分子生物学-第七章 基因的表达与调控.pdf

issssi分子生物学南京农正大学生命科学孽皖原核基因表达调控模式ojiaxnB(fepBig:v 丁丁就电昭0鲍施肺陋硼脆二-一决问日即旃1侬ISW跑=话时踞破带画颐&侬 闹商幽2010-10-312南京农业大学生命科学学院絮七章基I】的表达与调控（上）自然选择倾向于保留高效率的生命过程。原核生物和单细胞真核生物直接暴露在变幻莫 测的环境中，食物供应无保障，只有根据环境条件 的改变合成各种不同的蛋白质，使代谢过程适应环 境的变化，才能维持自身的生存和繁衍。因此，原 核细胞都有一套准确地调节基因表达和蛋白质合成 的机制。_72010-10-313南京农业大学生命科学学院】的表达与调控(上)每个大肠杆菌细胞有约15 000个核糖体，50种核糖体蛋 白、糖酵解体系的酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶等都是代 谢过程中必需的，其合成速率不受环境变化或代谢状态的影 响，这一类蛋白质被称为永久型(constitutive)合成的蛋 白质。另一类则被称为适应型或调节型(adaptive or regulated),因为这类蛋白质的合成速率明显地受环境的 影响而改变。如大肠杆菌细胞中一般只有15个即半乳糖首 酶，但若将细胞培养在只含乳糖的培养基中，每细胞中这个 酶的量可高达几万个分子。2010-10-314南京农业大学生命科学学院】的表达与调控（上）细菌中所利用的大多数基本调控机制一般执行如下 规律：一个体系在需要时被打开，不需要时被关闭。这 种“开关”（on-off）活性是通过调节转录来建立的,也就是说mRNA的合成是可以被调节的。实际上，当我们说一个系统处于“off”状态时，也可能有本底 水平的基因表达，常常是每世代每个细胞只合成1或2 个mRNA分子和极少量的蛋白质分子。为了方便，我 们常常使用“off”这一术语，但必须明白所谓“关”实际的意思是基因表达量特别低，很难甚至无法检测。2010-10-315南京农业大学生命科学学院】的表达与调控（上）:内容:1.原核基因表达调控总论2.乳糖操纵子与负控诱导系统3.色氨酸操纵子与负控阻遏系统4.其他操纵子5.转录水平上其它调控6.转录后调控,_2010-10-316南京农业大学生命科学学院厂产经一节原核基因表达调控总论 h随着生物个体的发育，DNA分子能有序地将其 所承载的遗传信息，通过密码子反密码子系统转变 成蛋白质，执行各种生理生化功能。科学家把从DNA到蛋白质的过程称为基因表达(gene expression),对这个过程的调节就称为基 因表达调控(gene regulation,gene control)。基因调控是现阶段分子生物学研究的中心课题。2010-10-317南京农业大学生命科学学院厂广室一节 原核基因表达调控总论 H:基因表达调控主要表现在以下二方面：-转录水平上的调控-转录后水平上的调控：mRNA加工成熟水平调控翻译水平调控。不同的生物使用不同的信号来指挥基因调控。-原核生物中，营养状况和环境因素对基因表达起着举足 轻重的影响。在真核生物尤其是高等真核生物中，激素水平和发育阶 段是基因表达调控的最主要手段，营养和环境因素的影 响力大为下降。2010-10-318南京农业大学生命科学学院厂产经一节原核基因表达调控总论 卜:在转录水平上对基因表达的调控决定于D NA的结 构、RNA聚合酶的功能、蛋白因子及其他小分子 配基的相互作用。转录与翻译的特点：细菌的转录与翻译过程几乎发生在同一时间间隔 内，转录与翻译相耦联。真核生物中，转录产物只有从核内运转到核外，才能被核糖体翻译成蛋白质。/2010-10-319南京农业大学生命科学学院厂 第一节 原核基因表达调控总论 1.原核基因调控分类:原核生物的基因调控主要发生在转录水平上，根据调控机 制的不同可分为负转录调控和正转录调控。在负转录调控系统中，调节基因的产物是阻遏蛋白(repressor)o根据其作用特征又可分为负控诱导系统和 负控阻遏系统二大类。在正转录调控系统中，调节基因的产物是激活蛋白(activator)o也可根据激活蛋白的作用性质分为正控诱 导系统和正控阻遏系统。1阻遏蛋白激活蛋白负控诱导正控诱导.抑制负控阻遏正控阻遏2010-10-3110南京农业大学生命科学学院Induction and repression can be under positive or negative controlNEGATIVE CONTROLn t.Inactive repressor IZDUCdPOSITIVE CONTROLH：r-JAInactive activatorInducerActive activatorKEPHESSED INDUCEDactivator广1 Inactive activator CorepressorREPRESSEmt ydwergitOraTni2010-10-3111南京农业大学生命科学学院才叫一节 原核基因表达调控总论 K1.原核基因调控分类。大肠杆菌中基因表达调控最常见的蛋白质可能是。因子，基 因组序列分析后发现存在6种o因子，并根据其相对分子质 量的大小或编码基因进行命名，其中。7。是调控最基本的生 理功能如碳代谢、生物合成等基因的转录所必须的。E.coli has several sigma factorsGeneFactorUserpoDQ70generalrpoSZstressrpoH032heat shockrpoEheat shockrpoNO54nitrogenfliA28,F n 9)flagellarvirtualtextw w 2010-10-3112南京农业大学生命科学学院厂产经一节原核基因表达调控总论 卜2.原核基因调控的主要特点：原核生物通过特殊代谢物调节的基因活性主要分为可诱导 和可阻遏两大类：可诱导调节。是指一些基因在特殊的代谢物或化合物的 作用下，由原来关闭的状态转变为工作状态，即在某些 物质的诱导下使基因活化。这类基因中最突出的例子是 大肠杆菌的乳糖操纵子。-可阻遏调节。这类基因平时都是开启的，处在产生蛋白 质或酶的工作过程中，由于一些特殊代谢物或化合物的 积累而将其关闭，阻遏了基因的表达。比如大肠杆菌中 的色氨酸操纵子。/2010-10-3113南京农业大学生命科学学院厂产经一节原核基因表达调控总论 h3.弱化子对基因活性的影响:在这种调节方式中,起信号作用的是有特殊负载的氨酰 tRNA的浓度，在色氨酸操纵子中就是色氨酰-tRNA的浓度。当操纵子被阻遏，RNA合成被终止时，起终止转录信号 作用的那一段DNA序列被称为弱化子。属于这种调节方式的有：大肠杆菌中的色氨酸操纵子、苯 丙氨酸操纵子、苏氨酸操纵子、异亮氨酸操纵子和缀氨酸 操纵子以及沙门氏菌的组氨酸操纵子和亮氨酸操纵子、喀 唳合成操纵子等等。/2010-10-3114南京农业大学生命科学学院厂产经一节原核基因表达调控总论 卜4.降解物对基因活性的调节:有葡萄糖存在的情况下，即使在细菌培养基中加入乳糖、半乳糖、阿拉伯糖或麦芽糖等诱导物，与其相对应的操纵子也不会启动，不会产生出代谢这些糖的酶来，这种现象|称为葡萄糖效应或称为降解物抑制作用。降解物抑制作用是通过提高转录强度来调节基因表达的，是一种积极的调节方式。I_)2010-10-3115南京农业大学生命科学学院厂产经一节原核基因表达调控总论 卜5.细菌的应急反应细菌有时会碰到紧急状况，比如氨基酸饥饿氨基酸的 全面匮乏。细菌会产生一个应急反应 停止包括生产各 种RNA、糖、和蛋白质的几乎全部生物化学反应过程。实施这一应急反应的信号是鸟普四磷酸(ppGpp)和鸟普五 磷酸(pppGpp)。产生这两种物质的诱导场是空羲tRNA。当氨基酸饥饿时，细胞中便存在大量的不带氨基酸的tRNA,这种空载的tRNA会激活焦磷酸转移酶,使ppGpp大量合成。ppGpp的出现会关闭许多基因，以应付这种紧急状况。ppGpp影响RNA聚合酶与这些基因转录起始位点的结合,使 基因被关闭。ppGpp与pppGpp的作用范围十分广泛,它们影响一大批操纵 子而被称为超级调控因子。/2010-10-3116南京农业大学生命科学学院厂产0 第二节乳糖操纵子 卜:*1961年，Jacob和Monod提出了操纵子模型，这是与特殊 代谢途径有关的基因转录的协同调控模型。:操纵子是基因表达和调控的单元，典型的操纵子包括：结构基因（除调节基因以外的所有基因），编码那些在 某一特定的生物合成途径中起作用的、其表达被协同调 控的酶。调控元件，如操纵序列，是调节结构基因转录的一段 DNA序列。调节基因，其产物能够识别调控元件，例如阻抑物，可 以结合并调控操纵基因序列。/2010-10-3117南京农业大学生命科学学院第二节乳糖操纵子:大肠杆菌能利用乳糖作为碳源，而利用乳糖作为碳源的酶 只有当乳糖成为惟一的碳源时才会被合成。:大肠杆菌乳糖操纵子(lactose operon)包括3个结构基 因：Z、Y和A,以及启动子、控制子和阻遏子等。转录的 调控是在启动区和操纵区进行的。2010-10-31 18 南京农业大学生命科学学院厂产0 第二节乳糖操纵子 卜:*P为启动子，。为操纵区，/acl编码阻遏子:*3个结构基因各决定一种酶：Z编码即半乳糖普酶；Y编码 0-半乳糖谷透过酶；A编码即半乳糖首乙酰基转移酶。-小半乳糖普酶是一种小半乳糖普键的专一性酶，除能将 乳糖水解成葡萄糖和半乳糖外，还能水解其他小半乳糖 昔（如苯基半乳糖普）。-B-半乳糖普透过酶的作用是使外界的小半乳糖昔透过大 肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内。小半乳糖普乙酰基转移酶的作用是把乙酰辅酶A上的乙 酰基转移到-半乳糖昔上，形成乙酰半乳糖。k_）2010-10-3119南京农业大学生命科学学院第二节乳糖操纵子：一般情况下，/ac+基因型大肠杆菌细胞内0半乳糖苗酶和 透过酶的浓度很低，每个细胞只有12个酶分子。但是，在乳糖培养基上酶的浓度很快达到细胞总蛋白量的6%或 7%,超过105个酶分子/ac mRNA/细胞。在无葡萄糖有乳糖的培养基中，/ac+细菌中将同时合成由 半乳糖普酶和透过酶。1.酶的诱导-/ac体系受调控的证据2010-10-3120南京农业大学生命科学学院小08 第二节乳糖操纵子 一1.酶的诱导-/ac体系受调控的证据:用32P标记的mRNA与模板DNA进行定量分子杂交，表明 培养基中加入乳糖12分钟后，编码0半乳糖菩酶和透过 酶的/ac mRNA量就迅速增加,去掉乳糖后,量立即下降。O 5L 6*济安器、芭隼避斗堪乓 濡加木井0端V N X E F 一|5 1。时间/min加入乳糖 去掉乳糖2010-10-3121南京农业大学生命科学学院1 第二节乳糖操纵子_.1.酶的诱导-lac体系受调控的证据:实验室常用两种乳糖类似物异丙基疏基半乳糖昔(IPTG)和疏甲基半乳糖昔(TMG),在酶活性分析中常用 发色底物0-硝基半乳糖昔(ONPG)o因为它们都不是半 乳糖普酶的底物，所以又称为安慰性诱导物。厂产。第二节乳糖操纵手2.操纵子模型及其影响因子 Jacob和Monod通过大量实验及分析，建立了现在已经被人 们广泛接受的乳糖操纵子的控制模型。内容如下：.Z、Y、A&因产物由同一条多顺反子mRNA分子所编码该mRNA分子的启动区（P）位于阻遏基因（I）与操纵 区（0）之间，不能单独起始半乳糖普酶和透过酶基因的 高效表达。操纵区是DNA上的一小段序列（仅为26bp）,是阻遏物 的结合位点。_72010-10-3123南京农业大学生命科学学院当阻遏物与操纵区相结合时，lacmRNA的转录起始受 到抑制。诱导物通过与阻遏物结合，改变其三维构象，使之不能 与操纵区相结合，诱发/acmRNA的合成。A repressor tetramer binds the operatorInducer inactivates repressorvirtualtext w w INDUCER*TetramerMonomerTetramer binds to operator and blocks transcriptionlad gene synthesizes repressor monomer that forms tetramer八八t窗公磔劭幽侬磔磔呸Ow OInducer converts lac repressor into inactive form that cannot bind operatorRNA polymerase binds at promoter&transcribes RNAladPromoter/Operator lac Zlac Y lac A八八八，mRNA is translated into all three proteins 1virtualtext w w w.ergitO.comt2010-10-3124南京农业大学生命科学学院厂产0 第二节乳糖操纵子 卜2.1.lac操纵子的本底水平表达：两个矛盾：-诱导物需要穿过细胞膜才能与阻遏物结合，而转运诱导物 需要转运酶，转运酶的合成有需要诱导。人们发现乳糖并不与阻遏物相结合，真正的诱导物是异构 乳糖，而后者是在小半乳糖普酶的催化下由乳糖形成的。:解释：在没有诱导物的情况下，转运酶和肉半乳糖甘酶仍有 本地水平的表达。阻遏物的结合并非绝对紧密，偶尔会掉下,使得转录可以进行。表达量足以使诱导过程得以启动。k_)2010-10-3125南京农业大学生命科学学院才心 第二节乳糖操纵手22大肠杆菌对乳糖的反应在以甘油为碳源的培养基中加乳糖以前,/ac操纵子本底 水平表达:加乳糖后,阻遏物失活，mRNA大量表达乳糖耗尽,阻遏物浓度逐渐大 于异构乳糖，阻遏状态重新形 成，mRNA水平下降。:半乳糖甘酶半衰期长，其活 性下降滞后。lac expression responds to inducerAdd inducerRemove inducerInduced levelBasal levelmmInduced levelBasal levelLevel of lac mRNALevel of p-galactosidaseialtext w w w ergitO com2010-10-3126南京农业大学生命科学学院第二节乳糖操纵手2.3.阻遏物/acl基因产物及功能:/ac操纵子阻遏物mRNA是由弱启动子控制下永久型合成的，该阻遏蛋白有4个相同的亚基，每个亚基均含有347个氨基酸残基，并能与1分子IPTG 结合,每个细胞中有510 个阻遏物分子。/acl基因由弱启动子变为 强启动子，细胞内将不可 能产生足够的诱导物来克 服阻遏状态，整个/ac操 纵子在这些突变体中将不 可诱导。A repressor tetramer binds the operatorTetramer;virtualtext w w Monomerlad gene synthesizes r repressor monomerthat forms tetramert/八八XJ管 Tetramer binds to operator and blocks transcription09世舜屋酒续建磔磔醯侬醯Promoter/lac l Operator IqcZ IqcY lac A2010-10-3127南京农业大学生命科学学院第二节乳糖操纵子2.4.葡萄糖对lac操纵子影响。半乳糖普酶在乳糖代谢中的作用是把前者分解成葡萄糖及 半乳糖。如果将葡萄糖和乳糖同时加入培养基中，大肠杆菌 在耗尽外源葡萄糖之前不会诱发lac操纵子。r3E-e,茎忸避加携父*d0.308 7 6 5 4 L o o o o O*&-公比/以&铝更20001500100050050时间/min130 2010-10-3128南京农业大学生命科学学院H 第二节乳糖操纵子_-2.4.葡萄糖对lac操纵子影响：某大肠杆菌突变体，它不能将葡萄糖-6嘛酸转化为下一步 代谢中间物，该细菌的/ac基因能在葡萄糖存在时被诱导合 成。所以，不是葡萄糖而是它的某些降解产物抑制/ac mRNA的合成，科学上把葡萄糖的这种效应称之为代谢物 阻遏效应。90virtualtext w w w.ergitO.comcAMPCRP复合物与启动子区的结合是/ac mRNA合成起 始所必需的，因为这个复合物结合于启动子上游，能使 DNA双螺旋发生弯曲，有利于形成稳定的开放型启动子-RNA聚合酶结构。阻遏物则是一个抗解链蛋白，阻止形成开放结构，从而抑制RNA聚合酶的功能。2010-10-3132南京农业大学生命科学学院第二节乳糖操纵手3.lac操纵子的调控区域一P、0区:+P区（即启动子区）一般 是从I基因结束到m RNA转 录起始位点下游5-1 Obp。:*0区（即阻遏物结合区）位于7+28位，该区的 碱基序列有对称性，其对 称轴在+11位碱基对。Operators are close to the promoterStartpointgalaroHtrpRlacPromoterOperato 门 ocations virtualtexl w w w.ergitO.com2010-10-3133南京农业大学生命科学学院rOCO第二节乳糖操纵子:./ac操纵子小结-通常情况（葡萄糖供应正常）阻遏蛋白与操纵序列结 合，基因不转录。细胞外的乳糖通过透性酶吸收到细胞内；细胞内的0-半乳糖普酶将乳糖转变为异乳糖。异乳糖结合到乳糖 阻抑物上使之从操纵序列上脱离，聚合酶迅速开始 lacZYA&因的转录。这就是负控诱导。然而，还需要细菌生长系统中缺少葡萄糖，使cAMP 含量增加，才有足够量的cAMP与CRP结合形成CRP-cAMP复合物结合于Plac上游。使DNA双螺旋发生弯 曲，转录才可以有效地进行。2010-10-3134南京农业大学生命科学学院广广Q0 第三节 色氨酸操纵子 卜、trp体系参与生物合成，它不受葡萄糖或cAM P-C RP的调控。色氨酸合成主要分5步完成，有7个基因参与整个合成过程。:操纵子中各基因功能：trpE和trpG编码邻氨基苯甲酸合酶,trpD编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶，trpF编码异构酶,trpC编码呻味甘油磷酸合酶，trpA和trpB则分别编码色氨酸合酶的a和0亚基。在许多细菌中,trpE和在pG,trpC和trpB分别融合成一个 基因，产生具有双重功能的蛋白质。rpoD及rpsU属于大肠杆菌基因组上的同一个操纵 子，而这3个基因产物在数量上却大不相同，每个细胞内50 个拷贝的dnaG蛋白，2800个拷贝的rpoD蛋白；40000个拷 贝的rpsU蛋白。基因转录出来的三个蛋白相应的mRNA拷 贝数大体相同，由于翻译的调控使得蛋白的拷贝数发生了很 大的变化。研究dnaG序列发现其中含有不少稀有密码子。分别计算大 肠杆菌中25种结构蛋白和dnaC、rpoD序歹中64种密码子的 利用频率，可以看出dnaG与其他两类有明显不同。_J2010-10-3152南京农业大学生命科学学院X_ooo5.稀有密码子对翻译的影响:很明显，稀有密码子AUA在高效表达的结构蛋白及。因子 中均极少使用，而在表达要求较低的dnaG蛋白中使用频 率就相当高。表6-11几种蛋白质中异亮氨酸密码子使用频率比较蛋白质AUU/%AUC/%AUA/%结构蛋白376210亚基26740DnaG蛋白363232:许多与dnaG一样含量少的蛋白,由于细胞内对应于稀有 密码子的tRNA较少，高频率使用这些密码子的基因翻译 过程容易受阻,影响了蛋白质合成的总量。_)2010-10-3153南京农业大学生命科学学院第六节 转录后调控 卜6.重叠基因对翻译的影响:正常情况下，trp操纵子中5个基因产物是等量的，但trpE突 变后，其邻近的trpD产量比下游trpBA产量要低得多。研究 trpE和trpD以及trpB和trpA两对基因中核昔酸序列与翻译 的关系，发现trpE基因的终止密码子和trpD基因的起始密 码子共用核昔酸。trpE苏氨酸苯丙氨酸终止ACU-UUC-UGAuggcuAUGGCU甲硫氨酸-丙氨酸-trpD_J2010-10-3154南京农业大学生命科学学院(一6.重叠基因对翻译的影响由于trpE的终止密码子与trpD的起始密码重叠,trpE翻译 终止时核糖体立即处在起始环境中，这种重叠的密码保证 了同一核糖体对两个连续基因进行翻译的机制。trpB和trpA基因也存在着翻译耦联现象。实验证明,耦联 翻译可能是保证两个基因产物在数量上相等的重要手段。：大肠杆菌gal操纵子中也存在基因重叠现象。2010-10-3155南京农业大学生命科学学院第六节转录后调控7.翻译的阻遏8.魔斑核甘酸水平对翻译的影响：鸟普四磷酸（ppGpp）和鸟普五磷酸（pppGpp）是在色谱上检出的斑点,当时 称魔斑（magicspot）（详见本PPT16页）RelA produces pppGppRelA(p)ppGpp synthetase(=Stringent factor)GTP+ATP major pafli峋上 pppGppVarious ribosomal proteinsGDP+ATP minor pathw aySpoTvirtualtext w w 2010-10-3156南京农业大学生命科学学院Ttafc Wm S