DB15T+2855-2023马铃薯腐烂茎线虫的qPCR检测技术规程.docx

ICS65.020.01CCSB 3115内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准DB15/T 28552023马铃薯腐烂茎线虫的 qPCR 检测技术规程Code of practice for qPCR detection of ditylenchus destructor2023-01-28 发布2023-02-28 实施内蒙古自治区市场监督管理局发 布前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。本文件由内蒙古自治区农业标准化技术委员会（SAM/TC 20）归口。本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、中国农业大学、鄂尔多斯市农牧技术推广中心、内蒙古自治区农牧业技术推广中心、鄂托克前旗农牧业技术推广中心。本文件主要起草人：席先梅、张力群、霍宏丽、陈伟、苗春乐、融晓君、路奇、尤俊文、张晓霞、贺小勇、孔庆全、张冬梅、田晓燕。马铃薯腐烂茎线虫的 qPCR 检测技术规程1 范围本文件规定了利用qPCR检测技术对马铃薯腐烂茎线虫检测的试剂、仪器、样品处理、DNA提取、结果记录和样品保存等内容。本文件适用于土壤和马铃薯植物样品中腐烂茎线虫的qPCR检测。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法NY/T 1121.1 土壤检测 第1部分：土壤样品的采集、处理和储存3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。腐烂茎线虫 ditylenchus destructor腐烂茎线虫属于线虫门（Nematoda）、侧尾腺纲（Secernrntea）、垫刃目（Tylenchida）、粒科（Anguinidae）、茎线虫属（Ditylenchus），是危害马铃薯的重要病原线虫，可引起马铃薯叶片黄化、萎蔫、块茎干腐等症状，导致减产和品质降低。参见附录A。定 量 PCR quantitative PCR定量PCR技术（quantitative PCR，qPCR）是指在PCR反应体系中加入可与靶标DNA结合的荧光基团，依据荧光信号的强度对扩增产物进行实时监测，从而实现对初始靶标DNA模板量进行定量分析的技术。根据荧光信号来源可分为染料法和探针法。4 试剂和仪器试剂4.1.1 除特别规定外，所有实验用试剂均为分析纯，实验用水应符合 GB/T 6682 中相关规定。4.1.2 土壤提取缓冲液：1 M Tris-HCl，0.1 M EDTA，1.5 M NaCl，2% CTAB，0.1 M NaH2PO4/Na2HPO4， pH=8.0。4.1.3 CTAB 缓冲液：2% CTAB，1.4 M NaCl，0.1 M Tris-HCl，0.02 M EDTA，pH=8.0。E 缓冲液：10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH=8.0。4.1.4 TE 缓冲液：10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH=8.0。4.1.5 其他试剂包括Tris 饱和酚（pH=7.8），氯仿，异丙醇，无水乙醇，70%乙醇，20% SDS，rTaq DNA 聚合酶（5 U/L）及其缓冲液，25 mM 氯化镁（MgCl2）溶液，dNTPs 溶液（含 dATP, dTTP, dCTP, dGTP 各 2.5 mM），0.1%牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）。仪器超微量分光光度计，真空抽干仪，普通天平（感量0.01 g），高速离心机，4 冰箱，医用冰箱（-20 ），超低温冰箱（-80 ），制冰机，水浴锅，涡旋振荡仪，磁力搅拌器，高压灭菌锅，定量荧光PCR仪，金属浴，超净工作台，pH计，移液器（2 L，10 L，20 L，100 L，200 L，1000 L），土壤取样器（内径小于等于2 cm），研钵及研杵，土壤粉碎机。材料离心管（1.5 mL，2 mL，50 mL），PCR管（200 L），吸头（10 L，200 L，1000 L），量筒（50 mL）。5 样品处理及 DNA 提取 土壤样品采集、前处理及 DNA 提取5.1.1 土壤样品采集土壤样品采集方法采用NY/T 1121.1。取样时应使用内径小于等于2 cm的土壤取样器，取样深度为15 cm20 cm，“W”型取样15点20点，每份土样重量以500 g1000 g为宜。5.1.2 土壤样品前处理土壤样品采集后应及时进行干燥处理，可于室内环境自然风干，风干过程中避免阳光直晒和高温高湿环境。此外，土壤样品也可于干燥箱中（40 ）进行24 h烘干。去除土壤样品中的石块，沙砾，塑料薄膜等成分，保留植物组织，使用土壤粉碎机破碎干燥土壤样品。使用翻拌法对土壤样品进行混匀，即使用玻璃棒或塑料棒将土样平铺于玻璃板或纸张上，用铲子进行对角翻拌，重复20次以上。混匀后的土壤样品密封后于阴凉干燥处保存。每份样品处理完毕后需对土壤粉碎机，玻璃棒和玻璃板等仪器工具进行清洗和消毒以避免样品间交叉污染。5.1.3 土壤样品 DNA 提取取6.2.2中经前处理的土壤样品，按照四分法进行取样，将土样平铺于塑料薄膜或纸张上，呈四方形，根据对角线将土样分成四份，对角两份分别合并为一份，取其中一份继续进行四分法，直到获得所需数量为止。每份土样取3个重复，每个重复取10 g土样于50 mL离心管中，加入20 mL土壤提取缓冲液，涡旋震荡使之充分混匀，取1.2 mL土壤悬浮液于2 mL离心管中，加入300 L 20% SDS溶液，涡旋混匀后于65 水浴2 h，期间每10 min颠倒混匀一次，水浴完毕后12000 rpm离心5 min，取600 L上清于新的2 mL离心管中，加入600 L氯仿，震荡混匀，12000 rpm离心10 min，取550 L上清于新的2 mL离心管中， 加入550 L Tris饱和酚，震荡混匀，12000 rpm离心10 min，取500 L上清于新的2 mL离心管中，加入500 L氯仿，震荡混匀，12000 rpm离心10 min，取500 L上清于新的1.5 mL离心管中，加入350L异丙醇，颠倒混匀后12000 rpm离心15 min，去上清，加入1 mL 70%乙醇，颠倒混匀，12000 rpm离心5 min，去上清后真空抽干，溶解于100 LTE缓冲液中，进行纯度和浓度检测后于-20 保存备用。以实验室保存的土壤作为阳性对照。 植物样品处理及 DNA 提取5.2.1 植物样品采集与处理一块地取发病植物根茎基部及块茎，将样品保存于4 冰箱中。DNA提取时将马铃薯植株待测部位的组织切成1 cm见方小块，样品需现用现取。5.2.2 植物样品 DNA 提取每份植物样品设置3个重复，每个重复称取0.2 g待测植物样品，用液氮研磨成粉末状，并将粉末尽可能转移至2 mL离心管中，迅速加入1 mL CTAB缓冲液，涡旋混匀后于65 水浴1 h，期间每5 min颠倒混匀一次，水浴完毕后12000 rpm离心10 min，将上清移至新的2 mL离心管中，加入1 mL氯仿，震荡混匀，12000 rpm离心10 min，将上清移至新的2 mL离心管中，加入1 mL Tris饱和酚，震荡混匀，12000 rpm离心10 min，将上清移至新的2 mL离心管中，加入1 mL氯仿，震荡混匀，12000 rpm离心10 min，将上清移至新的2 mL离心管中，加入700 L异丙醇，颠倒混匀后12000 rpm离心15 min，去上清，加入1 mL 70%乙醇，颠倒混匀，12000 rpm离心5 min，去上清后真空抽干，溶解于100 LTE缓冲液中，进行纯度和浓度检测后于-20 保存备用。以实验室保存的植株作为阳性对照。5.3.1 qPCR 引物及探针用于腐烂茎线虫定量PCR的特异性引物核苷酸序列为：DdF: 5-CACGTCTGATTCAGGGTCGTAAATA-3； DdR: 5-AGAAACACGTGCTAGGCCAAAG-3。用于腐烂茎线虫定量PCR的TaqMan探针核苷酸序列为：DdP: 5-FAM-CAGCGGTCCGCACAGG -3-NFQ-MGB。引物扩增样品的ITS 区，扩增片段大小为96 bp。5.3.2 qPCR 反应体系及反应条件腐烂茎线虫qPCR反应体系如表1所示。反应条件为：95 5 min；95 15 s，60 30 s，共45个循环。反应体系中各试剂的量在保持浓度不变的前提下可随总体积进行调整，也可使用商业化qPCR试剂盒，按照说明书进行体系配制。 qPCR 检测表1 腐烂茎线虫 qPCR 反应体系（25L）组分体积rTaq (5 U/L)0.5 LMgCl2 (25 mM)3 L10PCR Buffer (Mg2+ free)2.5 LdNTPs (各2.5 mM)2 L引物DdF (10 M)1 L引物DdR (10 M)1 L探针DdP (10 M)1 L0.1% BSA5 LDNA模板5 LddH2O补至25 L5.3.3 样品检测根据6.4.3所述反应体系及反应条件，以6.2.3和6.3.2中所提取的土壤样品和植物样品DNA原液，10 倍稀释液或50倍稀释液为模板，进行qPCR检测，每个样品设置三个技术重复。阳性对照中添加腐烂茎线虫基因组DNA为模板，浓度为1 ng/L。阴性对照中添加ddH2O作为qPCR反应模板。5.3.4 质量控制正常阳性对照呈现典型的扩增曲线且Ct值小于30，正常阴性对照无扩增信号，则表明反应体系工作正常，否则应重新进行检测。5.3.5 结果判定最小检测浓度为每个反应体系5个靶标片段拷贝，在反应体系正常工作的前提下，根据Ct值进行结果判定：待测样品 DNA 原液或任一浓度稀释液检测结果 Ct35，判定该样品中检出腐烂茎线虫；待测样品 DNA 原液及所有稀释液检测结果均为 Ct40，判定该样品中未检出腐烂茎线虫；待测样品 DNA 原液及稀释液检测所得最小 Ct 值范围为 35Ct40 时，应重新进行检测，结果仍为 Ct40 并有明显的对数扩增期，则判定该样品中可检出腐烂茎线虫，否则该样品中未检出腐烂茎线虫。6 结果记录样品检测结果记录入马铃薯腐烂茎线虫样品检测结果记录表格（见表2）。表2 马铃薯茎线虫样品检测结果记录表格样品编号样品名称采样时间采样地点检测结果7 样品保存所有样品需至少妥善保存6个月。如马铃薯腐烂茎线虫检测结果为阳性，该样品至少保存1年，以备后续研究和生产需要。保存期满后，马铃薯腐烂茎线虫检测阳性的样本经高压蒸汽灭菌后丢弃。AA附 录 A（资料性）马铃薯腐烂茎线虫的主要形态特征、生物学特性及危害A.1 主要形态特征线虫虫体呈线型且细长，两端稍尖，尾部狭小圆锥形（见图A.1-B、E），线虫唇区低平，口针细小（见图A.1-A），长度约为10 m14 m，食道腺从背面略覆盖到肠的前端，雌虫阴门清晰稍突起， 后阴子宫囊较长，常延伸到肛阴距的3/4处（见图A.1-C）；雄虫交合刺略向腹面弯曲，基部膨大；交合伞从交合刺前端的水平处向后延伸至尾长的1/3处（见图A.1-B）。图A.1 马铃薯腐烂茎线虫形态特征A.2 生物学特性该线虫可在5 34 下发育繁殖，最适温度为20 27 。在27 28 下完成生活史需要18 d，20 24 时需要20 d26 d，在6 10 时需要68 d高温在35 以上即停止活动，42 干热处理24 h或49 温水浸泡10 min则全部死亡。腐烂茎线虫在-20 和-70 低温下，随着处理时间的延长，不同群体线虫的存活率都有所下降，在细沙和不同甘油浓度条件下，线虫群体在低温处理下均未查到活虫，而薯块是腐烂茎线虫在低温下抵御逆境的最好屏障。茎线虫喜湿耐干，在土壤中多集中在干湿交界10 cm15 cm土层内，遇到干旱，呈休眠状态，遇雨即恢复活动，浸在水中半个月，茎线虫并不完全死亡。在15 20 ，相对湿度90%100%条件下危害最重，相对湿度低于40%线虫不能存活。该线虫不形成抗性休眠体，不耐干燥，以卵越冬。线虫存活的最适pH值为6.2。不同地理位置、不同环境条件下，该线虫耐盐性有差异，海边盐滩附近的线虫耐盐性明显高于内陆地区，在NaCl溶液中，其死亡率只有21 %。茎线虫病发病规律为：春薯重于夏薯，直栽重于苗栽，连作重于轮作，旱薄地重于肥水地，阴坡重于阳坡，丘陵旱地和沙质壤土发病最严重。A.3 危害受害薯块表皮皱缩开裂，变暗褐色或黑色，并伴有其他病菌的复合侵染，后期质量变轻。切开薯块内部，受侵染部位变色呈海绵状，并伴有点状空隙，严重时内部组织呈现褐白相间的糠腐症状。见图A.2。图A.2 马铃薯腐烂茎线虫危害症状