不同温度对柔嫩艾美耳球虫卵囊活力的影响.pdf

不同温度对柔嫩艾美耳球虫卵囊活力的影响林栩慧1#，朱易斌1#，郭素茵3，戚南山1，郭钊文3，李娟1，严专强2，尹丽娟2，李汝洪3，刘佐正4，吕敏娜1，廖申权1，2*，孙铭飞1*（1.广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室/农业农村部禽流感等家禽重大疾病防控重点实验室，广东 广州，510640；2.岭南现代农业科学与技术广东省实验室云浮分中心，广东 云浮 527400；3.清远市清城区动物防疫中心，广东 清远 511500；4.河源市温氏畜禽有限公司，广东 河源 517000）摘 要：环境温度是影响鸡球虫卵囊孢子化和活力的重要因素，该研究通过监测鸡球虫卵囊孢子化率、鸡感染球虫后的肠道病变以及卵囊排出情况，探讨不同温度对柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊的孢子化作用以及对孢子化卵囊的活性影响。结果表明：未孢子化卵囊分别经过-80 处理30 min，-40、-20、0、4、10、28、40、50 处理30 min或1 h后，孢子化活性均无显著变化；未孢子化卵囊分别经过-80 处理1 h以上、-40 或-20 处理48 h以上、60 处理30 min以上后孢子化活性被抑制；孢子化卵囊经液氮处理2 min、-80 或高于50 条件处理超过1 h，卵囊活力基本为0，在-20 处理112 h或50 处理30 min卵囊仍表现有一定活力。该研究为鸡球虫卵囊保存条件提供数据支持，对防治鸡球虫病具有一定的研究意义。关键词：柔嫩艾美耳球虫；不同温度；卵囊活力中图分类号：S852.7文献标识码：A文章编码：10058567（2023）04001307Effects of Different Temperatures on Viability andSporulation of Oocysts from Eimeria TenellaLIN Xuhui1#，ZHU Yibin1#，GUO Suyin3，QI Nanshan1，GUO Zhaowen3，LI Juan1，YAN Zhuanqiang2，YINLijuan2，LI Ruhong3，LIU Zuozheng4，LV Minna1，LIAO Shenquan1，2*，SUN Mingfei1*（1.Key Laboratory of Livestock Disease Prevention of Guangdong Province，Scientific Observation and ExperimentStation of Veterinary Drugs and Diagnostic Techniques of Guangdong Province，Key Laboratory of Avian Influenza andOther Major Poultry Diseases Prevention and Control，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Institute of AnimalHealth，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou Guangdong 510640；2.Yunfu Branch Guangdong Laboratory for Lingnan Modern Agriculture，Yunfu Guangdong 527400；收稿日期：20230721基金项目：“十四五”广东省农业科技创新十大主攻方向“揭榜挂帅”项目（NO.2022SDZG02）；广东省农业科学院协同创新中心项目（XTXM202202）；科技创新战略专项资金（高水平农科院建设）（202110TD，202122TD，R2020PYJC001，R2019YJYB3010，R2020PYJG013，R2020QD048，R2021PYQY007，R2023PYJG018）；广东省现代农业产业技术体系创新团队建设专项（2022KJ119）表示并列第一作者作者简介：林栩慧（1988年生），男，副研究员，研究方向：寄生生物学。Email：；朱易斌（1998年生），男，硕士研究生，研究方向：顶复门原虫分子生物学研究。Email:*通讯作者：廖申权（1981年生），女，研究员，研究方向：寄生虫代谢组学研究。Email：；孙铭飞（1978年生），男，研究员。研究方向：寄生虫入侵机制研究及靶向药物开发。Email：Guangdong Journal of Animal And Veterinary ScienceDOI:10.19978/ki.xmsy.2023.04.03广东畜牧兽医科技广东畜牧兽医科技2023年（第48卷）第4期试验研究 13试验研究不同温度对柔嫩艾美耳球虫卵囊活力的影响林栩慧，等鸡球虫病是一种由艾美耳球虫引起的寄生性原虫病12。据不完全统计，全球每年因鸡球虫病引起的经济损失高达30亿美元，我国每年因球虫引起的经济损失达35亿人民币，给全世界养鸡业造成了重大危害35。目前，鸡球虫病的防控主要通过药物防控和疫苗防控为主，在鸡球虫病的发生和流行中，温度和湿度具有重要的影响作用，甚至关系到疫苗免疫的成败67。鸡球虫病是鸡通过经口方式感染孢子化球虫卵囊而引起的疾病。由此可知，鸡球虫病的发生与环境中球虫卵囊的孢子化率以及孢子化球虫卵囊的活力状态有着直接的影响。本研究旨在探讨不同温度处理不同时间对鸡球虫卵囊活力的影响，以期为球虫环境消杀及活卵囊保存做出临床指导。1材料与方法1.1材料1.1.1试验仪器：恒温水浴锅、-80 冰箱、-40 冰箱、-20 冰箱、制冰机、光学显微镜、恒温水浴振荡器、低速大容量离心机、麦克马斯特计数板、计数器、血球计数板、试管。1.1.2试验试剂：饱和盐水、无球虫去离子水、2.5%重铬酸钾、液氮、PBS。1.1.3试验动物：1日龄818快大肉杂母鸡，购自温氏簕竹种鸡场，用55 高温过夜处理后的小鸡料进行饲喂。饲养笼具及水槽料槽均火焰消毒或沸水消毒处理。1.1.4试验虫株：柔嫩艾美耳球虫ETGD株，由广东省农业科学院动物卫生研究所寄生生物学实验室分离、保存。1.2方法1.2.1ETGD株的扩繁对实验室保存的ETGD株进行离心去除重铬酸钾保存液，用PBS进行混悬计数，在无球虫环境下经口饲喂12日龄无球虫感染雏鸡20只，每只感染1万个孢子化卵囊。感染7天后进行肠道和粪便中卵囊的回收，2.5%重铬酸钾保存。收集的未孢子化卵囊一部分放置 28 水域摇床中孢子化处理，一部分未孢子化卵囊计数为每毫升 10 万保存，备用。1.2.2不同温度处理不同时间对未孢子化卵囊的影响对刚复壮收集的未孢子化卵囊进行计数分组，每组添加10万卵囊液置于试管中，以不同温度（-80、-40、-20、0、4、10、28、40、50、60、70、100）不同时间（30 min、1 h、24 h、48 h、96 h）分别对ETGD株未孢子化卵囊进行处理，对不同温度处理不同时间后的卵囊放置28 水浴摇床进行孢子化，在24 h、48 h和96 h后进行光学显微镜镜检，观察孢子化情况（方案见表1）。各处理组依次取样点载玻片，盖上盖玻片进行ETGD株孢子化卵囊的形态学监测，每次随机计算100个卵囊得出孢子化卵囊数，每组重复计算3次取平均值，并计算出孢子化率。3.Qingcheng district animal epidemic prevention center，Qingyuan Guangdong 511500；4.Wens Livestock and Poultry Co.，Ltd.，Heyuan Guangdong 517000）Abstract：Temperature is an important factor affecting the sporulation and viability of avian coccidia oocysts.Inthis study，the effects of different temperatures on the sporulation of Eimeria tenella unsporulated oocysts and theviability of sporulated oocysts were investigated by monitoring the sporulation rate of avian coccidia oocysts，intestinallesions and oocyst production.The results showed that there was no significant change in the oocyst sporulation activitycompared to be treated at-80 for 30 min，and at-40，-20，0，4，10，28，40，50 for 30min or 1 h respectively，but the oocyst sporulation activity was inhibited after administrated at-80 for more than 1h，-40 or-20 for more than 48 h，and 60 for more than 30 min.The sporulated oocysts were killed byexposure to liquid nitrogen for 2 min，or at-80 or higher than 50 for more than 1 h，whereas sporulated oocystsremain viable at-20 for 1 to 12 h or at 50 for 30 min.This study provides data support for the storage conditionsof avian coccidia oocysts，and has certain research significance for the prevention and treatment of avian coccidiosis.Keywords：Eimeria tenella；Temperature；Vitality；Sporulation 14不同温度对柔嫩艾美耳球虫卵囊活力的影响林栩慧，等试验研究孢子化率=孢子化卵囊/（孢子化卵囊+未孢子化卵囊）*100%1.2.3不同温度处理不同时间对孢子化卵囊的影响对不同温度处理不同时间的孢子化卵囊进行攻虫动物试验，每个处理组感染 9 日龄 818 肉杂鸡5只，每只鸡攻虫10万个孢子化卵囊。感染后第5天观察血便情况，感染后第7天，统一杀鸡，剖检肠道，查看盲肠病变情况，同时收集感染后第57天的混合粪便进行克粪便卵囊计数（OPG）。观察各组鸡只感染球虫后第57天的临床症状，包括试验鸡的精神状态、食欲量、粪便情况、死亡情况。试验过程中若出现死鸡，及时剖检观察病变是否由球虫感染引起。若观察到死鸡盲肠出血肿大或出现干酪样坏死且盲肠内容物镜检出大量球虫卵囊，则判为球虫致死。感染后第 7 天宰杀鸡，参照 Johnson 和 Reid（1970）设计的病变记分法进行每只鸡的肠道病变记分，并换算成病变值8。1.2.3.1血便记分标准接种卵囊后第5天，按以下标准记分。分：100%粪便不带血；1分：1%25%粪便带血；2分：26%50%粪便带血；3分：51%75%粪便带血；4分：76%100%粪便带血。1.2.3.2肠道病变记分标准：（两侧盲肠病变不一致时，以严重的一侧为准）0分，无肉眼病变；1分，盲肠壁有很少量散在的瘀点，肠壁不增厚，内容物正常；2分，病变数量较多，盲肠内容物明显带血，盲肠壁稍增厚，内容物正常；3分，盲肠内有多量血液或有盲肠芯（血凝块或灰白色干酪样的香蕉型块状物），盲肠壁肥厚明显，盲肠中粪便含量少；4分，因充满大量血液或肠芯而盲肠肿大，肠芯中含有粪渣或不含，因球虫病死亡鸡只也记4分。病变值（040）=各试验组的平均病变记分（04）10。1.2.3.3用麦克马斯特计数法进行粪便卵囊计数，求出每组的克粪便卵囊数（OPG）操作方法：取2 g混匀后的粪便置于研钵中，先加入10 mL水，搅匀，再加入饱和盐水50 mL，混匀后立即吸取粪便液充满两个计数室，静置12 min，镜检计数两个计数室的卵囊数，卵囊OPG=100*两个计数室卵囊总和。2结果2.1不同温度处理不同时间对ETGD株未孢子化卵囊的影响对未孢子化ETGD株卵囊分组经不同温度处理不同时间后，放置28 水浴摇床孢子化24、48和 96 h，分别计算卵囊孢子化率。结果显示：-80 处理 1 h 以上组、-40 处理 24 h 以上组、-20 处理24 h以上组、60 处理0.5 h以上组、70 处理0.5 h以上组、100 处理0.5h以上组卵囊孢子化抑制率均达到100%；未孢子化卵囊在0、4、10 经过2448 h处理后均未出现孢子化现象，在处理 96 h 后部分组有孢子化现象，经过28 水浴处理后均恢复孢子化；-80 处理0.5 h组、28、40、50 处理组在0.5 h和1 h处理后，均保持孢子化活性能力（见表2，图1）。2.2不同温度处理不同时间对ETGD株孢子化卵囊的影响通过试验结果可知：孢子化卵囊经液氮处理2 min、-80 处理4 h以上、-20 处理1个月以及编号123456789101112处理温度（）-80-40-2004102840506070100处理时间（h）0.5/1/24/48/960.5/1/24/48/960.5/1/24/48/960.5/1/24/48/960.5/1/24/48/960.5/1/24/48/960.5/1/240.5/1/240.5/1/240.5/1/240.5/1/240.5/1/24处理前未孢子化卵囊量（万/mL）101010101010101010101010表1不同温度处理不同时间对未孢子化卵囊的影响实验分组 15编号123456789101112处理温度（）-80-40-2004102840506070100处理时间（h）0.512448960.512448960.512448960.512448960.512448960.512448960.51240.510.510.510.510.51处理后0 h孢子化率（%）00000000000000000000000032.67000054.330060000000000028 水浴24 h孢子化率（%）24000-395000-46.674600-42.335433.3340-5152.3334.6733-55.3336025-51.3359.336845.334755.675900000028 水浴48 h孢子化率（%）60.33000-45.334500-4549.6700-55.6755.335844.33-7372.678480-74.6760.6780.67-58.3371.337262.6751.6774.336800000028 水浴96 h孢子化率（%）68.670-69.6779.33-7875.67-65.3366.3364.67-75.3376.33-75.6773.33-67.6776.33-77.3375.6775.3377.67000000表2不同温度处理不同时间对ETGD株球虫卵囊孢子化率影响注：“-”表示未进行监测计数。试验研究不同温度对柔嫩艾美耳球虫卵囊活力的影响林栩慧，等 1660 以上处理30 min以上组均能100%灭活孢子化卵囊；孢子化卵囊经-20 处理1 h、4 h和12 h组、4 处理组、常温保存组以及50 处理30 min后卵囊均能保持一定活力，其中50 处理30 min组卵囊活力有明显下降（见表3）。3分析讨论本试验以研究最广泛的柔嫩艾美耳球虫为研究对象。鸡感染球虫后排出的球虫卵囊均为未孢子化卵囊，不具有感染能力。未孢子化卵囊只有在一定温度和湿度条件下完成孢子化才具有感染能力7。当孢子化卵囊被鸡吞食后，经过肌胃研磨破壁后，在胰蛋白酶和胆汁的作用下，孢子囊脱囊并释放出子孢子入侵鸡肠上皮细胞，子孢子经过一代和二代裂殖生殖引发鸡球虫病的发生8。所以，球虫卵囊在环境中孢子化的分布情况可直接影响鸡群是否爆发鸡球虫病。未孢子化卵囊在低温环境保存下孢子化活性下降或失去孢子化活性。研究结果表明：未孢子化卵囊经-80 处理1 h以上、-40 或-20 处理24h以上，卵囊均表现为无孢子化活性；但处理时间不够，球虫卵囊则依然保有孢子化活性，如-80 处理30 min，-40 或-20 处理1 h以内，0 处理24 h和48 h，后期水浴处理均可完成孢子化发育，此结果与王仲兵报道的-20 处理24 h、48 h和72 h后仍有孢子化活性的结果略有不同11。分析原因：-20 或-40 长时间保存可能是卵囊内含有的水分结冰将卵囊壁涨破，导致变形失活，从而丧失孢子化活性。未孢子化卵囊在4 或10 低温环境作用48 h后未发现孢子化，但持续放置到96 h，均发现有少量孢子化现象，说明低温可以抑制球虫孢子化率，但球虫卵囊仍保持有孢子化活性，此结果与谢明权报道的温度低于10 以下作注：A：低温处理组；B：中低温处理组；C：中高温处理组；D：高温处理组；图中Y轴1、2、3、4分别表示处理后0 h、处理后28 水浴24 h、处理后28 水浴48 h、处理后28 水浴96 h。图1不同温度时间处理下球虫卵囊孢子化率CDAB不同温度对柔嫩艾美耳球虫卵囊活力的影响林栩慧，等试验研究 17编号T1T2T3T4T5T6T7T8T9T10T11T12T13T14T15T16T17T18T19T20处理温度（）液氮-80-204225060708022处理时间（h）0.0331412720141272012120.510.510.510.51-死亡数率（%）00000000010 0010000000000病变值000001.42.21.202.82.40.600000000盲肠OPG（个/g）04080360152804740105000158401700048003400000000粪便OPG（个/g）0220000064000040000022400004960001600001550000000000血便记分00000120000000000000表3不同温度对孢子化卵囊活力影响用4天卵囊孢子化率为0的结论有所不同，分析原因可能为低温环境导致卵囊孢子化活性因子发生休眠效应，从而抑制卵囊的孢子化，当温度复苏到合适条件，孢子化活性因子可重新被启动12。同时，在40 或50 处理超过1 h，球虫卵囊仍然具有孢子化活性，这与吴家斌报道的40 是球虫卵囊孢子化的临界温度结论有区别13。温度超过60 处理30 min，球虫卵囊因散失活力，也失去孢子化能力，这个与Schneiders的体内研究实验结果吻合14。孢子化的球虫卵囊对温度较敏感。据马焕荣研究报道，冷冻处理会使卵囊破裂而失活，温度过高也会使卵囊代谢旺盛，营养消耗过快而有效期缩短，所以得出高温和冷冻都将杀死球虫疫苗，故球虫卵囊必须保存在 28 下，使用时所用稀释液应在 20 左右7。根据不同温度对球虫卵囊的消杀效果研究，可以得出，当环境消杀温度达到60 30 min以上，对孢子化卵囊均可达到良好的杀灭效果，这个与龚振兴报道的60 15 min，与谢明权报道的55 15 min处理数据相近12，15。同时，我们发现冷冻处理后，球虫卵囊并非出现全部失活，从动物实验结果可知：在-80 处理1 h以内或-20 环境处理12 h以内，处理后的孢子化球虫卵囊还是存在一定活性。有此可知，用-20 冷冻处理来杀灭球虫卵囊，如果处理时间不够，并不是一个有效的方法。不过在-80 环境或者液氮环境下，球虫卵囊可在短时间内失去活性，在-80 处理4 h小时或者液氮处理2 min均可使孢子化卵囊失去活力，这部分试验数据暂时未见有相关报道。4结论本研究探讨不同温度对柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊的孢子化作用以及对孢子化卵囊的活性影响。初步结论如下：未孢子化卵囊分别经过-80 处理 30 min，-40、-20、0、4、10、28、40、50 处理30 min或1 h后，孢子化能力均无显著变化；未孢子化卵囊分别经过-80 处理1 h以上、-40 或-20 处理48 h以试验研究不同温度对柔嫩艾美耳球虫卵囊活力的影响林栩慧，等 18上、60 处理30 min以上后卵囊均表现为无孢子化能力；孢子化卵囊经液氮处理2 min、-80 或高于50 条件处理超过 1 h，卵囊活力基本为 0，在-20 处理112 h或50 处理30 min卵囊仍表现有一定活力。本研究结果为鸡球虫卵囊保存条件提供数据支持，对防治鸡球虫病具有一定的研究意义。参考文献：1 GYORKE，POP A L，COZMA V.Prevalence and distributionof Eimeria species in broiler chicken farms of different capacitiesJ.Parasite，2013.20（50）：182 SHIRLEY M W，IVENS A L，GRUBER ARTHUR，et al.TheEimeria genome projects：a sequence of eventsJ.Trends inParasitology，2004.20（5）：199201.3 张思新，汤新明，李超，等.我国鸡球虫病疫苗研究进展 J.寄生虫与医学昆虫学报，2018.25（4）：254261.4 WILLIAMSRB，SHIRLEYMW，TENTERAM.Acompartmentalised model for the estimation of the cost ofcoccidiosis to the worlds chicken production industryJ.International Journal for Parasitology，1999.29（8）：12091229.5 BLAKE D P，TOMLEY F M.Securing poultry production fromthe everpresent Eimeria challenge J.Trends in Parasitology，2014.30（1）：1219.6 周平，王海龙，宋永杰，等.鸡球虫病药物防治现状及措施J.畜牧兽医科学，2020（15）：139140.7 马焕荣.环境因素与鸡球虫病的防治 J.河南畜牧兽医，2008（4）：1415.8 李国清，索勋.鸡球虫病学 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