多肽和蛋白质类药物专家讲座.pptx

Chapter 3 多肽与蛋白质类药品多肽与蛋白质类药品多肽和蛋白质类药物第1页u1953年人工合成了第一个有生物活性多肽年人工合成了第一个有生物活性多肽催产素催产素以以后，后，20世纪世纪50年代都集中于脑垂体所分泌各种多年代都集中于脑垂体所分泌各种多肽激素肽激素研究。研究。u60年代，研究重点转移到控制脑垂体激素分泌各种多肽年代，研究重点转移到控制脑垂体激素分泌各种多肽激素研究。激素研究。u70年代，年代，神经肽神经肽研究进入高潮。生物胚层发育渊源关系研究进入高潮。生物胚层发育渊源关系表明，很多脑活性肽也存在于肠胃组织中，从而推进了表明，很多脑活性肽也存在于肠胃组织中，从而推进了肠胃激素研究进展。肠胃激素研究进展。多肽和蛋白质类药物第2页3.1 多肽和蛋白质药品基本知识多肽和蛋白质药品基本知识p基本概念基本概念多肽类多肽类药品是以多肽药品是以多肽激素激素和多肽和多肽细胞生长因子细胞生长因子为主一为主一大类内源性活性成份。大类内源性活性成份。蛋白质蛋白质药品包含药品包含蛋白质类激素、蛋白质细胞生长调整蛋白质类激素、蛋白质细胞生长调整因子、血浆蛋白质类、黏蛋白、胶原蛋白、蛋白酶抑因子、血浆蛋白质类、黏蛋白、胶原蛋白、蛋白酶抑制剂制剂等，其作用方式从对机体各系统和细胞生长调整，等，其作用方式从对机体各系统和细胞生长调整，扩展到被动免疫、替换疗法和抗凝血等。扩展到被动免疫、替换疗法和抗凝血等。多肽和蛋白质类药物第3页u细胞生长调整因子细胞生长调整因子在体内和体外对效在体内和体外对效应细胞生长、增殖和分化起调控作用一类应细胞生长、增殖和分化起调控作用一类物质。物质。u许多生长因子在靶细胞上有特异性受体，许多生长因子在靶细胞上有特异性受体，仅微量就有较强生理活性。仅微量就有较强生理活性。3.1 多肽和蛋白质药品基本知识多肽和蛋白质药品基本知识多肽和蛋白质类药物第4页生物技术在该类中应用生物技术在该类中应用p基因工程技术制造基因工程技术制造-胰岛素、干扰素、白介素、生胰岛素、干扰素、白介素、生长素、长素、EPO等实现了工业化，发展方向为转基因动植物等实现了工业化，发展方向为转基因动植物A.许多活性蛋白质、多肽都是由无活性蛋白质前体，经过许多活性蛋白质、多肽都是由无活性蛋白质前体，经过酶加工剪切转化而来有酶加工剪切转化而来有共同起源，相同共同起源，相同结构，保留着若结构，保留着若干彼此所特有生物活性。研究活性多肽结构与功效关系干彼此所特有生物活性。研究活性多肽结构与功效关系及活性多肽之间结构异同与其活性关系，将及活性多肽之间结构异同与其活性关系，将有利于设计有利于设计和研制新活性多肽药品。和研制新活性多肽药品。B.对蛋白质类药品进行结构修饰对蛋白质类药品进行结构修饰多肽和蛋白质类药物第5页u按起源分按起源分生化药品生化药品起源于动植物有机体起源于动植物有机体基因工程药品基因工程药品起源于基因工程菌表示生产药起源于基因工程菌表示生产药品品u习惯分法习惯分法多肽生化药品、细胞生长因子、抗体药品、抗菌多肽生化药品、细胞生长因子、抗体药品、抗菌肽、酶类药品肽、酶类药品多肽、蛋白质类药品分类多肽、蛋白质类药品分类多肽和蛋白质类药物第6页多肽类激素、多肽抗生素：多肽类激素、多肽抗生素：消化道多肽、下丘脑消化道多肽、下丘脑多肽、脑多肽、激肽等；动、植物蛋白。多肽、脑多肽、激肽等；动、植物蛋白。酶类与辅酶类药品：酶类与辅酶类药品：蛋白水解酶类、凝血酶及抗蛋白水解酶类、凝血酶及抗栓酶，辅酶栓酶，辅酶Q10等。等。生化药品生化药品多肽和蛋白质类药物第7页激素类及神经递质类药品：激素类及神经递质类药品：人生长激素释放抑制因子，人生长激素释放抑制因子，人胰岛素，人生长激素人胰岛素，人生长激素细胞因子类药品：细胞因子类药品：人干扰素，人白细胞介素，集落刺激人干扰素，人白细胞介素，集落刺激因子，促红细胞生成素因子，促红细胞生成素酶类及凝血因子类药品：酶类及凝血因子类药品：单克隆抗体、疫苗、基因治疗单克隆抗体、疫苗、基因治疗药品、白介素、生长因子、内啡肽、反义药品、人生长药品、白介素、生长因子、内啡肽、反义药品、人生长激素、促红细胞生成素、肿瘤坏死因子等。激素、促红细胞生成素、肿瘤坏死因子等。基因工程药品基因工程药品多肽和蛋白质类药物第8页多肽和蛋白质物化性质多肽和蛋白质物化性质1.酸碱性酸碱性u多肽是小分子，化学性质与氨基酸类似，含有多肽是小分子，化学性质与氨基酸类似，含有20个以上氨基酸残基多肽与蛋白质没有显著界个以上氨基酸残基多肽与蛋白质没有显著界限；限；u蛋白质是呈两性解离电解质，通常在等电点时，蛋白质是呈两性解离电解质，通常在等电点时，蛋白质溶解度最小，不稳定，易于从溶液中沉蛋白质溶解度最小，不稳定，易于从溶液中沉淀析出。淀析出。u各种蛋白质分子都有自己等电点。各种蛋白质分子都有自己等电点。多肽和蛋白质类药物第9页2.离子结合离子结合u蛋白质存在两性，其表面带有一定量电荷，可蛋白质存在两性，其表面带有一定量电荷，可与阴离子或阳离子结合。与阴离子或阳离子结合。u很多离子与蛋白质形成不溶性盐，可作为蛋白很多离子与蛋白质形成不溶性盐，可作为蛋白质沉淀剂。质沉淀剂。多肽和蛋白质物化性质多肽和蛋白质物化性质多肽和蛋白质类药物第10页多肽和蛋白质物化性质多肽和蛋白质物化性质3.胶体性质胶体性质u蛋白质分子量大，分子大小到达胶粒1100nm范围。u球状蛋白质表面多亲水基团，含有强烈地吸引水分子作用，使蛋白质分子表面常为多层水分子所包围，称水化膜水化膜，从而阻止蛋白质颗粒相互聚集。u蛋白质分子扩散速度慢，不易透过半透膜，粘度大，在分离提纯蛋白质过程中，可利用蛋白质这一性质除去小分子杂质透析透析(dialysis)。多肽和蛋白质类药物第11页4.变性变性u天然蛋白质严密结构在一些物理或化学原因作用下，其特定空间结构被破坏空间结构被破坏，从而造成理化性质改变和生物学生物学活性丧失活性丧失，如酶失去催化活力，激素丧失活性，称之为蛋白质变性作用变性作用(denaturation)。u变性蛋白质和天然蛋白质最显著区分是溶解度降低溶解度降低u变性并非是不可逆改变，当变性程度较轻时，如去除变性原因，有蛋白质仍能恢复或部分恢复其原来构象及功效，变性可逆改变称为复性复性。多肽和蛋白质物化性质多肽和蛋白质物化性质多肽和蛋白质类药物第12页多肽和蛋白质类药物第13页3.2 多肽和蛋白质药品生产方法多肽和蛋白质药品生产方法u利用传统生化提取法生产利用传统生化提取法生产 从动植物、微生物等直接提取 经过培养动植物、微生物细胞得到u利用基因工程技术构建工程菌（细胞）进行生产利用基因工程技术构建工程菌（细胞）进行生产 利用原核生物或简单真核生物如酵母菌作为工程菌（活细胞），经过将含有编码某蛋白或多肽碱基序列插入一段DNA载体（如质粒）中，并在工程菌（或细胞）中表示，从而得到对应多肽或蛋白质。多肽和蛋白质类药物第14页n加拿大SembioSys生物工程企业利用北美洲普遍栽培高产油料作物红花作为转基因植物“平台”，成功生产出“红花子起源人胰岛素红花子起源人胰岛素”，n该胰岛素顺利经过动物试验与期临床试验，其药代动力学与药效学试验结果与美国礼来利用大肠杆菌表述胰岛素基因生产重组DNA人胰岛素基本一样。n理论上，每公顷红花田可生产出1千克人胰岛素原料药。3.2 多肽和蛋白质药品生产方法多肽和蛋白质药品生产方法多肽和蛋白质类药物第15页p加拿大渥太华大学生物技术研究中心科研人员也利用另两种高产作物烟草和水稻植株生产出了一个名为“胰岛素样生长因子胰岛素样生长因子”(ILGF)新型降血糖药品。p据称，ILGF降糖效果甚至优于常规口服降糖药。p假如ILGF能经过临床试验并成功上市，或将成为前景可期国际医药市场畅销产品。3.2 多肽和蛋白质药品生产方法多肽和蛋白质药品生产方法多肽和蛋白质类药物第16页蛋白质、多肽提取分离惯用方法：蛋白质、多肽提取分离惯用方法：u沉淀法（盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀、结晶等）u超滤法u膜分离法u离心分离法u凝胶过滤法u离子交换层析u疏水相互作用色谱u亲和层析等3.3 多肽和蛋白质药品分离多肽和蛋白质药品分离多肽和蛋白质类药物第17页基因工程药品分离与纯化流程基因工程药品分离与纯化流程多肽和蛋白质类药物第18页3.3.1 反相高效液相色谱反相高效液相色谱多肽和蛋白质类药物第19页3.3.1 反相高效液相色谱反相高效液相色谱多肽和蛋白质类药物第20页3.3.1 反相高效液相色谱反相高效液相色谱分离机理：用用C4C8烷基作配基，将配基键合在固定基质上作为固定相，烷基作配基，将配基键合在固定基质上作为固定相，以水溶性有机溶剂（如甲醇、乙腈、异丙醇）加强酸作流动以水溶性有机溶剂（如甲醇、乙腈、异丙醇）加强酸作流动相（流动相极性大于固定相）。相（流动相极性大于固定相）。蛋白质分子中现有亲水性基团（蛋白质分子中现有亲水性基团（-OH，-NH、-COOH、SH等）等），也有疏水性基团（如苯环、，也有疏水性基团（如苯环、-CH3、-CH2和和-CH等）。等）。多肽和蛋白质类药物第21页在水溶液中，疏水性基团避开水而亲合其它疏水性基团，在水溶液中，疏水性基团避开水而亲合其它疏水性基团，即溶质分子非极性部分在水中倾向于与水接触面减小，促即溶质分子非极性部分在水中倾向于与水接触面减小，促进了其与填料（疏水性配基）亲合。进了其与填料（疏水性配基）亲合。不一样蛋白质在相同流动相中因为疏水基团数量、种类以不一样蛋白质在相同流动相中因为疏水基团数量、种类以及表面分布情况不一样，与填料亲协力也不一样，从而得及表面分布情况不一样，与填料亲协力也不一样，从而得到分离。到分离。结果：结果：疏水性强蛋白质亲协力大，出峰迟；疏水性强蛋白质亲协力大，出峰迟；疏水性小蛋白质就疏水性小蛋白质就容容易被洗脱易被洗脱。3.3.1 反相高效液相色谱反相高效液相色谱多肽和蛋白质类药物第22页色谱条件色谱条件固定相：固定相：惯用惯用C4 C8链烃作为配基（键合在固体基质上）为链烃作为配基（键合在固体基质上）为填料。孔径填料。孔径2550 nm。流动相：流动相：水溶性有机溶剂（水溶性有机溶剂（B液）液）（甲醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃）（甲醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃）水（水（A液）液）强酸（三氟醋酸、甲酸、磷酸强酸（三氟醋酸、甲酸、磷酸）洗脱能力增大加酸作用：加酸作用：SiOH=SiO-H+蛋白质易与蛋白质易与SiO-结合极难洗脱，加酸抑制上述平衡向右离解。结合极难洗脱，加酸抑制上述平衡向右离解。减小蛋白质疏水性，使其保留减弱，易被洗脱。减小蛋白质疏水性，使其保留减弱，易被洗脱。多肽和蛋白质类药物第23页 温度温度：常温：常温色谱条件色谱条件 检测检测：用紫外检测器，检测波长：用紫外检测器，检测波长280nm 和和220nm。u280nm检测中含有含苯环酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸蛋白检测中含有含苯环酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸蛋白质，普通蛋白质都含有苯环，所以质，普通蛋白质都含有苯环，所以280nm检测是普遍使用检测是普遍使用波长。波长。u 220nm主要检测肽键；所以全部蛋白质普遍适用。主要检测肽键；所以全部蛋白质普遍适用。多肽和蛋白质类药物第24页 洗脱方式：洗脱方式：梯度洗脱梯度洗脱逐步增加洗脱强度。逐步增加洗脱强度。p 蛋白质分离普通就需要用梯度洗脱，不然有些蛋白质已到蛋白质分离普通就需要用梯度洗脱，不然有些蛋白质已到达突跃会很快被洗脱下来，有些蛋白质还远离突跃区，实达突跃会很快被洗脱下来，有些蛋白质还远离突跃区，实际上无法被洗脱。际上无法被洗脱。p而有机小分子反相色谱中未发觉此种突跃现象。实际工作而有机小分子反相色谱中未发觉此种突跃现象。实际工作中梯度洗脱时间约为中梯度洗脱时间约为2060min，B液改变速度约为每分钟液改变速度约为每分钟5%15%。色谱条件色谱条件多肽和蛋白质类药物第25页30m15m5mInfluence of Particle Size on the Separation effect多肽和蛋白质类药物第26页应应 用用最大优点：分离度最高；最大优点：分离度最高；最大缺点：轻易使蛋白质变性失活。最大缺点：轻易使蛋白质变性失活。例子：人胶原蛋白例子：人胶原蛋白I型型1和和2键色谱分离键色谱分离 多肽和蛋白质类药物第27页 3.3.2 疏水相互作用色谱疏水相互作用色谱 概念：概念：用适度疏水性配基作固定相，以盐水体用适度疏水性配基作固定相，以盐水体 系系作流动相，用疏水作用来分离生物大分子化合作流动相，用疏水作用来分离生物大分子化合物液相色谱法，叫物液相色谱法，叫疏水相互作用色谱疏水相互作用色谱(Hyd rophobic Interaction Chromatography,HIC)或或疏水作用色谱。疏水作用色谱。多肽和蛋白质类药物第28页p 在在HIC中：固定相表面有疏水性基团，（如中：固定相表面有疏水性基团，（如-CH2，-CH3，-ph等）。等）。p 蛋白质分子是一个外部有亲水层包围，内部有疏水核含蛋白质分子是一个外部有亲水层包围，内部有疏水核含有四级结构复杂体系。有四级结构复杂体系。p 蛋白质表面亲水性很强，但也有一些疏水性基团，同时蛋白质表面亲水性很强，但也有一些疏水性基团，同时团状蛋白质还存在疏水基团较多裂隙。团状蛋白质还存在疏水基团较多裂隙。分离原理分离原理多肽和蛋白质类药物第29页分离原理分离原理p 在不一样介质中裂隙伸展和收缩在不一样介质中裂隙伸展和收缩程度不一样，从而使疏水基团暴程度不一样，从而使疏水基团暴露多少也不一样。露多少也不一样。p 疏水色谱是利用盐水体系中样品疏水色谱是利用盐水体系中样品组分疏水基团和固定相疏水配基组分疏水基团和固定相疏水配基之间疏水作用力不一样而到达分之间疏水作用力不一样而到达分离目标。离目标。多肽和蛋白质类药物第30页配基和蛋白质分子之间吸附推进力和样品组分洗脱机理配基和蛋白质分子之间吸附推进力和样品组分洗脱机理（即：溶质在色谱中保留行为）：（即：溶质在色谱中保留行为）：u“疏溶剂化理论疏溶剂化理论”：蛋白质与配基结合是因为溶质分子有：蛋白质与配基结合是因为溶质分子有一个降低其与水接触非极性表面倾向，它们在盐水溶液中，一个降低其与水接触非极性表面倾向，它们在盐水溶液中，两个非极性表面趋向于避开水相而相互接触。溶质和疏水两个非极性表面趋向于避开水相而相互接触。溶质和疏水配基结合是伴伴随它们非极性表面暴露在水中面积多少而配基结合是伴伴随它们非极性表面暴露在水中面积多少而进行。进行。u蛋白质在盐水体系中，有一倾向产生：避开水相而吸附在蛋白质在盐水体系中，有一倾向产生：避开水相而吸附在固定相上。固定相上。生物物质界面自由能比水低，与表面自由能生物物质界面自由能比水低，与表面自由能低固定相产生亲协力低固定相产生亲协力多肽和蛋白质类药物第31页结论结论p疏水作用色谱中，蛋白质在固定相上保留性质是四个可疏水作用色谱中，蛋白质在固定相上保留性质是四个可变原因综合作用结果。变原因综合作用结果。p这四个原因是：样品分子、填料、流动相组成及性质和这四个原因是：样品分子、填料、流动相组成及性质和温度。温度。多肽和蛋白质类药物第32页填填 料料由基质和键合在基质上配基两部分组成。（基质配基）由基质和键合在基质上配基两部分组成。（基质配基）基质：基质：有有“软软”、“硬硬”两类，它们必须有两类，它们必须有25100nm内孔径内孔径或或 有较大间隙网状结构（孔径要大）。有较大间隙网状结构（孔径要大）。软基质：软基质：交联琼脂糖凝胶，交联葡聚糖凝胶、高分子聚合物。交联琼脂糖凝胶，交联葡聚糖凝胶、高分子聚合物。硬基质：硬基质：主要是大孔径硅胶。主要是大孔径硅胶。配基：配基：是一些含氮和氧原子中等疏水性基团；是一些含氮和氧原子中等疏水性基团；or是丁基、苯基这些疏水基团键合在一个亲水性表面。是丁基、苯基这些疏水基团键合在一个亲水性表面。多肽和蛋白质类药物第33页色谱条件色谱条件主要有：主要有：a.含有中等疏水性表面填料；含有中等疏水性表面填料；b.盐析性盐水溶液为流动相；盐析性盐水溶液为流动相；c.紫外检测器检测，检测波长紫外检测器检测，检测波长220或或280nm；d.流动相流动相pH值靠近中性；值靠近中性；e.由高盐浓度到低盐浓度梯度洗脱，梯度时间由高盐浓度到低盐浓度梯度洗脱，梯度时间2060 min；f.常温或常温或4下操作。下操作。多肽和蛋白质类药物第34页1、流动相组成、流动相组成 u有有A液和液和B液两种。液两种。A液液：疏水性浓盐水溶液，并含有缓冲液作用盐以稳定疏水性浓盐水溶液，并含有缓冲液作用盐以稳定pH值。惯用值。惯用A液液为为1.03.0mol/L(NH4)2SO4加加0.010.05mol/L磷酸盐缓冲液；磷酸盐缓冲液；B液液：稀缓冲液，浓度与稀缓冲液，浓度与A液中缓冲作用盐浓度相等。惯用液中缓冲作用盐浓度相等。惯用B液为液为0.010.05mol/L磷酸盐缓冲液。磷酸盐缓冲液。u盐有两类。盐有两类。盐析性盐：盐析性盐：使蛋白质构象稳定，会促进蛋白质本身间疏水作用而析出，使蛋白质构象稳定，会促进蛋白质本身间疏水作用而析出，or促进蛋白质与配基之间疏水作用而保留在柱上。不失活，溶解度减促进蛋白质与配基之间疏水作用而保留在柱上。不失活，溶解度减小。惯用：小。惯用：(NH4)2SO4盐溶性盐盐溶性盐：提升蛋白质水溶性，同时会使蛋白质变性。如硫氰酸盐、提升蛋白质水溶性，同时会使蛋白质变性。如硫氰酸盐、盐酸胍等会。盐酸胍等会。多肽和蛋白质类药物第35页2、流动相、流动相pH值：值：普通地普通地pH 48；常选；常选 pH 7左右。左右。3、温度、温度 普通在常温或低于常温下操作。普通在常温或低于常温下操作。HIC中蛋白质保留对温度较敏感。中蛋白质保留对温度较敏感。在在HIC体系中蛋白质处于活性状态，体系中蛋白质处于活性状态，T使蛋白质团状结构伸展，暴露使蛋白质团状结构伸展，暴露出更多疏水基团，疏水作用增强，保留值增大。出更多疏水基团，疏水作用增强，保留值增大。（其它色谱，（其它色谱，T保留增大）保留增大）T传质加紧，使保留减小。传质加紧，使保留减小。（对全部色谱均适用）（对全部色谱均适用）总之，在疏水色谱中，总之，在疏水色谱中，比比大，大，T，保留增大。，保留增大。4、洗脱方式：、洗脱方式：梯度洗脱。（高浓度盐梯度洗脱。（高浓度盐低浓度盐）低浓度盐）1、流动相组成、流动相组成 多肽和蛋白质类药物第36页疏水作用色谱应用疏水作用色谱应用 u只用于生物大分子分离，不用于有机小分子分离。只用于生物大分子分离，不用于有机小分子分离。u优点：优点：1、其色谱条件温和，蛋白质活性回收率高，普通都在其色谱条件温和，蛋白质活性回收率高，普通都在85%以以上。上。2、不用有毒和昂贵有机溶剂。不用有毒和昂贵有机溶剂。3、分离性能好。分离性能好。4、高浓度盐样品能够直接进疏水作用色谱柱进行分离。高浓度盐样品能够直接进疏水作用色谱柱进行分离。5、对生物工程产品粗品可直接上样，一次完成蛋白质初步分对生物工程产品粗品可直接上样，一次完成蛋白质初步分离、脱盐和复性三个目标。离、脱盐和复性三个目标。多肽和蛋白质类药物第37页比如比如：基因重组人干扰素：基因重组人干扰素r r是一个基因工程是一个基因工程产品，其粗品是产品，其粗品是7mol/L盐酸胍溶液。盐酸胍溶液。u干扰素在盐酸胍溶液中处于可逆性失活干扰素在盐酸胍溶液中处于可逆性失活状态。因盐浓度太高无法直接上其它柱，状态。因盐浓度太高无法直接上其它柱，除去盐酸胍后干扰素又轻易析出来。除去盐酸胍后干扰素又轻易析出来。u若使用疏水作用色谱柱，将此样品直接若使用疏水作用色谱柱，将此样品直接进样，既脱除了盐酸胍，又到达了复性进样，既脱除了盐酸胍，又到达了复性效果。而且一步分离后，干扰素纯度可效果。而且一步分离后，干扰素纯度可到达到达90%。IFN-r粗品粗品HIC分离分离疏水作用色谱应用疏水作用色谱应用 多肽和蛋白质类药物第38页疏水作用色谱与反相色谱区分疏水作用色谱与反相色谱区分n相同：相同：蛋白质与填料之间保留是疏水力作用结果。蛋白质与填料之间保留是疏水力作用结果。n区分：区分：1）填料不一样填料不一样 HIC，表面中等疏水性作为配基；，表面中等疏水性作为配基；RPC，表面是烷基，表面是烷基C48等疏水性强为配基。等疏水性强为配基。2）疏水力不一样）疏水力不一样 HIC，疏水作用较弱；，疏水作用较弱；RPC，强。，强。多肽和蛋白质类药物第39页两色谱中洗脱液主要成份不一样两色谱中洗脱液主要成份不一样（正是上面差异引发）（正是上面差异引发）在在HIC中能够加入少许有机溶剂以增强流动相洗脱能力；中能够加入少许有机溶剂以增强流动相洗脱能力；在在RPC中加入盐来改变蛋白质保留值。中加入盐来改变蛋白质保留值。疏水作用色谱与反相色谱区分疏水作用色谱与反相色谱区分多肽和蛋白质类药物第40页3.3.3 体积排阻色谱u将分子按大小进行分离主要色谱技术；将分子按大小进行分离主要色谱技术；u依据分离对象是依据分离对象是水溶性水溶性化合物还是化合物还是有机溶剂可溶物有机溶剂可溶物，又可，又可分为分为凝胶过滤色谱（凝胶过滤色谱（GFC）和和凝胶渗透色谱（凝胶渗透色谱（GPC）u凝胶过滤色谱普通用于分离水溶性大分子，如多糖类化合凝胶过滤色谱普通用于分离水溶性大分子，如多糖类化合物。凝胶代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。物。凝胶代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。u凝胶渗透色谱法主要用于有机溶剂中可溶高聚物凝胶渗透色谱法主要用于有机溶剂中可溶高聚物(聚苯乙聚苯乙烯等烯等)相对分子质量分布分析及分离，惯用凝胶为交联聚相对分子质量分布分析及分离，惯用凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。多肽和蛋白质类药物第41页1、原理、原理凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱(Gel Filtration Chromatography GFC)又称为分子排阻又称为分子排阻色谱色谱(Size Exclusion Chromatography SEC）原理见图解。）原理见图解。凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱多肽和蛋白质类药物第42页凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱多肽和蛋白质类药物第43页2、凝胶过滤色谱优点、凝胶过滤色谱优点 分离条件温和，蛋白质收率高，重现性好。分离条件温和，蛋白质收率高，重现性好。分离分子量范围广。分离分子量范围广。易于操作。易于操作。3、凝胶过滤色谱缺点、凝胶过滤色谱缺点处理量小，时间长，效率低。处理量小，时间长，效率低。凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱多肽和蛋白质类药物第44页凝胶过滤色谱填料凝胶过滤色谱填料 传统填料用是葡聚糖交联凝胶，凝胶刚性不理想流速不快，尤其是前者压力和盐都会造成凝胶收缩，所以难提升流速，也不轻易制备成小颗粒高分辨率填料。新填料将葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶混合造粒，再经过高度交联制备出流速快、重复性好、分离效果更加好新型凝胶过滤填料，如superdex系列及琼葡糖凝胶系列都是用这么。它比普通葡聚糖凝胶填料相比流速快，刚性好，颗粒均匀，没有非特异吸附，装填后体积不收缩，所以能够在高流速下保持很好分离效果能够制备成平均粒径为34m或13 m高效填料。多肽和蛋白质类药物第45页uu概念：利用概念：利用概念：利用概念：利用离子交换树脂离子交换树脂离子交换树脂离子交换树脂作为吸附剂，将溶作为吸附剂，将溶作为吸附剂，将溶作为吸附剂，将溶液中待分离组分，依据其液中待分离组分，依据其液中待分离组分，依据其液中待分离组分，依据其电荷差异电荷差异电荷差异电荷差异，依靠，依靠，依靠，依靠库库库库仑力仑力仑力仑力吸附在树脂上，然后利用适当洗脱剂将吸附在树脂上，然后利用适当洗脱剂将吸附在树脂上，然后利用适当洗脱剂将吸附在树脂上，然后利用适当洗脱剂将吸附质从树脂上洗脱下来，到达分离目标。吸附质从树脂上洗脱下来，到达分离目标。吸附质从树脂上洗脱下来，到达分离目标。吸附质从树脂上洗脱下来，到达分离目标。3.3.4 离子交换色谱离子交换色谱多肽和蛋白质类药物第46页离子交换树脂结构离子交换树脂结构其结构由三部分组成：其结构由三部分组成：u不溶性三维空间网状结构组成不溶性三维空间网状结构组成树脂骨架树脂骨架，使树脂含有化学，使树脂含有化学稳定性和机械强度；稳定性和机械强度；u是与骨架相联是与骨架相联功效基团功效基团；u是与功效基团带相反电荷可移动离子，称为是与功效基团带相反电荷可移动离子，称为活性离子活性离子，它，它在树脂骨架中进进出出，在树脂骨架中进进出出，就发生离子交换现象。就发生离子交换现象。多肽和蛋白质类药物第47页离子交换树脂结构离子交换树脂结构-网络骨架网络骨架苯乙烯系、丙烯酸系、酚醛系、环氧系多肽和蛋白质类药物第48页离子交换树脂结构骨架：骨架：接有功效基团，本身是惰性接有功效基团，本身是惰性功效基团：功效基团：连接在骨架上，可与相连接在骨架上，可与相反离子结合反离子结合待交换分子：待交换分子：在吸附阶段可与活在吸附阶段可与活性离子交换，与骨架上功效基团性离子交换，与骨架上功效基团结合结合活性离子：活性离子：与功效基团所带电荷相与功效基团所带电荷相反可移动离子反可移动离子多肽和蛋白质类药物第49页u活性离子为阳离子，称阳离子交换树脂，与阳离子发生交换活性离子为阳离子，称阳离子交换树脂，与阳离子发生交换u活性离子为阴离子，称阴离子交换树脂，与阴离子发生交换活性离子为阴离子，称阴离子交换树脂，与阴离子发生交换多肽和蛋白质类药物第50页u离子交换法是经过带电溶质分子与离子交换剂中可交换离子进行交换而到达分离纯化方法。离子交换层析原理多肽和蛋白质类药物第51页u主要依赖电荷间相互作用，利用带电分子中电荷微小差主要依赖电荷间相互作用，利用带电分子中电荷微小差异而进行分离。异而进行分离。u选择适当条件可使一些溶质分子变成离子态，经过静电选择适当条件可使一些溶质分子变成离子态，经过静电作用结合到离子交换剂上，而另一些物质不能被交换，作用结合到离子交换剂上，而另一些物质不能被交换，这两种物质就可被分离。这两种物质就可被分离。u带同种电荷不一样离子带同种电荷不一样离子虽都能够结合到同一介质上，但虽都能够结合到同一介质上，但因为带电量不一样，与介质结合牢度不一样，改变洗脱因为带电量不一样，与介质结合牢度不一样，改变洗脱条件可依次被洗脱而到达分离目标。条件可依次被洗脱而到达分离目标。离子交换层析原理离子交换层析原理多肽和蛋白质类药物第52页离子交换层析原理离子交换层析原理开始开始吸附吸附解吸解吸解吸结束解吸结束再生再生样样品品解解吸吸剂剂再再生生剂剂-+-多肽和蛋白质类药物第53页u离子交换色谱优点离子交换色谱优点u1.处理量大，操作简单。u2.应用广泛。u离子交换色谱缺点u样品要除盐，分离效果不如亲和和疏水色谱。多肽和蛋白质类药物第54页自 学u3.3.5 膜蛋白色谱u3.3.6 高效置换色谱u3.3.7 贯流色谱多肽和蛋白质类药物第55页1 亲合色谱原理亲合色谱原理pAC是吸附色谱一个。但溶质保留是一个特异有选择性亲是吸附色谱一个。但溶质保留是一个特异有选择性亲协力。协力。p填料只是有选择地对一个生物大分子或一类生物大分子有填料只是有选择地对一个生物大分子或一类生物大分子有吸附，对其它物质无吸附作用吸附，对其它物质无吸附作用p洗脱时先被分离，分段洗脱或梯度洗脱再将生物大分子从洗脱时先被分离，分段洗脱或梯度洗脱再将生物大分子从填料上洗脱下来，从而到达分离目标。填料上洗脱下来，从而到达分离目标。3.3.8 亲和色谱亲和色谱多肽和蛋白质类药物第56页亲合色谱原理亲合色谱原理p亲合色谱填料：是在基质上键合一个特殊配基（配位体）亲合色谱填料：是在基质上键合一个特殊配基（配位体）制得。制得。p比如比如 酶底物、产物、抑制剂、辅酶、变构效应物，抗物酶底物、产物、抑制剂、辅酶、变构效应物，抗物抗原，激素结合蛋白等都能够作为抗原，激素结合蛋白等都能够作为 配位体用于分离对应配位体用于分离对应酶，抗体和激素。酶，抗体和激素。p有些配体能够用于一类化合物吸附分离。如伴刀豆球蛋有些配体能够用于一类化合物吸附分离。如伴刀豆球蛋白能够特异地吸附糖蛋白；三嗪染料作配基也会对一些白能够特异地吸附糖蛋白；三嗪染料作配基也会对一些蛋白质有选择性吸附。蛋白质有选择性吸附。多肽和蛋白质类药物第57页p配体与分离对象作用：是一个特异生物亲协力，是配体与配体与分离对象作用：是一个特异生物亲协力，是配体与被吸物之被吸物之 间范德华力、疏水力、静电力和其它力综合作间范德华力、疏水力、静电力和其它力综合作用结果。用结果。p这种综合作用力是有选择性，只对一个或一类生物大分子这种综合作用力是有选择性，只对一个或一类生物大分子起作用，对其它物质不起作用。起作用，对其它物质不起作用。p故故AC选择性很高。选择性很高。亲合色谱原理亲合色谱原理多肽和蛋白质类药物第58页填料（由基质、间隔臂和配体三部分组成）填料（由基质、间隔臂和配体三部分组成）多肽和蛋白质类药物第59页AC填料基质：分两类。填料基质：分两类。p一类为一类为有机聚合物有机聚合物，用得最多是多糖聚合物，如纤维素，用得最多是多糖聚合物，如纤维素，交联葡聚糖、交联琼脂糖等。还有聚丙烯酰胺也是一类，交联葡聚糖、交联琼脂糖等。还有聚丙烯酰胺也是一类惯用基质。多糖基质表面羟基密度大，易制得柱容大填料，惯用基质。多糖基质表面羟基密度大，易制得柱容大填料，而且其表面羟基对蛋白质无非特异性吸附。但这类基质机而且其表面羟基对蛋白质无非特异性吸附。但这类基质机械械 强度低，不耐高压。强度低，不耐高压。p第二类是第二类是多孔玻璃和硅胶多孔玻璃和硅胶。这类基质机械强度高，但柱容。这类基质机械强度高，但柱容较小，表面硅羟基非特异性吸附难以完全克服。较小，表面硅羟基非特异性吸附难以完全克服。填料（由基质、间隔臂和配体三部分组成）填料（由基质、间隔臂和配体三部分组成）多肽和蛋白质类药物第60页试验技术试验技术 1、装柱、装柱p柱子有玻璃柱和不锈钢柱两种。软基质填料装在玻璃柱内，柱子有玻璃柱和不锈钢柱两种。软基质填料装在玻璃柱内，用于常压色谱。硅胶和多孔玻璃基质填料可装在不锈钢柱用于常压色谱。硅胶和多孔玻璃基质填料可装在不锈钢柱内用在高效液相色谱上。内用在高效液相色谱上。p玻璃柱采取普通湿法装柱，溶剂应不损害配体活体，普通玻璃柱采取普通湿法装柱，溶剂应不损害配体活体，普通用缓冲溶液作分散剂来装柱。用缓冲溶液作分散剂来装柱。p不锈钢柱普通采取匀浆法装柱，但装柱压力要低一些。分不锈钢柱普通采取匀浆法装柱，但装柱压力要低一些。分散剂惯用亲水醇类。散剂惯用亲水醇类。多肽和蛋白质类药物第61页试验技术试验技术 2、洗脱方式、洗脱方式pAC最惯用洗脱方式是分段洗脱，还有脉冲洗脱和梯度洗脱。最惯用洗脱方式是分段洗脱，还有脉冲洗脱和梯度洗脱。p分段洗脱过程是：分段洗脱过程是：p平衡柱子平衡柱子(平衡液平衡液)上样上样平衡液洗涤平衡液洗涤洗脱液洗下目标洗脱液洗下目标蛋白蛋白再生再生平衡平衡第二次上样第二次上样p脉冲洗脱是在平衡、上样、洗涤后，用一段少许洗涤液让脉冲洗脱是在平衡、上样、洗涤后，用一段少许洗涤液让其象一条密集脉冲带流过柱子其象一条密集脉冲带流过柱子，以洗下某个特定蛋白。，以洗下某个特定蛋白。多肽和蛋白质类药物第62页3、流动相（有平衡液和洗脱液两种）、流动相（有平衡液和洗脱液两种）p平衡液：平衡液：起平衡柱子和上样后洗去不吸附杂蛋白及其它杂起平衡柱子和上样后洗去不吸附杂蛋白及其它杂质作用。其成份是稀盐缓冲溶液质作用。其成份是稀盐缓冲溶液。p洗脱液：洗脱液：是使吸附在柱子上蛋白质解吸流动相。是使吸附在柱子上蛋白质解吸流动相。p非特异性洗脱：利用洗脱液组成、浓度、非特异性洗脱：利用洗脱液组成、浓度、pH值和温度改值和温度改变使蛋白质与配体作用减弱而洗脱下来。变使蛋白质与配体作用减弱而洗脱下来。p特异性洗脱：利用一个对目标蛋白质也有亲合作用游离配特异性洗脱：利用一个对目标蛋白质也有亲合作用游离配体使其与固定相上配体产生竞争作用把蛋白质拉下体使其与固定相上配体产生竞争作用把蛋白质拉下 来洗脱。来洗脱。多肽和蛋白质类药物第63页4、共价亲合色谱、共价亲合色谱p是一个特殊是一个特殊AC。p利用一个特殊配体，与待纯化蛋白质形成某种不利用一个特殊配体，与待纯化蛋白质形成某种不太强共价健，将蛋白质固定在柱子上。太强共价健，将蛋白质固定在柱子上。p待洗去杂蛋白后，用适当化学方法，将被固定蛋待洗去杂蛋白后，用适当化学方法，将被固定蛋白质重新释放出来。白质重新释放出来。多肽和蛋白质类药物第64页硫醇硫醇二硫化物交换色谱二硫化物交换色谱 能够用来纯化许多含硫醇蛋白质 u将将谷胱甘肽谷胱甘肽N2HCH(COOH)CH2CH2CONHCN(CH2SH)CONHCH2COOH先键合到基质上得到先键合到基质上得到(结构见右)。简写为：。简写为：再与二吡啶基二硫化物再与二吡啶基二硫化物 反应得到填料反应得到填料 。含硫醇基蛋白质可牢靠地固定在定固定相上，必须用含硫醇基洗脱液将含硫醇基蛋白质可牢靠地固定在定固定相上，必须用含硫醇基洗脱液将其洗脱下来，柱子还得用二吡啶基二硫化物再生。其洗脱下来，柱子还得用二吡啶基二硫化物再生。多肽和蛋白质类药物第65页硫醇硫醇二硫化物交换色谱二硫化物交换色谱多肽和蛋白质类药物第66页5、其它色谱条件、其它色谱条件 p上样体积上样体积p流速流速p温度温度p蛋白质浓度影响蛋白质浓度影响6、柱子再生与保护、柱子再生与保护再生：再生：用洗脱液充分洗涤后即可再次进样用洗脱液充分洗涤后即可再次进样。不过重复使用。不过重复使用几次后对目标蛋白吸附率常会降低。所以用几次后对目标蛋白吸附率常会降低。所以用2mol/L KCl加加6 mol/L尿素洗涤。尿素洗涤。保护：保护：柱子平时应保留在柱子平时应保留在4。柱内充满稀缓冲溶液。为了。柱内充满稀缓冲溶液。为了预防细菌，液体可含万分之二叠氮化钠。预防细菌，液体可含万分之二叠氮化钠。多肽和蛋白质类药物第67页应应 用用u亲合色谱应用于酶、蛋白质等生物大分子分离纯化。亲合色谱应用于酶、蛋白质等生物大分子分离纯化。比如：比如：淀粉酶分离能够使硅胶为基质、淀粉酶分离能够使硅胶为基质、淀粉为配体亲合色谱柱来完成。淀粉为配体亲合色谱柱来完成。以去离子水为平衡液，以以去离子水为平衡液，以0.15mol/L磷酸磷酸盐缓冲溶液，盐缓冲溶液，pH7.0作洗脱液，从工业粗作洗脱液，从工业粗酶中纯化酶中纯化淀粉酶，淀粉酶，活性回收率为活性回收率为93.6%，纯化后比活提升，纯化后比活提升了了20倍。柱子寿命为倍。柱子寿命为600次以上。吸附容次以上。吸附容量量4.6mg/g填料。填料。色谱图见右图。色谱图见右图。淀粉酶亲合色谱分离淀粉酶亲合色谱分离 多肽和蛋白质类药物第68页3.3.9 电泳分离技术电泳分离技术 p电泳：电泳：带电粒子在电场作用下向着与其本身所带电荷相反带电粒子在电场作用下向着与其本身所带电荷相反电极移动。电极移动。p电泳技术：电泳技术：样品以一支持物为载体，在一定电解质溶液中，样品以一支持物为载体，在一定电解质溶液中，各组分在电场作用下，以不一样速度进行迁移，从而得到各组分在电场作用下，以不一样速度进行迁移，从而得到分离。分离。p电泳技术分类：电泳技术分类：按支持物不一样，分为：凝胶电泳、纸上电泳和薄膜电泳按支持物不一样，分为：凝胶电泳、纸上电泳和薄膜电泳等。等。按操作原理分为：普通电泳、等速电泳、等电聚焦电泳和按操作原理分为：普通电泳、等速电泳、等电聚焦电泳和免疫电泳免疫电泳 等。等。p对分离物要求：在介质中必须带电。对分离物要求：在介质中必须带电。多肽和蛋白质类药物第69页聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理：原理：不一样带电粒子在同一外加电场作用下泳动速度是不一不一样带电粒子在同一外加电场作用下泳动速度是不一样，泳动度取决于带电颗粒性质，颗粒所带净电荷越多、样，泳动度取决于带电颗粒性质，颗粒所带净电荷越多、直径越小，越靠近球形、泳动速度越大。直径越小，越靠近球形、泳动速度越大。p介质介质pH值（蛋白质为