m%5E%286%29A甲基化转移酶3在糖尿病性白内障发病中的作用机制.pdf

实验论著 甲基化转移酶 在糖尿病性白内障发病中的作用机制陈 思叶 巍唐 韵王文喆葛轶睿王雪莹黄振平引用:陈思叶巍唐韵等.甲基化转移酶 在糖尿病性白内障发病中的作用机制.国际眼科杂志():作者单位:()中国江苏省南京市东南大学医学院()中国江苏省南京市东部战区总医院眼科()中国江苏省南京市南京大学医学院作者简介:陈思女在读硕士研究生研究方向:白内障通讯作者:黄振平男毕业于北京大学医学院博士主任医师博士研究生导师研究方向:白内障、角膜病、眼视光.收稿日期:修回日期:摘要目的:探讨 甲基腺嘌呤()甲基化转移酶()在糖尿病性白内障发病中的作用机制方法:用低糖和高糖培养基培养人晶状体上皮细胞系(/)后采用 和 实验检测细胞的上皮间质转分化()指标:钙黏蛋白()、钙黏蛋白()、紧密连接蛋白()和 平滑肌肌动蛋白()的变化情况 和划痕实验检测细胞迁移能力 采用免疫荧光染色检测人晶状体前囊膜组织中 的表达量及定位 实验检测在低糖和高糖培养基中培养 细胞的 甲基化水平 和 实验检测 细 胞 中 的 和 蛋 白 表 达 量 加 入 抑制剂的培养基中培养 的细胞 和 实验检测 指标的变化情况 实验检测细胞 甲基化水平 和划痕实验检测细胞迁移能力 免疫荧光染色检测细胞中转化生成因子()的表达 和 实验检测细胞中的 和 的表达量结果:与低糖条件相比高糖条件能够促进细胞 的发生促进 的表达和上调了细胞总 的 甲基化水平(.)高糖能够促进细胞的迁移能力 糖尿病性白内障患者晶状体前囊膜中 表达较单纯年龄相关性白内障患者增高 与高糖 组相比加入 抑制剂 能够抑制细胞的 发生抑制 和 的 表达抑制细胞总 的 甲基化水平(均.)加入 抑制剂 后细胞迁移能力较高糖 组降低结论:甲基化转移酶 通过激活/通路促进了在高糖条件下人晶状体上皮细胞的 发生从而诱导糖尿病性白内障的发生关键词:糖尿病性白内障甲基化转移酶()甲基腺嘌呤()上皮间质转分化:./.:.:()().:/()().().:(.).国际眼科杂志 年 月 第 卷第 期 :/.电话:电子信箱:.(.)().:/.:()():.()():引言随着社会发展和生活水平的提高糖尿病的患病率逐年上升预计到 年全球糖尿病患病率为.糖尿病性白内障是糖尿病的眼部常见并发症之一与非糖尿病人群相比糖尿病患 者患白内 障的发病率 增加了 倍尤其是囊膜下型混浊在糖尿病性白内障中发生率更高 近年来有研究表明晶状体上皮细胞发生上皮间质转分化()是糖尿病性白内障发生的重要病理过程 是上皮细胞转化成间质细胞的过程 在 发生过程中上皮细胞标志物如 钙黏蛋白()、紧密连接蛋白()等下降而间质细胞标志物如 钙黏蛋白()、平滑肌肌动蛋白()等上升 有研究发现在链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠晶状体中在晶状体后囊下区域有异常的有核细胞存在即发生 在高糖诱导的晶状体上皮细胞中也被发现 但是高糖调控晶状体上皮细胞 的发病机制尚不明确甲基嘌呤()主要通过 甲基化的转移酶(如 等)去甲基化酶还有 结合蛋白等 在一些肿瘤相关研究中发现 表达升高 介导的 甲基化促进了肿瘤细胞的 发生 也有研究提出 甲基化在糖尿病性白内障的发生 而在糖尿病性白内障发病过程中 对晶状体上皮细胞 的调控相关研究较少 在调控细胞 发 生 的 各 种 信 号 通 路 中 转 化 生 成 因 子 ()相关的信号通路发挥了重要的作用 也是调节眼组织生理或病理过程中最重要的信号分子之一 有研究表明在活化的库普弗细胞(细胞)中 可以调控 的表达 而 已被证实是参与 调控 的重要的下游核转录因子本文主要研究了在糖尿病性白内障发病过程中 介导的晶状体上皮细胞的 甲基化的发生以及对其 的调控作用初步探索了下游的调控机制为防治糖尿病性白内障找寻新的靶点 对象和方法.对象前瞻性研究 收集/东部战区总医院收治的年龄相关性白内障患者 例 眼和糖尿病性白内障患者 例 眼所有患者除白内障外均无眼部其他病变 在行常规的白内障超声乳化手术中由同一术者行连续环形撕囊获得直径约为 的类圆形前囊膜组织片其上附有晶状体上皮细胞 术中取患者晶状体前囊膜两组患者术前一般资料比较结果见表 本研究经东部战区总医院伦理委员会批准(.)实验过程中对手术标本的处理遵照赫尔辛基宣言样本获取过程中均获得患者在术前签署的知情同意书.方法.细胞培养和处理及分组 人晶状体上皮细胞/(公司美国)在 培养基中培养补充胎牛血清()和 青霉素链霉素双抗并置于细胞孵箱中孵育 分为 组:低糖组:低糖(./)培养基中培养 高糖组:高糖(./:每 低糖 培养基.葡萄糖糖粉)中培养 高糖 组:高糖 培养基二甲基亚砜()中培养 高糖 组:高糖 培养基/(溶于 中)中培养.实验将细胞消化、离心重悬于无血清的 培养液中取 细胞悬液用于细胞计数将 小室(德国)置于 孔板中下室分别加入 的条件培养基上室加入计数的细胞悬液(约个)做好标记细胞孵箱中孵育 后经过 多聚甲醛固定、结晶紫染色后在倒置显微镜(日本)下观察拍照实验重复 次以上.划痕实验 在 孔板的背面划出需要的横线将细胞接种于 孔板中在细胞孵箱中孵育待细胞融合至然后用无菌移液枪头在相应地方作细胞划痕清洗掉脱落细胞分别加入相应条件培养基放入 细胞孵箱中孵育 在倒置显微镜下观察拍照实验重复 次以上 细胞迁移率(划痕面积 划痕面积)/划痕面积表 两组患者术前一般资料比较分组例数(眼数)性别(男/女例)年龄(岁)随机血糖(/)糖化血红蛋白()年龄相关性白内障组()/.糖尿病性白内障组()/./.:/.:.实验将细胞接种于 细胞培养皿收集细胞裂解物提取总蛋白并且定量经过制胶、电泳、转膜、封闭、孵育、清洗发光液均匀铺洒后于显影仪(中国)下显影拍照实验重复 次以上 用于免疫印迹的一抗包括(中国武 汉)(中 国 武 汉)、(中 国 武 汉)、(中国武汉)、(中 国 武 汉)、(中国武汉)、(中国武汉)、(英国).细胞免疫荧光法将置于 孔培养板中的晶状体前囊膜标本(用于检测 及 表达)/共聚焦小皿中不同条件培养基的/细胞(用于检测不同条件培养基中 表达)进行清洗、固定、封闭、孵育一抗()、清洗孵育加荧光标记的二抗()封片后于共聚焦显微镜下观察拍照实验重复 次以上所用的一抗包括:(中国武汉)、(中 国 武 汉)、(中国武汉).提取和 实验 将/细胞接种于 孔板中加入相应条件的培养液培养 法提取总 逆转录使用逆转录试剂盒()实验重复 次以上 引物设计通过.软件自行设计所设计引物通过 软 件 检 测 其 产 物 正 确 :上 游 引 物 下 游 引 物 作为内参 靶基因的引物如下:引物序列:上游 下游 引物序列:上游下游 引物序列:上游 下游 引物序列:上游 下游 引物序列:上游 下游 引物序列:上游 下游 引物序列:上游 下 游:实时定量反应体系 所用 试剂()荧光定量扩增仪进行 计算目的基因相对表达量即目的基因/内参基因.实验 法提取总 统一浓度后经加热 冰上冷却后用枪头吸取加热冷却后产物在 膜上留下印记晾干后紫外线照射 经清洗、封 闭、孵 育 均 匀 滴 上 发 光 液 后 在 显 影 仪(中国)下显影拍照后经亚甲蓝染色 并在白光下拍照通过 软件测量每个点的相对信号密度统计学分析:使用.和 .统计软件进行分析计量数据均以均数标准差表示两组间比较采用独立样本 检验采用单因素方差分析比较多组间差异多组间两两比较采用 检验计数资料用例数(眼数)表示采用卡方检验 以.为差异具有统计学意义 结果.不同糖浓度培养 对人晶状体上皮细胞 的影响.实验结果 将人晶状体上皮细胞分别在低糖(./)和高糖(./)的 培养液中培养 提取总蛋白行 实验结果显示与低糖组相比高糖组 上皮标志物(.)、(.)下降间质标志物(.)、(.)上升差异均有统计学意义 提示高糖促进了人晶状体上皮细胞 的发生见图.实验结果 提取高糖组和低糖组人晶状体上皮细胞的 行 实验结果提示高糖组上皮标志物(.)、(.)较低糖组下降间质标志物 (.)、(.)较低糖组上升差异均有统计学意义 提示高糖促进了人晶状体上皮细胞 的发生见图 图 实验检测不同糖浓度培养 后对人晶状体上皮细胞 的影响:实验结果:柱状图(.低糖组)国际眼科杂志 年 月 第 卷第 期 :/.电话:电子信箱:.划痕实验结果 划痕实验结果提示高糖组人晶状体上皮细胞迁移能力较低糖组增加差异有统计学意义(.)见图.实验结果 实验结果提示高糖组人晶状体上皮细胞迁移能力大于低糖组差异有统计学意义(.)见图.免疫荧光实验检测人晶状体前囊膜 表达情况 免疫荧光实验检测糖尿病性白内障和年龄相关性白内障患者前囊膜中人晶状体上皮细胞 的表达及定位以及共染 发现在糖尿病性白内障患者前囊膜中、表达高于年龄相关性白内障患者中的表达(图).不同糖浓度培养 对人晶状体上皮细胞 和 甲基化水平的影响.实验结果 实验结果提示高糖组人晶状体上皮细胞总 的 甲基化水平较低糖组升高差异有统计学意义(.)见图.实验结果 实验结果提示高糖组人晶状体上皮细胞中 蛋白表达较低糖组高差异有统计学意义(.)见图 图 检测不同糖浓度培养 后对人晶状体上皮细胞 的影响:.低糖组图 划痕实验检测不同糖浓度培养 后对人晶状体上皮细胞迁移能力的影响 :划痕实验检测结果:柱状图(.低糖组)图 实验检测不同糖浓度培养 后对人晶状体上皮细胞迁移能力的影响:实验结果:柱状图(.低糖组).:/.:.图 免疫荧光实验检测人晶状体前囊膜 表达情况 红色:绿色:蓝色:共定位图像图 实验检测不同糖浓度培养 后对人晶状体上皮细胞 甲基化水平的影响:实验结果:柱状图.低糖组图 实验检测不同糖浓度培养 后对人晶状体上皮细胞 表达的影响:实验结果:柱状图(.低糖组).实验结果 实验结果提示高糖组人晶状体上皮细胞的 表达量较低糖组升高差异有统计学意义(.)见图.抑制剂 对人晶状体上皮细胞 的影响.实验结果 实验检测四组人晶状体上皮细胞的 甲基化水平差异有统计学意义(.)检验结果显示与低糖组相比高糖组 甲基化水平增高差异有统计学意义(.)与 高 糖 组 相 比 加 入 抑 制 剂 后 甲基化水平降低差异有统计学意义(.)提示 降低了高糖条件下 甲基化水平且溶剂 对实验结果无显著影响见图 图 实验检测不同糖浓度培养 后对人晶状体上皮细胞 表达的影响.低糖组.实验结果 实验检测四组人晶状体上皮细胞的 的上皮标志物(.国际眼科杂志 年 月 第 卷第 期 :/.电话:电子信箱:.)、(.)间质标志物(.)、(.)差异均有统计学意义 检验结果显示与低糖组 相 比 高 糖 组 细 胞 的 上 皮 标 志 物 、降低间质标志物、升高差异均有统计学意义(.)与高糖 组相比加入 后 细 胞 的 上 皮 标 志 物 、升高间质标志物、降低差异均有统计学意义(.)提示 能有效抑制高糖条件处理的人晶状体上皮细胞的 的水平且溶剂 对实验结果无显著影响见图.实验结果 实验检测四组人晶状体上皮细胞的 的上皮标志物 (.)、(.)间质标志物(.)、(.)差异均有统计学意义 检验结果显示与低糖组相比高糖组细胞 的上皮标志物 、降低间质标志物、升高差异均有统计学意义(.)与高糖 组相比加入 后 细 胞 的 上 皮 标 志 物 、升高间质标志物、降低差异均有统计学意义(.)提示 能有效抑制高糖条件处理的人晶状体上皮细胞的 的水平且溶剂 对实验结果无显著影响见图.实验结果 实验检测四组人晶状体上皮细胞的迁移能力差异有统计学意义(.)检验结果显示与低糖组相比高糖组细胞迁移能力升高差异有统计学意义(.)与高糖 组相比加入 后细胞迁移能力降低差异有统计学意义(.)提示 能有效抑制高糖条件处理的人晶状体上皮细胞的迁移能力且溶剂 对实验结果无显著影响见图.划痕实验结果 划痕实验检测四组人晶状体上皮细胞的迁移能力差异有统计学意义(.)检验结果显示与低糖组相比高糖组细胞迁移能力升高差异有统计学意义(.)与高糖 组相比加入 后细胞迁移能力降低差异有统计学意义(.)提示 能有效抑制高糖条件处理的人晶状体上皮细胞的迁移能力且溶剂 对实验结果无显著影响见图.抑制剂对/细胞 和 影响.免疫荧光实验结果免疫荧光实验结果提示在高糖培养组中细胞中 表达量较低糖组增高加入 抑制剂后 的表达较高糖 组降低提示加入 抑制剂降低了高糖条件下 的表达见图 图 实验检测四组人晶状体上皮细胞的 甲基化水平:实验:柱状图.低糖组.高糖 组图 实验检测四组人晶状体上皮细胞的 指标 相对表达量情况:.低糖组.高糖 组 .:/.:.图 实验检测四组人晶状体上皮细胞的 指标蛋白表达情况:实验结果:柱状图(.低糖组.高糖 组)图 实验测定加入 抑制剂 对人晶状体上皮细胞迁移能力的影响:实验结果:柱状图(.低糖组.高糖 组)图 划痕实验测定加入 抑制剂 对人晶状体上皮细胞迁移能力的影响:划痕实验结果:柱状图(.低糖组.高糖 组).实验结果 实验检测四组人晶状体上皮细胞的(.)、(.)差异均有统计学意义 检验结果显示与低糖组相比高糖组细胞、升高差异均有统计学意义(.)与高糖 组相比加入 后细胞、降低差异均有统计学意义(.)提示 能有效抑制高糖条件处理的人晶状体上皮细胞的、表达水平且溶剂 对实验结果无显著影响见图.实验结果 实验检测四组人国际眼科杂志 年 月 第 卷第 期 :/.电话:电子信箱:.图 免疫荧光实验检测加入 抑制剂 对人晶状体上皮细胞 的影响 绿色:蓝色:共定位图像图 实验检测加入 抑制剂对人晶状体上皮细胞 和 的影响:实验结果:柱状图以 为内参(.低糖组.高糖 组)晶状体上皮细胞的(.)、(.)差异均有统计学意义 检验结果显示与低糖组相比高糖组细胞、升高差异均有统计学意义(.)与高糖 组相比加入 后细胞、降低差异均有统计学意义(.)提示 能有效抑制高糖条件处理的人晶状体上皮细胞的、表达且溶剂 对实验结果无显著影响见图 讨论 的 修饰是表观遗传调控中的关键调控之一如今受到越来越多研究者的关注 作为真核细胞中最丰富的内部修饰 在各种生理过程和疾病进展中显示出广泛的调节作用 有研究行 实验发现糖尿病性白内障患者前囊膜组织中 水平升高并且通过 软件对 火山图进行分析提出几个 靶基因包括、和 本实验中我们使用免疫荧光染色发现在糖尿病性白内障患者的前囊膜中 的甲基化转移酶 表达增加使用 和 实验发现在高糖条件下培养的细胞中 的 和蛋白表达水平增加利用 实验发现在高糖条件下 甲基化水平增高 而关于 在糖尿病性白内障发病中的作用机制我们仍然不是很清楚 是参与细胞可塑性的过程也在越来越多研究中发现其在各种疾病的发生中占有重要的位置 是由、骨形态发生蛋白()、连环蛋白和 等信号通路介导的这些通路可以被局部微环境的各种因素刺激激活 在 的过程中细胞的迁 .:/.:.图 法检测在不同条件培养基培养 后细胞的 和 表达水平:.低糖组.高糖 组移能力增加白内障与 之间有着密切联系也被相关研究提出 同时在高糖环境中由于抗氧化能力的损伤晶状体也更易发生 在高糖培养的细胞中我们利用 和 实验同样发现 的上皮标 志 物 和 下 降 间 质 标 志 物和 上升且细胞迁移实验也发现在高糖条件下细胞迁移能力增加 这提示我们 可能与糖尿病性白内障的发生相关除此之外在肿瘤学的相关研究中发现 介导了宫颈癌、肝癌、肺癌中 的发生并且 甲基化可以调节 的翻译 但是 在糖尿病性白内障中与 相关性的研究还未见报导 在本实验中我们发现加入 抑制剂 之后 的上皮 标 志 物 、上 升 间 质 标 志 物、下降且细胞的迁移能力较高糖 条件下降低这提示我们 促进了高糖条件下细胞的 发生 而在糖尿病性白内障中介导 发生的通路还鲜有研究在哺乳动物中已知的有三种 异构体即、和 其中 在包括糖尿病性白内障在内的许多疾病中对 的发生起着重要的调节作用 而 家族参与了细胞运动的过程包括生理及病理过程中获得侵袭性和迁移性的过程 的病理激活参与了 的过程已在多种研究中得到验证 而/通路在 的进展中发挥着的重要的作用也得到了研究证实 在本实验中我们发现高糖条件下 和 的表达量升高而加入 抑制剂之后 和 表达量下降 所以我 们推断 通过调控/通路促进高糖条件下的 综上所述我们发现了高糖可以促进人晶状体上皮细胞 的发生、的增高和 甲基化水平的增高同时糖尿病性白内障患者前囊膜中 表达的升高 在加入 抑制剂后可以抑制高糖引起的细胞 的发生同时引起 和 的下降 据此我们推测 可能通过调控/促进高糖条件下 但是该信号通路与 甲基化在糖尿病性白内障中 的作用仍然需要进一步的研究证实 而该通路是否是调控糖尿病性白内障患者 发生的关键通路也需要更多的研究参考文献 .:.():.:.():.():.():.:马济远 叶巍 李吉 等.自噬调节高浓度葡萄糖诱导的人晶状体上皮细胞上皮间质转化.国际眼科杂志():.:.():./.:./.:.():.().():.国际眼科杂志 年 月 第 卷第 期 :/.电话:电子信箱:.():.:.():.():./.():.():.():.:.:.:.:.():.():.():./.():.():.():.():.:.():.():.():.():.:/.:.