菜用大豆有机酸的全基因组关联分析.pdf

华北农学报():收稿日期:基金项目:江苏省农业科技自主创新资金项目()江苏省重点研发计划(现代农业)重点项目()国家重点研发计划项目()江苏省林业科技创新与推广项目()作者简介:刘 慧()女山东泰安人硕士主要从事菜用大豆分子遗传研究通信作者:朱月林()男江苏苏州人教授博士博士生导师主要从事蔬菜作物栽培及生理技术研究陈华涛()男河南周口人研究员博士主要从事大豆分子育种技术及种质创新研究菜用大豆有机酸的全基因组关联分析刘 慧许文静杨 硕张 威张红梅刘晓庆朱月林陈华涛(.南京农业大学 园艺学院江苏 南京.江苏省农业科学院 经济作物研究所江苏 南京)摘要:为了研究菜用大豆有机酸合成机制并为菜用大豆的品质改良提供一定的理论依据以含有 份菜用大豆种质资源的自然群体为试验材料分别在 年采用 法测定该群体的酒石酸、苹果酸和柠檬酸含量并结合该群体的基因型数据进行全基因组关联分析鉴定与有机酸含量显著关联的 位点及候选基因 年供试群体酒石酸平均含量分别为./苹果酸平均含量分别为./柠檬酸平均含量分别为./相关性分析发现 份材料柠檬酸含量在 及 年 间呈显著正相关 同时苹果酸与柠檬酸间呈显著的正相关相关系数为.酒石酸与苹果酸、柠檬酸均呈显著正相关相关系数分别为.结果表明供试群体不同品种间存在较大差异具有丰富的遗传多样性筛选出 份具有较高有机酸含量的特异种质资源为菜用大豆有机酸品种改良育种提供优秀的材料 基于混合线性模型的 分析共检测到 个分别与酒石酸、苹果酸及柠檬酸含量显著相关的 位点同时根据基因功能注释信息鉴定到 个及 个分别与酒石酸、苹果酸含量显著相关的候选基因关键词:菜用大豆全基因组关联分析有机酸中图分类号:.文献标识码:文章编号:():./.(.):.()././././.期刘 慧等:菜用大豆有机酸的全基因组关联分析 .:菜用大豆(.).)又称毛豆、鲜食大豆是指在(鼓粒盛期)(初熟期)生育期间采青食用的大豆专用型品种 我国作为世界上最大的菜用大豆出口国虽然菜用大豆产业已得到快速的发展但有关菜用大豆食味品质的研究还有待进一步加强这制约了优质菜用大豆产业健康发展因此食味品质的相关研究已成为菜用大豆改良育种方向之一 鲜食风味是菜用大豆食味品质的关键因素其形成与有机酸有着密切的关联有机酸作为多种氨基酸生物合成的底物有利于籽粒中氨基酸的积累从而提高菜用大豆的鲜味 等的研究结果表明酒石酸、苹果酸和柠檬酸与涩味之间存在一定的联系并且产生的酸味强度具有差异性 因此不同种类的有机酸有其独特的风味特征 柠檬酸产生酸感快且酸度高于苹果酸但后味时间短酒石酸略有涩感酸味爽口苹果酸酸味爽口微有涩苦呈味时间长食用适量可给人清爽之感其他有机酸如奎宁酸则主要产生苦味 有机酸不仅能影响菜用大豆的苦味、涩味、酸味还能通过掩盖糖的味道来影响甜味 等的研究发现柠檬酸可以掩盖味觉细胞对于果糖和蔗糖的感知而毛岳忠研究发现苹果酸能增强味觉细胞对于蔗糖的感知 菜用大豆籽粒中有机酸的种类、含量及其构成比例是菜用大豆鲜食风味形成的重要基础因此检测菜用大豆的有机酸成分分布研究有机酸合成机制对于菜用大豆的品质改良具有重要的实际意义数量性状的研究对于农作物的遗传改良具有重要的实际意义在不同的植物中已报道了许多与有机酸含量相关的 等研究表明苹果果实中可滴定酸含量的变化几乎完全可以由 号连锁群上的 个主效 位点决定分别能够解释后代中酸度表型变异的 其中位于第 连锁群上的主效基因位置与 等报道的结果相一致 菜用大豆中的酸含量属于多个基因协同控制的数量性状但截至目前有关菜用大豆酸含量调控机理的研究相对滞后与菜用大豆有机酸含量相关的 及候选基因有待发掘 与传统的连锁定位方法相比全基因组关联分析法()节省了构建群体的时间能够对不同种质进行遗传结构分析提高 定位的精准性已经成为快速有效的发掘植物数量性状基因的重要手段 本研究以含有 份菜用大豆种质资源的自然群体为试验材料分别在 年通过高效液相色谱法()测定酒石酸、苹果酸和柠檬酸含量结合 鉴定与有机酸显著关联的 位点并进一步挖掘相应的候选基因旨在初步解析菜用大豆有机酸含量的遗传学基础为调控菜用大豆有机酸含量的分子机制研究提供理论基础 材料和方法.试验材料 份菜用大豆种质资源包括 份栽培种及 份地方种均由江苏省农业科学院经济作物研究所大豆课题组提供 分别于 年 月和 年 月种植于江苏省农业科学院南京市六合基地试验田()田间试验采用随机区组试验设计 次重复 每份材料重复种植 垄每垄播种 穴每穴 株苗垄长为.垄间距 穴距 田间管理按照当地常规方法进行.仪器与试剂植 物 组 织 研 磨 仪 高 效 液 相 色 谱 仪 色谱柱超声波振荡仪可见分光光度(日本岛津)超纯水机 型万分之一天平酸度计、离心机、水浴锅、烘箱及其他实验室常用设备甲醇(色谱纯)磷酸(质量分数.)苹果酸、酒石酸、柠檬酸(色谱级纯分析标准品)以上试剂均购自上海阿拉丁生物科技有限公司.菜用大豆有机酸检测.色谱条件 色谱柱:柱(粒径 柱长 .)流动相:甲醇.磷酸水溶液(.)梯度洗脱流速./检测波长 色谱柱温度 进样量体积 流动相洗脱条件见表 华 北 农 学 报 卷表 流动相洗脱条件.时间/甲醇/.磷酸水溶液/.标准液的配制 精密称取酒石酸、苹果酸各 柠檬酸 (精确至.)用流动相溶解并定容至 棕色容量瓶中 配制成酒石酸、苹果酸、柠檬酸标准品储备液质量浓度分别为 /.绘制标准曲线以.中的标准品储备液为母液共配制 种不同浓度梯度混标溶液 其中苹果酸和酒石酸浓度分别为 /柠檬酸浓度分别为 /以上溶液均经.微孔滤膜过滤后按照.的色谱检测条件利用高效液相色谱仪分析后以浓度(/)对色谱峰峰面积 绘制标准曲线并计算回归方程.有机酸提取方法根据盖钧镒等的报道菜用大豆最适宜的采收期为 期因此本试验选择 期(鼓粒盛期)即鲜荚翠绿籽粒饱满时进行取样设置 次生物学重复 将收取的鲜荚放入烘箱先 杀青 然后以 烘干至恒质量取出干籽粒放入植物组织研磨仪中()研磨至粉末备用 菜用大豆干籽粒粉末过.筛称取粉末 (精确至.)置于 量瓶中加入 蒸馏水约 下超声提 冷却至室温定容混匀 在 /下离心 取上清液 经.滤膜过滤超声脱气后供分析用.分析菜用大豆有机酸按照.的色谱检测条件从同一菜用大豆样品中平行取 份进行重复性试验根据标品绘制的标准曲线分析计算菜用大豆样品中各有机酸组分的质量浓度取 次进样测得的平均值作为菜用大豆有机酸组分最终的检测结果.数据处理各有机酸含量数据采用 计算平均值、标准差及变异系数应用(.)软件分别对酒石酸、苹果酸和柠檬酸含量进行相关性分析.全基因组关联分析本研究中用于全基因组关联分析的自然群体 标记来自前期的重测序工作共 个该群体的连锁不平衡衰减区间为 具体群体结构分析见江苏省农业科学院豆类作物研究室的研究报道采用基于群体结构()亲缘关系()的混合线性模型()进行全基因组关联分析以控制假阳性关联位点 全基因组关联分析采用基于 软件的 算法包进行计算设定().作为显著阈值当关联到的 阈值.时则被认为是显著关联位点.候选基因分析全基因组关联分析得到 个不同的环境下(年)检测到的显著 位点后挑选出其上下游 区间范围内所有的基因 参照在线数据库 网站(:/./.)中的大豆基因组注释信息确定目标性状的候选基因 结果与分析.色谱分析在.的色谱检测条件下采用 法分离并检测有机酸标准品和菜用大豆籽粒样品中的酒石酸、苹果酸和柠檬酸可以清晰地将 种有机酸分离出来且峰型良好洗脱顺序分别为酒石酸、苹果酸、柠檬酸平均保留时间分别为.(图).酒石酸.苹果酸.柠檬酸.图 菜用大豆 种有机酸组分标准液的 图谱.菜用大豆 种有机酸组分线性回归方程分别将不同浓度梯度的 种有机酸的混合标准溶液经高效液相色谱仪分析后以质量浓度为横坐标()峰面积为纵坐标()进行线性回归分析 计算得到酒石酸、苹果酸和柠檬酸标准品的线性回归方程(表)种有机酸标准品的峰面积和质量浓度的相关系数为.在设定的浓度 期刘 慧等:菜用大豆有机酸的全基因组关联分析 范围内呈现良好的线性关系根据信噪比确定的定量限()为./表 菜用大豆 种有机酸组分线性回归方程.有机酸 回归方程 相关系数()定量限/(/)酒石酸 .苹果酸 .柠檬酸 .表型分析菜用大豆 种有机酸含量的描述性统计分析(表)显示 年供试群体的酒石酸含量分别为././平均含量分别为./苹果酸含量分别为././平均含量分别为./柠檬酸含量分别为././平均含量分别为./上述结果均表明供试群体有机酸含量差异较大种质资源遗传变异丰富为特异种质的筛选提供了有利条件 年菜用大豆酒石酸、苹果酸和柠檬酸变异系数分别为.年 种有 机 酸 变 异 系 数 分 别 为.且 种有机酸组分中柠檬酸变异系数最低 遗传变异系数能够体现各性状的变异丰富度一般来说当变异系数大于 时可以认为种质间差异较大且变异系数越大表明该性状的变异潜力越丰富 中 种有机酸的变异系数均大于反映出供试群体不同品种间有机酸各组分存在丰富的变异这些遗传变异的存在可为菜用大豆食味品质的改良提供广泛的遗传学基础表 菜用大豆 种有机酸含量的描述性统计分析.性状环境最小值/(/)最大值/(/)均值/(/)中位数极差标准差变异系数/酒石酸.苹果酸.柠檬酸.相关性分析本研究对 份材料酒石酸、苹果酸、柠檬酸含量在 年 间进行相关性分析结果表明 份材料柠檬酸含量在 年 间呈显著正相关相关系数为.(表)同时基于供试群体 种有机酸 表型数据的平均值对不同有机酸组分含量进行相关性分析 结果发现酒石酸含量与苹果酸、柠檬酸含量间均存在显著正相关相关系数分别为.苹果酸含量与柠檬酸含量也有着显著的正相关相关系数为.(表)表 份材料酒石酸、苹果酸、柠檬酸含量在 年 的相关系数.年份酒石酸 苹果酸 柠檬酸/.表 菜用大豆 种有机酸组分相关性分析.有机酸 酒石酸 苹果酸 柠檬酸 酒石酸 .苹果酸 .柠檬酸 .注:.的水平相关性显著:.菜用大豆 种有机酸组分含量特异种质筛选基于供试群体 种有机酸含量分别对每种有机酸筛选出 份高含量的特异种质 将 份菜用大豆种质资源按照酒石酸含量由高到低排序并将位于前 的品种划分为高酒石酸含量组()在 年的检测中均属于 组的种质为阜 和桂春豆(表)同理将供试群体按照苹果酸含量由高到低排序并将前 的品种划分为高苹果酸含量组(华 北 农 学 报 卷 )中均属于 组的种质包括华春 号和邯(表)将供试群体按照柠檬酸含量由高到低排序前 的品种被划分为高柠檬酸含量组()中均属于 组的种质有灌豆 号和新沂大紫花(表)以上筛选到的种质进一步丰富了我国菜用大豆有机酸含量特异种质资源表 的检测中均筛选到的高酒石酸含量的特异种质./品种酒石酸含量 阜 .桂春豆 .表 的检测中均筛选到的高苹果酸含量的特异种质./品种苹果酸含量 华春 号 .邯 .表 的检测中均筛选到的高柠檬酸含量的特异种质./品种柠檬酸含量 灌豆 号 .新沂大紫花.菜用大豆酒石酸、苹果酸和柠檬酸含量 分析为了深入研究菜用大豆有机酸含量的遗传机制利用 模型对 年的酒石酸、苹果酸和柠檬酸含量表型值进行 分析(图)设定显著阈值为 ().如表 所示 年检测到与酒石酸显著关联的 位点 个每个 解释了.的表型变异 年检测到与酒石酸显著关联的 位点 个每个 解释了.的表型变异 年检测到与苹果酸显著关联的 位点 个每个 解释了.的表型变异 年检测到与苹果酸显著关联的 位点 个每个 解释了.的表型变异在 年并没有检测到与柠檬酸显著关联的位点、和 分别是酒石酸、苹果酸和柠檬酸的 结果 图 同 .图 年菜用大豆 种有机酸 分析曼哈顿图和 图.期刘 慧等:菜用大豆有机酸的全基因组关联分析 年检测到与柠檬酸显著关联的 位点 个分别位于 号染色体上单个 的表型变异解释率为.上述结果表明菜用大豆籽粒中有机酸含量是由多基因控制的图 年菜用大豆 种有机酸 分析曼哈顿图和 图.表 种有机酸组分显著相关 分布.年份有机酸组分 染色体 数目 极显著 ()极大值()表型变异/酒石酸.苹果酸.华 北 农 学 报 卷表(续)年份有机酸组分 染色体 数目 极显著 ()极大值()表型变异/.酒石酸.苹果酸.柠檬酸.菜用大豆 种有机酸组分相关候选基因挖掘为了研究显著关联的 位点等位变异的表型效应分别对 年中酒石酸、苹果酸和柠檬酸检测到的阈值最高的显著 位点进行单倍型分析发现 碱基变化为 至 携有 的菜用大豆种质的酒石酸平均含量为./显著低于基因型 的菜用大豆种质的./(图)的等位变异为/携有 的菜用大豆种质的苹果酸平均含量为./显著低于基因型 的菜用大豆种质的./(图)的等位变异为/携有 的菜用大豆种质的酒石酸平均含量要显著低于携有 的菜用大豆种质的酒石酸平均含量(图)和 的等位变异均为/携有 的菜用大豆种质的苹果酸平均含量要显著低于携有 的菜用大豆种质而携有 的菜用大豆种质的柠檬酸平均含量显著高于携有 的菜用大豆种质(图、)同一图中不同小写字母表示在.水平下差异显著 .图 菜用大豆自然群体酒石酸、苹果酸和柠檬酸显著关联 单倍型分析.在检测到的与 种有机酸显著关联().)的 位点上下游 范围内进行候选基因的筛选及功能预测 参照大豆参考基因组的基因功能注释信息鉴定到 个与有机酸含量显著相关的候选 期刘 慧等:菜用大豆有机酸的全基因组关联分析 基因(表)这些基因可能参与菜用大豆籽粒中有机酸的调控和积累作为重要候选基因进一步分析 共挖掘到 个与酒石酸含量显著相关的候选基因其中定位于.上的基因.和.分别编码延胡索酸酶()和延胡索酸酶()定位于.上的基因.编码结节蛋白/样转运蛋白家族蛋白 此外挖掘到 个与苹果酸含量显著相关的候选基因其中定位于.上的基因.编码铝激活苹果酸转运蛋白()定位于.上 的 基 因.和.分别编码 糖基转移酶()和 (/)结构域蛋白定位于.上的基因.和.分别编码真核天冬氨酸蛋白酶家族蛋白和泛素蛋白连接酶()表 菜用大豆有机酸候选基因.有机酸 基因 染色体拟南芥同源基因.功能注释酒石酸.延胡索酸酶 .延胡索酸酶.结节蛋白/样转运蛋白家族蛋白苹果酸.铝激活苹果酸转运蛋白 .糖基转移酶.(/)结构域蛋白.真核天冬氨酸蛋白酶家族蛋白.泛素蛋白连接酶 结论与讨论有机酸作为菜用大豆中重要的风味物质对菜用大豆风味的形成具有显著的影响 目前有机酸含量的检测通常采用酸碱滴定法、离子色谱法、气相色谱法和高效液相色谱法等 其中高效液相色谱法可同时定量测定多种有机酸且操作简便、准确度高、稳定性好因此被越来越多的利用于有机酸快速检测领域 本研究对 份菜用大豆种质资源进行有机酸含量测定 年供试群体酒石酸含量分别为././平均含量分别为./年菜用大豆自然群体苹果酸含量分别为././平均含量分别为./年菜用大豆自然群体柠檬酸含量分别为././平均含量分别为./年菜用大豆籽粒中 种有机酸平均含量最高的是柠檬酸其次是苹果酸这与 等 等及张玉梅等的研究结果一致 中 种有机酸变异系数均大于 变异分析结果表明供试菜用大豆种质资源遗传多样性丰富有机酸含量存在非常广泛的表型变异具有很大的遗传改良潜力 在此基础上筛选出 份高有机酸含量的特异种质资源其中在 的检测中均属于高酒石酸含量组的种质为阜 和桂春豆 中均属于高苹果酸含量组的种质为华春 号和邯 中均属于高柠檬酸含量组的种质为灌豆 号和新沂大紫花以上鉴定到的种质为菜用大豆有机酸品种改良育种提供优秀的材料基于 模型的全基因组关联分析 中共检测到了 个与酒石酸显著相关的 个与苹果酸显著相关的 以及 个与柠檬酸显著相关的 但在 中 种有机酸均未鉴定到共同显著关联位点这可能是因为有机酸是典型的数量性状由多基因控制含量极易受环境条件等因素的影响因此即便使用相同的自然群体在不同环境条件下检测到一系列不同的关联位点的情况也是存在的 此外 等在菜用大豆的籽粒中共鉴定出 种有机酸其中含量最高的 种有机酸分别为柠檬酸、丁二酸、富马酸、苹果酸和草酰乙酸本研究仅测定了酒石酸、苹果酸和柠檬酸这 种有机酸而含量较高的丁二酸、富马酸还未进行研究如果丁二酸和富马酸在年份之间有很大的变动势必会引起其他有机酸的变化从而会导致共定位的难度增大 因此后续研究的重点一方面可以增加研究有机酸的种类另一方面通过多年多点的不同环境试验对菜用大豆自然群体有机酸含量进行检测以期获得更加可靠的显著关联 位点使有机酸遗传标记的开发和候选基因的发掘更加精确 以显著关联的 位点上下游 范围内的基因为候选 华 北 农 学 报 卷基因根据基因功能注释信息共鉴定到 个与酒石酸含量显著相关的候选基因及 个与苹果酸含量显著相关的候选基因 其中.在拟南芥中的同源基因为 编码铝激活苹果酸转运蛋白 在不同物种中均证实了 家族基因能介导植物中苹果酸的转运且参与果实中的苹果酸含量的调控在果实酸化过程中发挥着重要作用 然而对于该家族基因在菜用大豆中的功能及其调控机制尚不清楚 前人研究表明拟南芥中的 调控苹果酸的运输并且参与调节气孔运动由此推测菜用大豆中的.基因可能与其具有相似的功能与菜用大豆中苹果酸的含量具有相关性但其调控机理还需进一步研究 综上所述本试验结果可以为今后研究菜用大豆有机酸的基因位点提供参考依据同时为候选基因的功能研究奠定基础进而为菜用大豆育种提供参考借鉴参考文献:.(.).).():.:./.():.:./.():.:./.:.:./.:.():.:./.毛岳忠.甜酸味觉交互响应的量化研究和传感器组合研制.杭州:浙江工商大学.:./.:.(.).():.:./.(.).(/):.:./.():.:./.():.:./.盖钧镒 王明军 陈长之.中国毛豆生产的历史渊源与发展.大豆科学():.:./.():.():.:./.:.():.:./.(.).:.:./.张玉梅 胡润芳 林秀美 邓红枚 蓝新隆 林国强.鲜食大豆籽粒代谢物分析.耕作与栽培():.:./.():.():.:./.():.:./.:.:./.():.:./.:():.:./.