鸡β-防御素AvBD-5真核载体构建及免疫活性的研究.doc

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编码：

第十一届“挑战杯”广东大学生课外学术科技作品竞赛

作品申报书

作品名称：鸡β-防御素AvBD-5真核载体构建及
免疫活性的研究

学校全称： 华南农业大学

申报者姓名
（集体名称）： 张树嘉 林欣欣 王 柳

类别：
■自然科学类学术论文
□哲学社会科学类社会调查报告和学术论文
□科技发明制作A类
□科技发明制作B类

说 明

1．申报者应在认真阅读此说明各项内容后按要求详细填写。
2．申报者在填写申报作品情况时只需根据个人项目或集体项目填写A1或A2表，根据作品类别（自然科学类学术论文、哲学社会科学类社会调查报告和学术论文、科技发明制作）分别填写B1、B2或B3表。所有申报者可根据情况填写C表。
3．表内项目填写时一律用钢笔或打印，字迹要端正、清楚，此申报书可复制。
4．序号、编码由第十一届“挑战杯”广东大学生课外学术科技作品竞赛组委会填写。
5．学术论文、社会调查报告及所附的有关材料必须是中文（若是外文，请附中文本），请以4号楷体打印在A4纸上（文章版面尺寸14.5×22cm），附于申报书后，论文不超8000字，调查报告不超15000字。
6．作品申报书须按要求由各校竞赛组织协调机构统一寄送。
7．其他参赛事宜请向本校竞赛组织协调机构咨询。

A2申报者情况（集体项目）
说明：1．必须由申报者本人按要求填写；2．申报者代表必须是作者中学历最高者，其余作者按学历高低排列；3．本表中的学籍管理部门签章视为申报者情况的确认。

申
报
者
代
表
情
况
姓名
张树嘉
性别
男
出生年月
1988.08
学校
华南农业大学
系别、专业、年级
生命科学学院生物技术 07级
学历
本科
学制
4年制
入学时间
2007.09
作品名称
鸡β-防御素AvBD-5真核载体构建及免疫活性的研究
毕业论文题目
猪流行性腹泻病毒PEDV主要抗原位点的克隆和表达
通讯地址
广州市天河区华南农业大学生命科学学院
邮政编码
510642
办公电话

常住地
通讯地址
广州市天河区华南农业大学启林南区32-407
邮政编码
510642
住宅电话
13631482710
其他作者情况
姓 名
性别
年龄
学历
所在单位
林欣欣
男
23
本科
华南农业大学生命科学学院
王柳
女
23
本科
华南农业大学生命科学学院
资格认定
学校学籍管理部门意见
以上作者是否为2011年7月1日前正式注册在校的全日制非成人教育、非在职的高等学校中国籍专科生、本科生、硕士研究生或博士研究生。
□是□否 （部门签章）
年 月 日
院、系负责人
或导师意见
本作品是否为课外学术科技或社会实践活动成果。
□是□否
负责人签名：
年 月 日

B1．申报作品情况（自然科学类学术论文）

说明：
1．必须由申报者本人填写；2．本部分中的科研管理部门签章视为对申报者所填内容的确认；3．作品分类请按作品的学术方向或所涉及的主要学科领域填写；4．硕士研究生、博士研究生作品不在此列。

作品全称

作
品
分
类
（ D ）A．机械与控制（包括机械、仪器仪表、自动化控制、工程、交通、建筑等）
B．信息技术（包括计算机、电信、通讯、电子等）
C．数理（包括数学、物理、地球与空间科学等）
D．生命科学（包括生物、农学、药学、医学、健
康、卫生、食品等）
E．能源化工（包括能源、材料、石油、化学、化
工、生态、环保等）
作品撰写的目的和基本思路

禽类是众多传染性病原体重要的携带者，如沙门氏菌、禽流感等。这些病原体不仅是造成禽类产品污染的原因之一，同时也严重威胁人类的健康。多年来，饲用抗生素被广泛地用于降低禽类发病率和维持健康。然而，长期使用抗生素，会导致抗生素在禽产品中残留及细菌耐药性的产生，并通过食物链威胁人类健康。在众多的抗生素替代剂中，抗菌肽由于其分布广泛、具有广谱抗菌活性、抗病毒和免疫增强等作用，并且对机体无毒害、无残留等，越来越受到关注。
本实验在已有研究的基础上，分别设计AvBD-5 DNA疫苗和SEp9 DNA疫苗，单独或联合的体液免疫、粘膜免疫方式导入到动物体内，初步测定AvBD-5 DNA疫苗和SEp9 DNA疫苗的免疫效应。以此研究预防禽肠炎沙门氏菌感染的DNA疫苗。

作品的科学性、先进性及独特之处
（1）首次从粤黄鸡舌头组织中成功克隆了鸡β-防御素AvBD5和AvBD5成熟肽基因。
（2）将双顺反子元件IRES插入真核表达载体pVAX1的多克隆位点中，构建双顺反子真核表达载体pVAX1-IRES，并将SEp9基因和AvBD5成熟肽基因插入双顺反子载体中，构建了共表达载体pVAX1-SEp9-AvBD5。该载体可同时独立的表达SEp9基因和AvBD5成熟肽基因。
（3）首次将AvBD5同时作为抗菌多肽和内源免疫物质研究其对肠炎沙门氏菌的免疫增强作用，探寻AvBD5作为一种新型免疫佐剂使用的可能性。
作品的实际应用价值和现实意义
本研究旨在发展和完善一种新型高效的预防家禽肠炎沙门氏菌感染的DNA药物，研究禽β-防御素AvBD-5的免疫活性，并探讨能使其作为一种新型免疫佐剂的可能性。以往研究发现，禽β-防御素AvBD-5对肠炎沙门氏菌有较强的杀菌作用，而且也是体内原有的一种免疫物质。本研究设计构建带有鸡β-防御素AvBD-5基因的DNA疫苗，将重组质粒导入模式动物小鼠体内，使小鼠获得对肠炎沙门氏菌的抗性，并研究DNA疫苗的保护效应和鸡β-防御素AvBD-5的免疫活性。为AvBD-5作为一种新型免疫佐剂，应用于DNA疫苗的研究与开发奠定了基础。

学

术

论

文

文

摘

AvBD是禽类先天内源免疫防御系统重要组成部分。本文构建了3个重组真核表达载体： pVAX1-AvBD5、pVAX1-SEp9和共表达载体pVAX1-SEp9-AvBD5。将3个重组质粒作为DNA疫苗免疫小鼠。用ELISA检测小鼠血清中特异性IgG抗体水平，实时荧光定量PCR法检测肠组织中MCP-1基因表达量差异；分离小鼠淋巴细胞，用流式细胞术分析T淋巴细胞亚群含量变化。在首免后第42天用肠炎沙门氏菌对小鼠攻毒，检测免疫保护效率。结果表明pVAX1-SEp9、pVAX1-SEp9-AvBD5均能在小鼠体内刺激免疫应答，产生抗SEp9的特异性抗体，pVAX1-SEp9-AvBD5组的IgG抗体OD450nm与对照组相比最高，达到0.33，同时能诱导肠组织产生MCP-1，引起T淋巴细胞亚群增殖，与对照相比，最高分别为63.17%、43.11%、20.57%。攻毒后pVAX1-SEp9组和pVAX1-SEp9-AvBD5组中小鼠新鲜粪便中SE菌落数与对照组相比明显下降，pVAX1-SEp9-AvBD5组在攻毒后的第4天，粪便中仅含SE 22.90CFU/g。本研究证明了鸡AvBD-5能有效刺激鸡免疫防御系统，增加机体特异性免疫应答能力，提高小鼠对SE感染的保护效率。
研究结果证明了鸡β-防御素AvBD-5能有效刺激鸡的免疫防御系统，增加机体特异性免疫应答的能力，提高了小鼠对肠炎沙门氏菌感染的保护效率，为AvBD-5作为一种新型免疫佐剂，应用于DNA疫苗的研究与开发奠定了基础。
作品在何时、何地、何种机构举行的会议上或报刊上发表及所获奖励
本作品于2011年3月获得华南农业大学“丁颖杯”课外学术科技作品竞赛二等奖。
鉴定结果

请提供对于理解、审查、评价所申报作品具有参考价值的现有技术及技术文献的检索目录

1、pVAX1-SEp9-AvBD5试验组流式细胞术结果示意图
2、Meade K G, Higgs R, Lloyd A T, et al. Differential antimicrobial peptide gene expression patterns during early chicken embryological development. Developmental and Comparative Immunology, 2009, (33): 516-524
3、Van Dijk A, Veldhuizen E J, Kalkhove S I, et al. The β-defensin gallinacin-6 is expressed in the chicken digestive tract and has antimicrobial activity against food-borne pathogens. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2007, 51(3): 912-922
4、Van Dijk A, Veldhuizen E J, Haagsman H P. Avian defensins. Veterinary Immunology and Immunopathology, 2008, 124 (1-2): 1-18
5、韩宗玺, 马得莹, 刘胜旺等. 重组鸡抗菌肽Gallinacin-9的原核表达及其抗菌活性的鉴定. 畜牧兽医学报. 2008, 39(10): 1426-1431
6、廖文艳, 马得莹, 韩宗玺等. 重组鸡β-防御素10蛋白的原核表达及其抗菌活性的测定. 中国预防医学报. 2008, 10(30): 765-769

申报材料清单（申报论文一篇，相关资料名称及数量）

《鸡β-防御素AvBD-5真核载体构建及免疫活性的研究》

随着抗生素耐药性的发现和人们对食品安全要求的提高，现代家禽饲养中迫切需要一种高效、无毒害、无残留的免疫促进剂和促生长剂替代抗生素，在提高家禽抗病力的同时，提高家禽的生产性能和禽产品的安全性，以促进养禽类的发展，降低养禽类对生态环境的破坏。防御素作为一种新型的生物活性肽，具有众多生物学活性， 特别是具有广谱超强的抗微生物作用，且作用机理特殊，使微生物不易产生抗性，越来越受到重视。根据人们目前对防御素生物活性的了解，可以借鉴基因工程技术，进一步研究防御素的抗菌活性和免疫活性，利用高效表达的原核或者真核表达系统大量表达防御素，或者构建防御素、病毒基因共表达载体，在将这些防御素应用到食品，医药等方面，充分发挥其抗菌活性和免疫活性。

科研管理
部门签章

年 月 日

C.当前国内外同类课题研究水平概述

说明：1.申报者可根据作品类别和情况填写；
2.填写此栏有助于评审。
禽类是众多传染性病原体重要的携带者，如沙门氏菌、禽流感等。这些病原体不仅是造成禽类产品污染的原因之一，同时也严重威胁人类的健康。人类病原体，如沙门氏菌和空肠弯曲杆菌，可以定居在鸡肠道而不出现临床症状，但这是引起人食物中毒的主要原因。禽类也是禽流感A病毒亚型（如H5N1）重要的携带者，禽流感对动物和人类健康造成巨大威胁，而且在亚洲有规律地爆发。因此，保证家禽健康，最大潜力地发挥其先天性免疫功能，对人类公共卫生，提高禽类的生产性能与禽产品安全性等都有重要意义。多年来，饲用抗生素被广泛地用于降低禽类发病率和维持健康。然而，长期使用抗生素，尤其是人类常用抗生素会导致抗生素在禽产品中残留及细菌耐药性的产生，并通过食物链威胁人类健康。因此，生产者们迫切需要一种既有效又有利于环保的新方法来控制禽类疾病。在众多的抗生素替代剂中，抗菌肽由于其分布广泛、具有广谱抗菌活性、抗病毒和免疫增强等作用，并且对机体无毒害、无残留等，越来越受到关注。
防御素(defensin)是一类富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽的大家族，其主要分子特征为含有由6个半胱氨酸残基组成的3个二硫键。防御素为参与机体最初防御活动的小分子多肽，是一类极为重要的内源性抗菌肽，它广泛存在于动植物及昆虫体内，具有较强的广谱抗菌活性，能有效地杀灭细菌、真菌、螺旋体和囊膜病毒，在机体的先天性免疫及获得性免疫中均发挥着重要的作用。
动物体内的防御素是动物内在防御系统最大的成员。防御素广泛表达于动物的组织细胞中，具有广谱的抗菌、抗病毒活性和非特异的细胞毒性作用。同时，动物防御素还可以调节体内适应性免疫及其他抗微生物免疫活性。目前，已从脊椎动物体内分离出许多防御素，根据二硫键位置的不同及核苷酸、保守氨基酸的结构序列可分为三大类，α-防御素、β-防御素和θ-防御素。目前在家禽中发现的防御素都属于β防御素。
鸡的染色体共编码14种β防御素，被称为AvBD1-14(chicken avian beta-defensin，AvBD)，它成簇地排列在第三号染色体3q3.5-q3.7上，长度为86kb。这些小肽含有59-104个氨基酸残基不等，它们都具有典型防御素的特征。鸡β防御素作为鸡的重要天然免疫屏障，广泛分布于鸡的肝脏、气管、肺脏、肾脏、睾丸、卵巢、血管、输卵管、子宫、脑、胸腺、发氏囊、肌肉、皮肤、骨髓、心脏等器官的组织中，在鸡的先天性免疫和获得性免疫中都具有重要的作用。
沙门氏菌是人和各种动物的传染性病原因子。肠炎沙门氏菌属于无宿主特异性而有侵害性的血清型，可由人传给动物也可由动物传给人，即所谓“人畜共患病原体”。肠炎沙门氏菌不仅能引起家禽发病死亡造成严重的经济损失，而且感染家禽的产品作为肠炎沙门氏菌的携带者，还严重危害人类健康。日、美等发达国家发生的食物中毒事件中40%-80%是由禽沙门氏菌引起的，其中主要病原为肠炎沙门氏菌，每年在美国由于食物传播沙门氏菌感染致死的超过600人，140万人染病，每年都要花费4.64亿到23亿美金用于治疗食物传播沙门氏菌感染。由肠炎沙门氏菌引起人的急性胃肠炎（食物中毒），在世界各国有增加的趋势，已成为国际公共卫生的一个重要课题。
鸡肠炎沙门氏菌感染所引起的发病和死亡一般发生在2周龄以内的雏鸡，肉鸡的发病率在2日龄以内为2%，6日龄为20%，死亡率为6%。病雏精神不振和食欲丧失，身体蜷缩，羽毛无光,肛门周围附着粪便。1周龄以内死亡率较高，但很少引起1月龄以上鸡的死亡。成年鸡对肠炎沙门氏菌感染的反应不同于雏鸡，感染后无明显的临床症状,产蛋量也没大的影响，呈隐性感染而不被人们重视。
肠炎沙门氏菌最主要来源于禽源性食物，主要是鸡蛋，蛋制品以及鸡肉。目前，国际上控制家禽沙门氏菌感染，除了采取严格的生物安全措施、加强饲养管理、卫生和消毒、种鸡群执行沙门氏菌净化外，还提倡用疫苗控制。肠炎沙门氏菌的感染循环是：已感染的母鸡生下被感染的蛋，从蛋中孵出被感染了的雏鸡，该雏鸡能终生保持感染。因此，使用疫苗对禽类进行免疫，同时监测这些措施的实施效果，是目前消除禽肉和鸡蛋中沙门氏菌的有效途径，可阻止产蛋鸡群感染肠炎沙门氏菌、阻止感染肠炎沙门氏菌的鸡进入产蛋鸡群，并使鸡蛋保持在最清洁的状态。
沙门菌属中除鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌外，大多数沙门菌周身有鞭毛。鞭毛的直径约5～20nm，长度比菌体长几倍，约5～20μm。鞭毛的化学组分主要是蛋白质，只含有少量的多糖或脂类。鞭毛蛋白占细胞蛋白质的2%。它是一种纤维弹性蛋白，与动物的肌动蛋白相似，具有收缩性，并有较好的抗原性。沙门菌具有复杂的抗原结构，一般分为菌体（O）抗原、鞭毛（H）抗原、表面（Vi/M）抗原三种。O、H抗原是其主要抗原，构成绝大部分沙门菌血清型鉴定的物质基础。H抗原能刺激机体产生高效价凝集抗体，并与相应的抗体呈絮状凝集。H抗原有两种：第一相：具有较高的特异性，又称特异相，用小写英文字母a，b，c…z表示；第二相：特异性较低，又称非特异相，用阿拉伯数字1，2，3，4…表示。编码沙门菌Ⅰ相和Ⅱ相鞭毛蛋白的基因分别为fliC或fljB，基因序列两端为N、C端保守区，中间为可变区。不同沙门菌株鞭毛基因的可变区中不同的碱基序列编码着不同氨基酸序列，可形成不同的鞭毛蛋白抗原表位，故中间可变区被称为抗原决定区。
利用商品化SE菌苗作为疫苗用来作为控制SE污染的一种方法。然而，SE菌苗存在的内毒素可能会对鸡产生潜在的危害。因此，一个更好的SE疫苗如SE亚单位疫苗被提出。已经报道了SE鞭毛抗原可以作为疫苗的巨大潜力。这主要是由于鞭毛抗原对淋巴细胞有促进有丝分裂的作用。SE鞭毛抗原由很多组分组成，最主要的成分是FliC抗原，而FliC抗原最主要的抗原位点是g.m.位点，也叫SEp9 (Salmonella Enteritidis FliC-specific 9KDa polypeptide,SEp9)。Yukiko Toyota-Hanatani等人（2009）用SEp9和弗氏完全佐剂联合接种鸡，然后口服攻毒SE，与对照相比，SEp9的SE菌数量显著降低，证明了SEp9抗原是一个有效的抗原，能有效的抑制SE在鸡肠道的定殖。Naoe Mizumoto等人（2003）将原核表达纯化的SEp9抗原联合ELISA法检测SE疫苗SEp9特异性抗体水平，结果在喷雾接种的幼鸡检测到高SEp9特异性抗体，显示了SEp9联合ELISA法可以对鸡群中SE疫苗的状态进行测定。Yukiko Toyota-Hanatani等人（2008）从组织学上证明了SEp9可以成为SE亚单位疫苗的候选抗原。注射SEp9后，鸡体内能产生特异性抗体，且在注射部位周围能引起血管淋巴细胞的积聚。他们的研究显示：SEp9作为一个亚单位疫苗，在鸡SE感染后的连续免疫反应和抗原递呈中都具有重要的作用。
D.推荐者情况及对作品的说明
说明：1．由推荐者本人填写；2．推荐者必须具有高级专业技术职称，并是与申报作品相同或相关领域的专家学者或专业技术人员（教研组 集体推荐亦可）；3．推荐者填写此部分，即视为同意推荐；4．推荐者所在单位签章仅被视为对推荐者身份的确认。

推荐者情况
姓 名
庄楚雄
性别
男
年龄
46
职称
研究员/ 博导
工作单位
华南农业大学生命科学学院
通讯地址
广州市天河区五山
邮政编码
510642
单位电话
020-85288399
住宅电话

推荐者所在
单位签章
庄楚雄老师是现任华南农业大学生命科学学院院长、遗传工程研究室研究员、博士生导师。广东省高等学校植物功能基因组与生物技术重点实验室副主任、“千百十工程”省级学术骨干。
（签章） 2011年3月20日
请对申报者申报情况
的真实性作出阐述

申报内容真实可信，已有一定的实验基础。
请对作品的意义、技术水平、适用范围及推广前景作出您的评价
该作品具备较好的前期基础，具有一定的科学研究价值。研究手段较先进，技术路线明确，实验条件具备。所获疫苗是一种广泛应用的基因转移载体，具有较好的示范和推广前景。值得进一步推广和应用
其它说明

推荐者情况
姓 名
邓诣群
性别
男
年龄
36
职称
教授/博导
工作单位
华南农业大学生命科学学院
通讯地址
广州市天河区五山
邮政编码
510642
单位电话
020-38604967
住宅电话

推荐者所在
单位签章
邓诣群老师是华南农业大学生命科学学院教授、博士生导师。 2009年受聘广东省“珠江学者”特聘教授、入选第五批（2008年）广东省高等学校“千百十工程”省级培养对象、入选2008年度教育部“新世纪优秀人才支持计划”、中国生物化学与分子生物学会农业分会理事等。

（签章） 2011年3月20日
请对申报者申报情况
的真实性作出阐述
该研究结果由张树嘉、林欣欣、王柳三位同学在导师的指导下完成的。

请对作品的意义、技术水平、适用范围及推广前景作出您的评价
该作品设计AvBD-5 DNA疫苗和SEp9 DNA疫苗，单独或联合的体液免疫、粘膜免疫方式导入到动物内，并测定 AvBD-5 DNA疫苗和SEp9 DNA疫苗的免疫效应。以此研究预防禽肠炎沙门氏菌感染的DNA疫苗。改研究结果通过中试后，可在实际生产应用，前景较广

其它说明

学校组织协调机构确认并盖章

（团委代章） 年 月 日
校主管领导或校主管部门确认盖章

年 月 日

E．大赛组织委员会秘书处资格和形式审查意见

组委会秘书处资格审查意见

审查人（签名）
年 月 日
组委会秘书处形式审查意见

审查人（签名）
年 月 日
组委会秘书处审查结果

□合格 □不合格
负责人（签名）
年 月 日

F．参赛作品打印处
鸡β-防御素AvBD-5真核载体构建
及免疫活性的研究

作者：张树嘉 林欣欣 王 柳
指导老师：赵亚华教授
作者单位：华南农业大学生命科学学院，广州，510642

摘 要
AvBD是禽类先天内源免疫防御系统重要组成部分。本文构建了3个重组真核表达载体： pVAX1-AvBD5、pVAX1-SEp9和共表达载体pVAX1-SEp9-AvBD5。将3个重组质粒作为DNA疫苗免疫小鼠，用ELISA检测小鼠血清中特异性IgG抗体水平，实时荧光定量PCR法检测肠组织中MCP-1基因表达量差异；分离小鼠淋巴细胞，用流式细胞术分析T淋巴细胞亚群含量变化。在首免后第42天用肠炎沙门氏菌对小鼠攻毒，检测免疫保护效率。结果表明pVAX1-SEp9、pVAX1-SEp9-AvBD5均能在小鼠体内刺激免疫应答，产生抗SEp9的特异性抗体，pVAX1-SEp9-AvBD5组的IgG抗体OD450nm与对照组相比最高，达到0.33，同时能诱导肠组织产生MCP-1，引起T淋巴细胞亚群增殖，与对照相比，最高分别为63.17%、43.11%、20.57%。攻毒后pVAX1-SEp9组和pVAX1-SEp9-AvBD组中小鼠新鲜粪便中SE菌落数与对照组相比明显下降，pVAX1-SEp9-AvBD5组在攻毒后的第4天，粪便中仅含SE 22.90CFU/g。本研究证明了鸡AvBD-5能有效刺激鸡免疫防御系统，增加机体特异性免疫应答能力，提高小鼠对SE感染的保护效率。
关键词：鸡β-防御素；免疫活性；DNA疫苗；真核载体；双顺反子

1.前言
抗微生物多肽（Antibacterial peptide, ABP）是生物机体受到外界微生物侵染时内在防御系统产生的一类防御性肽类活性物质，以对抗外源性病原体感染。抗菌肽富含阳离子氨基酸残基，具有广谱、高效的杀菌活性，被称为“第二防御体系”。
Harwig S等在1994年首次从鸡的嗜中性粒细胞中分离提取到3种相似抗菌肽，鸡β-防御素（Gallinacin），分别命名为Gal-1、Gal-1α和Gal-2。鸡基因组公布后，Xiao等通过基因组扫描的方法对鸡β-防御素基因组鉴定得出鸡全基因组共编码13种β-防御素，被命名为Gallinacin-1～Gallinacin-13。随后Lynn等（2007）又发现了鸡防御素14。随着对禽β-防御素研究的进展，鸡β-防御素被重新整理命名为AvBD-1～ AvBD-14。
14 种鸡β-防御素基因结构紧凑，大小只有86kb，位于第三号染色体的q3.5～q3.7上。鸡β-防御素基因含有4个外显子，但是AvBD-12最后两个外显子融合在一起，只有3个外显子，编码信号肽，前片段和成熟肽三部分（van Dijk et al, 2008）。鸡β-防御素成熟肽富含精氨酸，带正电，分子内有6个半胱氨酸残基，分别在分子内形成1-5、2-4、3-6三对二硫键，构成稳定的反相平行的3股β-片层结构C－X4-8－C－X3-5－C－X9-13－C－X4-7－C－C。鸡β-防御素的成熟肽都具有两亲性，有疏水的内部空间和带有正电荷的侧链，分子内的高度保守二硫键控制肽的构象变化。二硫键对防御素的抗菌活性无直接作用，但对防御素的功能，如抗蛋白水解和抗趋化作用有重要意义（Wu et al, 2003; Klüver et al, 2005; Selsted et al, 2005）。可通过复杂的机制抑制微生物生长或杀死微生物，如防御素抑菌的 “膜孔模型” （Lehrer et al, 1989; Hancock, 1997; Hancock et al, 1999; Oren et al, 1998; Tang et al, 1999; Ganz, 2003; Wang et al, 2003）。
鸡β-防御素是禽类先天具有的内源性免疫防御系统的重要组成部分，具有免疫调节作用，且有广谱抗菌活性，可抑制或者杀死多种革兰氏阳性和阴性菌、真菌。人工合成的鸡AvBD-9在浓度为3.7 μmol/L时对革兰氏阴性菌空肠弯曲菌显现出极强的抗菌活性，在浓度为1.9～3.7μmol/L和1.9 μmol/L时分别对革兰氏阳性菌产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌和酵母白色念珠菌、啤酒酵母有抑菌能力。但是AvBD-9对于鼠伤沙门氏菌没有杀菌作用（>30 μmol/L）（van Dijk et al, 2007）。人工合成的鸡AvBD-13有在高浓度（114μmol/L）时，才对李斯特菌有杀菌活性。当AvBD-13浓度达到14μmol/L和57μmol/L时分别对野生型和PhoP–（pho P基因，转录激活因子，调控鼠伤寒沙门氏菌毒力岛的表达 ）突变型鼠伤寒沙门氏菌有杀菌作用（Higgs et al, 2005）。体外实验发现，AvBD-5对肠炎沙门氏菌有杀菌活性，且作用活性强于AvBD-4和AvBD-6（Milona et al, 2007）。
肠炎沙门氏菌（SE）是引起家禽发病死亡最严重的病原之一。由于对感染动物无宿主特异性，所以常以污染的家禽产品为载体成为人类发生食物中毒的主要病原之一（Hardy, 2004）。商品化SE疫苗由于菌体的内毒素能对鸡产生潜在的危害。SE鞭毛抗原可以作为疫苗（Li et al, 2004）。SE鞭毛抗原由很多组分，最主要成分是FliC抗原，他的主要抗原位点是g.m.位点，又称SEp9（SE FliC-specific 9KDa polypeptid）（Toyota-Hanatani et al, 2009）。Toyota-Hanatani等（2009）研究证明SEp9抗原是一个有效的亚单位抗原，能有效抑制SE在鸡肠道定殖。本文设计构建带有AvBD-5基因的SEp9 DNA疫苗，将重组质粒导入小鼠体内，使小鼠获得对SE的抗性，并研究DNA疫苗的保护效应和AvBD-5的免疫活性。由于小鼠β-防御素和鸡β-防御素在分子结构和生理及免疫功能上都十分相似（宋斯伟, 2005）。因此选用小鼠作为试验动物，为研究SEp9 DNA疫苗和AvBD-5作为内源免疫物质的免疫作用免疫活性在家禽养殖业中的应用，将其作为一种高效无毒、无残留的免疫促进剂替代抗生素，提高家禽抗病力以及禽产品的安全性。

2 材料与方法
2.1 材料
原核基因及真核基因克隆的菌株E.coli DH5α、、真核基因表达载体pIRES-EGFP为本实验室保存，pCR2.1购于Invitrogen公司，载体真核表达载体pVAX1购于Invitrogen公司。PrimeScriptTM RT 2000 Kit、SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒、RT-PCR一步法试剂盒均购自TaKaRa，脂质体LipofectamineTM 2000购于Invitrogen公司。流式细胞术染料标记小鼠单克隆抗体试剂盒PE-Cy™5 Hamster Anti-Mouse CD3e、PE Rat Anti-Mouse CD4、FITC Rat Anti-Mouse CD8a均购于美国Becton-Dickinson公司。肠炎沙门氏菌购于中国兽医药品监察所（编号：cvcc 3374）。肠炎沙门氏菌疫苗购自德国罗曼动物保健有限公司。
2.2 引物设计和合成
根据NCBI数据库中鸡AvBD-5基因序列（登录号：AY621307）和SEfliC鞭毛基因（登录号：M84974）中SEp9基因序列，设计PCR引物。根据真核表达载体pIRES-EGFP载体图谱，设计特异性引物，PCR扩增IRES片段。
如表1，引物对AvBD5-P1和AvBD5-P2用于扩增AvBD-5全基因后，再用引物对AvBD5-P3和AvBD5- P4扩增AvBD-5成熟肽基因。SEp1和SEp2引物对用来扩增SEp9基因。本文中扩增的IRES序列来自载体pIRES-EGFP中666～1250位，共585bp。根据载体图谱，IRES起始序列中GC重复序列多，且起始部分是BamH I酶切位点，所以5，端引物IRES1选择pIRES-EGFP载体上IRES序列前620～644位的片段，再对PCR产物5，端进行BamH1酶切，3，端引物IRES2加上EcoR I 限制性酶切位点。

表1用于扩增AvBD-5、SEp9、IRES基因的引物
引物名称
引物序列
酶切位点
AvBD5-P1
ATGCAGATCCTGACTCTCCTCTTTGC

AvBD5-P2
TCAGGAATACCATCGGCTCCGGCAGCAGAA

AvBD5-P3
AGAATTCGCCACCATGCGAGGATTACCCCAG
EcoR I
AvBD5-P4
CCCTCGAGTCAGGAATACCATCGGCTC
Xh0 I
SEp1
CCCAAGCTTGCCACCATGGTTGATCTCTTTAAGACCAC’3
Hind Ⅲ
SEp2
CCGGGATCCTACTACGTTCACTACAGATGTATAAACATTT’3
BamHⅠ
IRES1
CTCAAGCTTCGAATTCTGCAGTCGAC
BamH1
IRES2
CG GAATTC TGTGGCCATATTATCATCGTG
EcoR I
2.3 载体构建
从3周龄粤黄鸡舌组织中提取总RNA，经RT-PCR扩增AvBD-5全序列。用引物对AvBD5-P3和AvBD5- P4，扩增得到AvBD-5成熟肽基因，插入pVAX1，构建重组载体pVAX1-AvBD5。
从pGH-SEp9中扩增得到SEp9基因，插入pVAX1，构建重组真核表达载体pVAX1-SEp9。
PCR扩增载体pIRES-EGFP得到产物IRES序列，插入已构建的重组真核表达载体pVAX1-SEp9后，AvBD-5成熟肽基因插入IRES序列下游，最终构建得到双顺反子真核载体pVAX1-SEp9-AvBD5。
2.4 DNA免疫
用去内毒素质粒抽提法获得高纯度无内毒素重组真核表达质粒，作为DNA疫苗免疫动物。
随机挑选健康BALB/C小鼠，3周龄（购自广州白云实验动物中心），随机分为6个试验组，如表2。采取后腿股四头肌注射，每次各质粒接种前24h，接种部位注射50μL0.5mg/mL盐酸布比卡因稀释液。将各重组质粒分别用灭菌0.01mol/L的PBS稀释至1μg/μL，每次注射100μL/只（王杨, 2005）。对照组同步注射PBS 100μL。所有实验组免疫3次，初免后第14天和第28天各加强免疫一次。
表2 动物免疫试验分组
组别
各组名称
小鼠数量（只）
剂量
免疫方式
第1组
PBS
30
100μL/只
选择3周龄小鼠进行免疫。首次免疫后的第14天和第28天，分别加强免疫。
第2组
pVAX1质粒
30
100μg/只
第3组
pVAX1-SEp9质粒
30
100μg/只
第4组
pVAX1-AvBD5
30
100μg/只
第5组
pVAX1-SEp9-AvBD5
30
100μg/只
第6组
SE疫苗
30
100μg/只
2.5 ELISA
分别于第7，14，21，28，35，42天，取眼眶取血法收集免疫后小鼠外周血，将血液放置2h后常温8000r/min离心10min，将上层血清移至另一Ep管中，ELISA检测特异性抗体IgG含量。
取96孔酶标板，用50ng/mL抗原SEp9蛋白每孔100μL包被，4℃过夜。次日除去孔内液体，洗板3次，每次3～5min。每孔加入封闭液100μL，4℃封闭过夜，次日弃去孔内液体，洗板同上。每孔加入100μL 1:20稀释的待测血清样品，37℃温育40min后，洗板同上。每孔加入100μL1:3500稀释的酶标抗体羊抗鼠IgG，37℃温育30min，洗板同上。每孔加入100μL的TMB，37℃遮光温育20min后每孔加入50μL的2moL/L的硫酸溶液，终止反应。在酶标仪上测定450nm光密度。
2.6 荧光定量PCR
根据Genebank数据库公布的小鼠β-actin-1和MCP-1基因，设计PCR引物，见表3。
收集第7，14，21，28，35，42天小鼠盲肠，提取肠组织中RNA，逆转录成cDNA，再根据Premix Ex TaqTM试剂盒，在荧光定量PCR 仪上，完成扩增。
表3 实时荧光定量PCR检测引物列表
序号
引物名称
序列（5’→3’）
1
β-actin1-1
GGCCAGGTCATCACTATTG
2
β-actin1-2
GTTGGCATAGAGGTCTTTACGG
3
MCP-1-1
ATACATTAAAAACCTGGATCGG
4
MCP-1-2
CTTCAGATTTACGGGTCAACTT
2.7 CD3+、CD4+、CD8+ T淋巴细胞的测定
采集第7，14，21，28，35，42天小鼠外周血，放入EDTA-K2抗凝管中，室温放置备用。采用三色标记法，用带染料PE-CY5、PE和FITC的抗体分别标记小鼠外周血T淋巴细胞表面的CD3+、CD4+、CD8+，设置通过流式细胞仪检测10 000个T淋巴细胞的亚群的水平。
2.8 攻毒保护效率
于末次免疫的后2周，进行Se攻毒处理，从各试验组随机捉取5只小鼠，以107CFU/只进行口服攻毒。攻毒后第2天到14天，每隔一天收集约2g新鲜粪便样品，置于4℃存放备用。
将不同时间留取的各样品各称取1g，悬浮于100μL的无菌PBS中，震荡混匀，再用PBS稀释10倍，取100μL接种到MLCB培养基上37℃培养24h。计算SE菌落数。

3.结果
3.1小鼠血清中特异性IgG抗体含量的检测
表3.1 不同时间的小鼠血清中IgG抗体的OD450nm吸光值
时间/组别
PBS
pVAX1
pVAX