，以 2-Ct法计算目标基因相对表达量7。引物序列见表 1。表 1 引物序列引物名称序列LINC01224正向：5-AGAGCTTGGGATCGCTTTCTG-3反向：5-TTACTCAGGTGCCTTTCCCAC-3miR-485-5p正向：5-CCAAGCTTCACCCATTCCTAACAGGAC-3反向：5-CGGGATCCGTAGGTCAGTTACATGCATC-3PAK4正向：5-ATGTGGTGGAGATGTACAACAGCTAC-3反向：5-GTTCATCCTGGTGTGGGTGAC-3U6正向：5-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3反向：5-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3GAPDH正向：5-CTGGGCTACACTGAGCACC-3反向：5-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-31.3.2 细胞培养和转染 将复苏后的 CACO-2 细胞和 HCT116 细胞加入 DMEM 培养液 10%胎牛血 清青霉素（100 g/mL）链霉素（100 g/mL），细胞悬液用计数板进行细胞计数。用培养液将细胞数调整为 2105个/mL5105个/mL，分装于培养瓶中，使细胞悬液覆盖后略高于培养瓶底部，置于 5%CO2、37 培养箱内静置培养。用 胰 酶 消 化 细 胞 后 重 选，转 染 步 骤 按 照LipofectamineTM 2000 转 染 试 剂 说 明 书 进 行。将CACO-2 细胞和 HCT116 细胞各分为 3 组，分别制备 2 种细胞的对照组（为正常培养细胞）、NC 组（为转染阴性组，转染 NC-siRNA 慢病毒质粒）和LINC01224 下调组（转染 LINC01224-siRNA 慢病毒质粒）。A 液用 200 L 减血清培养基（Opti-MEM）稀 释 4 g 质 粒，B 液 用 200 L Opti-MEM 稀 释 10 L 脂质体 2000（lipo2000）。分别将 A 液、B 液轻轻混匀，静置 5 min。吸取 B 液加至 A 液中，轻轻混匀，室温下静置 20 min。将转染试剂加至 6 孔板中，6 h 后更换为完全培养基，置于 5%CO2、37 培养箱中培养，48 h 后用于各组实验8。1.3.3 CCK-8 法 采 用 CCK-8 法 测 定 CACO-2 细胞和 HCT116 细胞的增殖能力，对照组、NC 组和LINC01224 下调组细胞以 2103个/孔的密度接种至 96 孔板，在 37 下培养 24 h，向每孔加入 10 L CCK-8 溶液，将培养板在培养箱内孵育 14 h 后，用酶标仪测定各孔 24 h、48 h 和 72 h 时在 450 nm处的吸光度（OD）值9。1.3.4 细 胞 划 痕 实 验 将 各 组 CACO-2 细 胞 和HCT116 细胞以 1106个/孔的密度接种至 6 孔板，24 h 后用最细枪头垂直划痕，划痕后用 PBS 轻轻清洗细胞 3 次，加入无血清培养基。放入 5%CO2、37 培养箱中培养 24 h 后拍照10。1.3.5 Transwell 侵袭实验 将状态良好的细胞消化，吹打均匀，将细胞密度调整为 1104个/mL 1105个/mL，吸取 0.4 mL 细胞悬液接种于含基质胶的 Transwell 小室。加入 300 L 含 10%胎牛血清的培养基，将 24 孔板置于培养箱中孵育 24 h，4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，各组细胞在 Transwell小室中随机选取 3 个显微镜下视野拍照并进行定量分析11。1.3.6 蛋白质印迹法 在冰上将各组细胞用 RIPA蛋白裂解液提取总蛋白，4 下以 1 200 r/min 离心15 min，收集裂解液上清，通过聚丙烯酰胺电泳按相对分子质量进行分离，再转移到杂交膜上，然187国际消化病杂志 2023 年 6 月 25 日第 43 卷第 3 期 Int J Dig Dis，June 25，2023，Vol.43，No.3后通过一抗、二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测，步骤为：80 V 10 min，120 V 电泳 2 h，100 V 湿转 120 min，一抗 4 下摇床孵育 12 h，二抗室温下 孵 育 60 min，加 入 ECL 发 光 剂，拍 照，采 用Photoshop 软件对蛋白条带进行灰度值定量分析12。1.4 术后随访患者每 3 个月来门诊复查，随访截至 2022 年6 月 30 日。1.5 统计学处理应用 SPSS 25.0 软件进行统计学分析，应用GraphPad 8 软件及 Illustrator CS6 软件绘图。计量资料以均数 标准差（xs）表示，细胞增殖能力各时点指标变量采用重复测量的方差分析，符合正态分布且满足方差齐性的 2 组间比较采用双尾独立样本 t 检验。P0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1 未复发组和复发组 CRC 组织中 LINC01224、miR-485-5p 和 PAK4 的表达水平比较如图 1 所示，与未复发组相比，复发组 CRC组织中LINC01224和PAK4的表达水平均显著升高，miR-485-5p 的表达水平显著降低，差异均有统计学意义（P 均0.01）。注：与未复发组相比，*P0.01图 1 未复发组和复发组 CRC 组织中 LINC01224、miR-485-5p 和 PAK4 的表达水平比较 A LINC01224 B miR-485-5p C PAK42.2 下调 LINC01224 表达的验证如 图 2 所 示，LINC01224 下 调 组 CACO-2 细胞和 HCT116 细胞的 LINC01224 表达水平均较 NC组和对照组显著下降，差异均有统计学意义（P 均0.01），而 NC 组与对照组的 LINC01224 表达水平差异均无统计学意义（P 均0.05）。注：ns为NC组与对照组相比，P0.05；与对照组相比，*P0.01图 2 下调 LINC01224 表达的验证 A CACO-2 细胞 B HCT116 细胞2.52.01.51.00.50.02.01.51.00.50.03210LINC01224 相对表达量未复发组未复发组未复发组复发组复发组复发组miR-485-5p 相对表达量PAK4 相对表达量2.01.51.00.50.02.01.51.00.50.0nsns*NC 组NC 组对照组对照组下调组下调组LINC01224 相对表达量LINC01224 相对表达量*AABBC188国际消化病杂志 2023 年 6 月 25 日第 43 卷第 3 期 Int J Dig Dis，June 25，2023，Vol.43，No.32.3 下调 LINC01224 表达对 CRC 细胞增殖能力的影响如 表 2 所 示，与 对 照 组 和 NC 组 细 胞 相 比，LINC01224 下调组 CACO-2 细胞和 HCT116 细胞的OD 值均显著下降（P 均0.05），而 NC 组与对照组的 OD 值差异均无统计学意义（P 均0.05）。结果表明 LINC01224 下调组的细胞增殖能力较对照组和 NC 组均显著减弱。表 2 各组细胞的增殖能力比较组别24 h OD 值48 h OD 值72 h OD 值CACO-2HCT116CACO-2HCT116CACO-2HCT116对照组0.580.110.590.210.760.170.810.151.190.141.200.12NC 组0.570.140.560.140.790.120.800.131.210.221.190.11LINC01224 下调组0.440.13ac0.410.11ac0.580.17ac0.520.10ac0.650.16bd0.690.13bd注：与对照组相比，aP0.05，bP0.01；与NC组相比，cP0.05，dP0.012.4 下调 LINC01224 表达对 CRC 细胞迁移能力的影响如 图 3 所 示，细 胞 划 痕 实 验 结 果 显 示，LINC01224 下调组 CACO-2 细胞和 HCT116 细胞划痕均显著宽于对照组和 NC 组（P 均0.01），而NC 组与对照组细胞划痕的差异均无统计学意义（P均0.05）。该结果表明 LINC01224 下调组的细胞迁移能力较对照组和 NC 组均显著减弱。图 3 各组细胞的划痕实验结果比较 A CACO-2 细胞 B HCT116 细胞对照组NC 组LINC01224 下调组2.5 下调 LINC01224 表达对 CRC 细胞侵袭能力的影响如图 4 所示，Transwell 侵袭实验结果显示，与对照组和 NC 组相比，LINC01224 下调组 CACO-2细胞和 HCT116 细胞的侵袭数量均显著减少（P 均0.01）,而 NC 组与对照组的差异均无统计学意义（P 均0.05）。该结果表明 LINC01224 下调组的细胞侵袭能力较对照组和 NC 组均显著减弱。2.6 LINC01224 靶向 miR-485-5p 对 PAK4 蛋白表达的影响分析荧光素酶报告实验结果显示，LINC01224 与miR-485-5p 存在靶向关系，而 miR-485-5p 可以进一步靶向 PAK4。见图 5。蛋白质印迹法结果显示，LINC01224 下调组CACO-2 细胞的 PAK4 蛋白表达水平（0.280.05）较 对 照 组 和 NC 组 CACO-2 细 胞（0.530.19、AB189国际消化病杂志 2023 年 6 月 25 日第 43 卷第 3 期 Int J Dig Dis，June 25，2023，Vol.43，No.30.530.17）均显著降低（P 均0.01）；LINC01224下 调 组 HCT116 细 胞 的 PAK4 蛋 白 表 达 水 平（0.950.27）较 对 照 组 和 NC 组 HCT116 细 胞（1.310.31、1.350.36）均显著降低（P 均0.01）；而 NC 组与对照组 CACO-2 细胞和 HCT116 细胞的PAK4 蛋白表达水平差异均无统计学意义（P 均0.05）。该结果表明，LINC01224 可以靶向 miR-485-5p 调控 PAK4 蛋白的表达。见图 6。图 4 各组细胞的 Transwell 侵袭实验结果比较 结晶紫染色 400 A CACO-2 细胞 B HCT116 细胞对照组NC 组LINC01224 下调组图 5 目标基因与 miR-485-5p 的互补序列 A LINC01224 与 miR-485-5p 的互补序列 B PAK4 与 miR-485-5p 的互补序列图 6 各组 CACO-2 和 HCT116 细胞中 PAK4 蛋白的表达水平比较 A CACO-2 细胞 B HCT116 细胞3 讨论CRC 居全球恶性肿瘤病死率第 4 位，每年死亡病例数约 70 万13。发达国家的 CRC 发病率较高，随着人们饮食习惯和生活方式的西化，超重和肥胖的患病率高达 30%，其是 CRC 发生的重要风险因素，BMI30 kg/m2者罹患 CRC 的风险较 BMI 23 kg/m2者增高 41%，而目前认为便秘不是 CRC的危险因素14-15。许多研究结果表明，药物、营养补充剂、饮食习惯调整和增加体育运动的综合干预方案可有效预防 CRC 的发生13,15。lncRNA 可以作为 CRC 等多种肿瘤的生物标志物16，研究发现LINC01224 可作为乳腺癌的生物标志物17，另有ABAABB对照组对照组NC 组NC 组LINC01224 下调组LINC01224 下调组PAK4GAPDHPAK4GAPDH190国际消化病杂志 2023 年 6 月 25 日第 43 卷第 3 期 Int J Dig Dis，June 25，2023，Vol.43，No.3研究发现 LINC01224 表达特征是子宫内膜癌患者的独立预后因素18。本 研 究 表 明，CRC 术 后 复 发、转 移 患 者 的CRC 组 织 中 LINC01224 呈 高 表 达，提 示 其 可 能是 CRC 复发的标志物。本研究结果显示，下调LINC01224 表达后，CRC 细胞的增殖、迁移和侵袭能力均降低。CRC 细胞的增殖、迁移和侵袭能力是影响肿瘤复发、转移的重要因素。此外，本研究还发现 CRC 术后复发患者的CRC 组 织 中 miR-485-5p 呈 低 表 达。有 研 究 报 道miR-485-5p 在宫颈癌患者耐药中起着重要作用，其与疗效显著相关19，鉴于该研究结论，本研究进一步探究了 LINC01224 是否通过靶向 miR-485-5p表达影响 CRC 的发生和发展。本研究中，荧光素酶报告实验结果显示 LINC01224 与 miR-485-5p 存在靶向关系，miR-485-5p 可以进一步靶向 PAK4。既往研究表明，PAK4 信号通路调控 miRNA 表达以抑制 CRC 细胞的迁移和侵袭，是 CRC 治疗的重要靶点20。本研究证实了 LINC01224 靶向调控 miR-485-5p 表达后，miR-485-5p 可进一步调控 PAK4 的表 达，并 且 在 下 调 LINC01224 表 达 后，PAK4 的表达水平显著降低，该结果进一步证实了本研究发现的下调 LINC01224 表达后 CRC 细胞增殖、迁移和侵袭能力均减弱的现象，提示患者术后未复发的机制可能是低表达的 LINC01224 通过靶向miR485-5p 调节 PAK4 的表达来实现的。综上所述，本研究结果表明，下调 LINC01224的表达可以抑制 CRC 细胞的增殖、迁移和侵袭，其作用机制可能是 LINC01224 靶向 miR485-5p 调节 PAK4 的表达。本研究的样本量较小，结果可能存在偏倚，今后将扩大样本量，对 LINC01224、miR485-5p 和 PAK4 的表达进行相关性分析，进一步探讨三者之间的靶向调控关系及分子机制。参 考 文 献1 Dekker E,Tanis PJ,Vleugels JLA,et al.Colorectal 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