4例ABO和Rh血型嵌合体的血清学及分子生物学基础研究.pdf

J Clin Transfus Lab Med,June.2023,Vol 25,No.3342DOI：10.3969/j.issn.1671-2587.2023.03.009作者单位：100088 北京市红十字血液中心作者简介：许志远，副主任技师，硕士，主要从事血型血清学和分子免疫血液学研究，（E-mail）。论著4例ABO和Rh血型嵌合体的血清学及分子生物学基础研究许志远 李晓菲 刘婷婷 张烨 苗天红 【摘要】目的 研究血型嵌合体的血清学特征分子生物学确认方法。方法 对4例医院输血科送检做ABO和RhD血型的患者，进行ABO和Rh血型鉴定、毛细管离心分离新生红细胞、吸收试验、DTT处理凝集红细胞试验，同时对患者1的血样进行分子生物学研究。结果 患者1：ABO血型为AB/B型嵌合，Rh血型为RhCE基因嵌合；患者2：Rh血型为RhD基因嵌合；患者3：ABO血型为AB/B型嵌合，Rh血型为RhD基因嵌合；患者4：ABO血型为O/B型嵌合，Rh血型为RhCE基因嵌合。结论 在血型血清学上，排除患者有近期输血史，同时又不存在使患者抗原减弱的疾病情况下，ABO和Rh血型出现混合外观现象是其主要特征，实验人员可依据此怀疑患者是有血型嵌合体的可能通过血清学和分子生物学方法进行确认。【关键词】血型嵌合体 ABO嵌合 Rh嵌合 毛细管离心 熔解曲线 【中图分类号】R457 【文献标识码】A 【文章编号】1671-2587（2023）03-0342-07Four Cases of ABO and Rh Blood Group Chimera of Serology and Molecular Biology Basic Research XU Zhiyuan,LI Xiaofei,LIU Tingting,et al.Beijing Red Cross Blood Center,Beijing 100088【Abstract】Objective To study the serological characteristics,the strategy of blood transfusion and the molecular method of chimera.Methods The serology test of ABO and Rh blood group were done to confirm the four patients ABO and RhD blood group from hospital.Separation of newborn red blood cells by capillary centrifugation,absorb test,DTT treatment of agglutination erythrocyte test and molecular biological identification for one case.Results the patient 1,the blood group of ABO is AB/B chimeras,the blood group of Rh is the gene of RhCE chimeras;the patient 2,the blood group of Rh is the gene of RhD chimeras;the patient 3,the blood group of ABO is AB/B chimeras,the blood group of Rh is the gene of RhD chimeras;the patient 4,the blood group of ABO is O/B chimeras,the blood group of Rh is the gene of RhCE chimeras.Conclusions In terms of blood group serology,the main characteristic is mixed appearance on ABO and Rh blood groups in the absence of a recent history of transfusion and a disease that weaken the patients antigens.Based on this,if there is a suspicious blood group chimera it can be confirmed by serological and molecular biological methods.【Key words】Blood group chimera ABO chimera Rh chimera Capillary centrifugation Melting curve嵌合体在遗传学上用以指不同遗传性状嵌合或混杂表现的个体。免疫学上是指一个个体身上有两种或两种以上染色体组成不同的细胞系同时存在，彼此能够耐受，不产生排斥反应，相互间处在嵌合状态。按照不同的目的和意义可分类为：同源性嵌合体（又称“马赛克”）和异源性嵌合体（又称“开米拉”）1；先天性嵌合体和获得性嵌合体；血型嵌合体和器官嵌合体。目前嵌合体的研究主要集中在骨髓和造血干细胞移植，产前遗传性疾病的诊断分析方面，但是在输血研究方面，国内还鲜有文献报道。近期本室发现4例血型嵌合体患者，现报告如下。材料与方法1 病例材料 患者1，女，53岁，无输血史，有妊娠史，脑膜瘤，送本室鉴定ABO血型。患者2，女，81岁，无输血史，有妊娠史，卵巢和子宫肌瘤，送本室鉴定RhD血型，患者3，男，73岁，无输血史，前列腺增生，送本室鉴定ABO血型和RhD血型。患者4，女，27岁，无输血史，妊娠史不详，妊娠水肿，送本室鉴定ABO血型。送检血样均为EDTA抗凝血样2 mL。2 试剂与仪器 2.1 血清学试剂：抗-A（批号：102141）、抗-B（批号：204141）由美国Immucor公司提供；反定型细胞（批号：20185309）由上海血液生物医药有限责任公司提供；IgM抗-D（批号：V187175）由Baso公司提供；抗-A1（批号：8000215024）、抗-H（批号：8000230758）由荷兰Sanquin公司提供；直抗分型卡（批号：50560.78.04）、ABD复检卡（批号：50063.83.01）由美国Bio-Rad公司提供；Rh血型卡（批号：201802008）由江苏力博医药生物技术股份有限公司提供；0.01M DTT、人源ABO抗体由本室自临床输血与检验2023年6月第25卷第3期343取基因型分别为R1R2、R1R1、R2R2、AA、AO、BO、AB、BB的血样分别提取DNA，作标准品使用。3.5.2 ABO、Rh血型嵌合体的确认：患者1和标准品DNA浓度保持一致，DNA浓度要求：（702）ng/L，同时进行荧光PCR试验（所需引物及扩增程序为实验室自行设计研发），进行熔解曲线荧光值的比较，利用不同温度下形成的熔解曲线，确认患者1是否为嵌合体血型。结 果1 ABO和Rh血型 结果见表1和表2。2 毛细管离心 结果见表3和表4，结果显示毛细管离心前、后4个患者的ABO和Rh血型均无变化。3 吸收试验 患者1和患者3用抗-A吸收、患者4用抗-B吸收、患者2用抗-D吸收，对吸收后不凝集红细胞分别做ABO和Rh分型；同时用DTT处理凝集红细胞后分别做ABO和Rh血型。结果见表5。血清学结果显示患者1为B、CCDee/AB、CcDEe血型嵌合；患者2为B、CCdee/B、CcDEe血型嵌合;患者3为B、Ccdee/AB、CcDee血型嵌合；患者4为B、CCDee/O、CcDEe血型嵌合。4 分子生物学结果4.1 ABO血型嵌合确认：我们利用A基因特异性引物分别对标准AA型、AB型、OO型和患者1进行定量扩增（模板DNA浓度一致），结果显示荧光值：AA型AB型患者1OO型，结果如图1所示，同理，利用B基因特异性引物分别对标准BB型、AB型、OO型和患者1进行定量扩增（模板DNA浓度一致），结果显示荧光值：BB型患者1AB型OO型，结果如图2所示。制；KA-2200离心机（日本久保田）、Kubota 3220毛细管离心机（日本久保田）；孵育器、离心机（美国Bio-Rad公司）。2.2 分子生物学试剂：核酸提取 DNA的提取在血样采集后12小时内完成，核酸提取运用磁性微珠分离技术（chemagic Magnetic Separation Module I），使用磁珠试剂（Prepito DNA Blood 250 Kit，Chemagen，Germany）在全自动核酸提取仪（Chemagic Prepito，Chemagen，Germany）完成，核酸样本保存于40直至分子生物学分析。荧光PCR和基因测序引物为本试验室依据GENBENK数据库自行设计，荧光定量PCR扩增仪（美国ABI）。3 方法3.1 ABO、RhD血型鉴定：使用试管法、血型复检卡按操作规程鉴定。3.2 Rh分型：使用Rh分型卡，按照试剂说明书进行操作。3.3 吸收试验（分离两群红细胞）：患者1和患者3红细胞用人源抗-A试剂吸收；对患者2红细胞用IgM抗-D试剂吸收；对患者4红细胞用人源抗-B试剂吸收。对吸收后不凝集红细胞应用试管法、微柱凝集卡做ABO血型鉴定和Rh分型；吸收后凝集红细胞用0.2M DTT处理后，分别做ABO和Rh血型鉴定。3.4 毛细管离心：将患者靠近白膜层的红细胞用生理盐水洗涤3遍后，取压积红细胞，充分混匀，加至毛细管中离心，取近心端5 mm内红细胞进行ABO和Rh血型鉴定。3.5 分子生物学检测方法3.5.1 标准品的制备：分别选取A型、B型、O型、AB型RhD样本，应用荧光PCR方法，鉴定其基因型，选 表1 患者1、2、3、4的ABO血型血清学结果（试管法）患者抗-A抗-B抗-A1抗-HAcBcOc自身14+mf4+4+mf1+0000204+/1+4+00034+mf4+4+mf1+0000404+mf/2+4+000注：mf表示混合外观。表2 患者1、2、3、4的Rh血型血清学结果（Rh分型卡）患者抗-C抗-c抗-D抗-E抗-e14+4+dcp4+4+dcp4+24+4+dcp4+dcp4+dcp4+34+4+4+dcp04+44+4+dcp4+4+dcp4+注：dcp表示混合外观。J Clin Transfus Lab Med,June.2023,Vol 25,No.3344 表4 患者1、2、3、4毛细管离心前后Rh分型卡结果患者毛细管离心抗-C抗-c抗-D抗-E抗-e1前4+4+dcp4+4+dcp4+后4+4+dcp4+4+dcp4+2前4+4+dcp4+dcp4+dcp4+后4+4+dcp4+dcp4+dcp4+3前4+4+4+dcp04+后4+4+4+dcp04+4前4+4+dcp4+4+dcp4+后4+4+dcp4+4+dcp4+表5 患者1、2、3、4吸收后不凝集和凝集红细胞ABO和Rh血型结果患者吸收试剂红细胞抗-A抗-B抗C抗-c抗-D抗-E抗-e结论1抗-A不凝集04+4+04+04+B/CCDee凝集4+4+4+4+4+4+4+AB/CcDEe2抗-D不凝聚04+4+0004+B/CCdee凝集04+4+4+4+4+4+B/CcDEe3抗-A不凝集04+4+4+004+B/Ccdee凝集4+4+4+4+4+04+AB/CcDee4抗-B不凝集004+4+4+4+4+O/CcDEe凝集04+4+04+04+B/CCDee4.2 Rh血型嵌合确认：分别利用C、c、E、e特异性引物扩增患者1和R1R1、R2R2、R1R2，结果如图3、图4、图5、图6所示，表明患者在RhCE基因上存在嵌合现象。表3 患者1、2、3、4毛细管离心后ABO血型卡结果患者毛细管离心抗-A抗-B1前4+dcp4+后4+dcp4+2前04+后04+3前4+dcp4+后4+dcp4+4前04+dcp后04+dcp讨 论血型嵌合现象最早在1952年被发现，但截至现在被证实的先天性嵌合体血型全世界仅有70余例2-4，究其原因，此类人群由于嵌合体产生的机制并不影响其正常生活，多数是在大量标本的血型检测和HLA的分型过程中被发现的，同时由于检测人员水平的影响和检测技术的限制，笔者认为某些嵌合体现象在实际工作中可能大部分被漏检，并未被及时发现。嵌合体血型在人群中存在的频率，相对于现有的报道可能存在被低估的现象。本室目前发现的4例血型嵌合体，患者1、患者2、患者4同时存在ABO和Rh两个系统的血型嵌合，患者2为Rh血型系统嵌合。血型嵌合现象主要是指在患者体内同时存在两种细胞系，在进行ABO血型鉴定时会出现混合视野的情况，而毛细管离心技术可以有效区分患者的自身细胞和输入细胞，该技术目前被广泛被用于输血后红细胞血型的定型和临床输血不良反应的调查，其原理是利用新生红细胞比重小于陈旧红细胞而进行离心分离。本实验室应用此项技术对患者嵌合体现象进行检测，由于4例患者体内均存在两种细胞系，经毛细管离心后，前后结果一致，确认4例患者均无近期输血史，患者1患脑膜瘤、患者3患前列腺增生、患者4妊娠水肿，这些疾病均不会导致患者A、B抗原减弱，患者2患妇科肿瘤，同样也不会导致RhD抗原的减弱，因此，经血型血清学实验后，怀疑此四例患者为嵌合体血型。嵌合体血型是指患者体内同时存在两个临床输血与检验2023年6月第25卷第3期345注：绿色线为标准品AA荧光曲线；红色为标准品AB荧光曲线；紫色线为患者1荧光曲线；蓝色线为标准品OO荧光曲线。图1 A基因特异性引物扩增结果 注：黄色线为标准品BB荧光曲线；绿色线为患者荧光曲线；粉色线为标准品AB荧光曲线。图2 B基因特异性引物扩增结果细胞系，我们有选择性的用抗-A、抗-B和抗-D做吸收试验，再分别检测凝集和不凝集红细胞的ABO和Rh血型，结果分别为：患者1为B、CCDee/AB、CcDEe血型嵌合；患者2为B、CCdee/B、CcDEe血型嵌合;患者3为B、Ccdee/AB、CcDee血型嵌合；患者4为B、CCDee/O、CcDEe血型嵌合。在同一个PCR反应体系中，如果DNA的浓度是一致的，那么基因型为AA型时，A型等位基因占100%；基因型为AB时，A型等位基因占50%；基因型为BB型时，A型等位基因占0%；如果基因型为ABB时，则A型等位基因占33%，同理，B型等位基因分别占0%，50%，100%和67%。应用此原理，我们可以分别对A基因和B基因进行特异性引物的扩增，在同一个PCR反应体系中，比较AA型、AB型、OO型和疑似嵌合体患者的熔解曲线的荧光值，以区分此患者是否存在ABO血型嵌合现象。同样，我们应用此原理，分别对C、c、E、e进行特异性引物的扩增，在同一个PCR反应体系中，比较R1R2、R1R1、J Clin Transfus Lab Med,June.2023,Vol 25,No.3346注：绿色为标准品R2R2荧光曲线；亮绿色为患者1荧光曲线；绿色为标准品R1R2荧光曲线；粉色为标准品R1R1荧光曲线。图4 c特异性引物扩增结果注：亮蓝色为标准品R1R1荧光曲线；粉色为患者1荧光曲线；红色为标准品R1R2荧光曲线；绿色为标准品R2R2荧光曲线。图3 C基因特异性引物扩增结果R2R2和疑似Rh血型嵌合体患者的熔解曲线的荧光值，以区分患者是否存在Rh血型的嵌合现象。本研究中我们以患者1为例进行了分子生物学确认。患者1对A等位基因进行特异性扩增后，熔解度曲线比较为AA型AB型患者1OO型，提示患者1A型等位基因数量低于50%；对B等位基因进行特异性扩增后，熔解度曲线比较为BB型患者1AB型OO型，提示患者1B型等位基因数量高于50%；同理对C、c、E、e进行特异性引物的扩增后，患者1C、e等位基因数量高于50%，c、E等位基因数量低于50%，所有分子生物学结果表明患者1在ABO和Rh血型上同时存在嵌合体现象。对于血型嵌合体检测，我们的经验是：应用毛细血管离心技术可以确认患者是否有近期输血史，如果毛细管离心前后患者血型一致，且同时存在混合视野凝集现象，那么就排除患者因输血导致混合外观的可能，进而怀疑患者存在血型嵌合现象。应用人源抗-A、抗-B和单克隆IgM抗-D吸收患者红细胞后，临床输血与检验2023年6月第25卷第3期347注：黄色为标准品R2R2荧光曲线；蓝色为患者1荧光曲线；粉色为标准品R1R2荧光曲线；绿色为标准品R1R1荧光曲线。图5 E特异性引物扩增结果可以分离两组不同抗原的红细胞，同时对不凝集和凝集红细胞进行ABO和Rh血型鉴定。ABO血型和Rh血型基因在两条不同的染色体上，同时存在两条染色体突变的现象是极为罕见的，但就本室目前发现的4例血型嵌合体而言，有3例患者均同时存在ABO和Rh血型的嵌合现象，这是否提示嵌合体患者其基因突变形式是存在异常的5，这有待后续实验进一步研究。曾有报道指出，嵌合体患者除ABO和Rh血型外，其他例如Kidd、MNS和Duffy等血型系统也可能存在嵌合现象1，但本室发现的4例患者未做其他系统血型。在输血策略上，从理论上讲，ABO血型和Rh血型的选择可按抗原多的一组细胞血型输血，患者1按AB、RhD阳性；患者2按B、RhD阳性；患者3按AB、RhD阳性；患者4按B、RhD阳性输血。利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突参 考 文 献 1 喻琼,郑岩.嵌合体血型的研究进展J.中国输血杂志,2010,23(2):146-148.注：黄色为标准品R2R2荧光曲线；蓝色为患者1荧光曲线；粉色为标准品R1R2荧光曲线；紫色为标准品R1R1荧光曲线。图6 e特异性引物扩增结果 J Clin Transfus Lab Med,June.2023,Vol 25,No.33482 STRAIN L,WARNER J P,JOHNSTON T,et al.A human parthenogenetic chimaeraJ.Nat Genet,1995,11(2):164-169.3 DREXLER C,GLOCK B,VADON M,et al.Tetragametic chimerism detected in a healthy woman with mixed-field agglutination reactions in ABO blood groupingJ.Transfusion,2005,45(5):698-703.4 CHO D,LEE S K,YAZER M H,et al.A dispermic Chimera with mixed field blood group B and mosaic 46,XY/47,XYY karyotypeJ.J Korean Med Sci,2007,22(3):553.5 杨宝成,喻琼,苏宇清,等.一个AB型开米拉家系遗传状态的研究J.中国实验血液学杂志,2007,15(2):417-420.（收稿日期：2023-03-13）（本文编辑：张媛媛）DOI：10.3969/j.issn.1671-2587.2023.03.010*本课题受山东省济南市临床医学科技创新计划（No.202225073）资助作者单位：250031 中国人民解放军联勤保障部队第九六医院骨科（张强，岳宪虎，李瑞）；中国人民解放军联勤保障部队第九六医院输血医学科（黄象艳）作者简介：张强，主任医师，博士，主要从事关节镜与运动医学方面的研究，（E-mail）。通信作者：黄象艳，主任技师，博士，主要从事输血检验和临床输血相关研究，（E-mail）。论著富血小板血浆在髌骨外侧高压症治疗中的应用*张强 岳宪虎 李瑞 黄象艳 【摘要】目的 研究单采自体富血小板血浆（platelet-rich plasma,PRP）联合外侧支持带松解（lateral retinacular release,LRR）治疗髌骨外侧高压症（lateral patellar compression syndrome,LPCS）的临床疗效。方法 回顾性分析2018年8月2021年4月在我院骨科治疗的符合纳入标准的髌骨外侧高压症患者15例（22膝），分为试验组和对照组。试验组行关节镜下LRR术，术后予以单采自体PRP关节腔注射（单膝注射剂量5 mL，7天注射1次，3次为一个疗程）；对照组仅行关节镜下LRR术。采用视觉模拟评分法（VAS）、髌股关节Kujala评分法对不同治疗方法的治疗效果进行比较。通过MRI影像学进一步评估试验组的治疗效果。结果 随访时间1213（12.40.5）月。手术前后VAS评分结果：试验组分别为5.640.54，1.460.28；对照组分别为5.460.37，2.550.28。试验组Kujala评分从手术前的61.094.40增加到手术后的90.731.94；对照组Kujala评分从手术前的66.823.84增加到手术后的82.822.53。两组患者术后膝关节疼痛症状及髌股关节功能评分均较术前显著改善（P0.000 1），而且试验组VAS评分和Kujala评分优于对照组（P0.05）。MRI随访显示，试验组治疗后髌骨及股骨外髁骨髓水肿的容积减小。结论 单采自体PRP关节腔注射联合LRR是治疗LPCS的有效手段。【关键词】髌骨外侧高压症 外侧支持带松解 血细胞分离单采 富血小板血浆 【中图分类号】R874.5 【文献标识码】A 【文章编号】1671-2587（2023）03-0348-06Platelet-rich Plasma as a Treatment for Lateral Patellar Compression Syndrome ZHANG Qiang,YUE Xianhu,LI Rui,et al.Department of Orthopaedics,the 960th Hospital of the PLA Joint Logistice Support Force,Jinan,Shandong 250031【Abstract】Objective To explore the clinical efficacy of autologous apheresis platelet-rich plasma(PRP)combined with lateral retinacular release(LRR)for the treatment of lateral patellar compression syndrome(LPCS).Methods A total of 15 patients(22 knees)with LPCS who met the inclusion criteria from August 2018 to April 2021 were retrospectively analyzed.They were divided into the experimental group and the control group.The experimental group underwent arthroscopic LRR surgery,followed by intra-articular injection of autologous PRP(5 mL injection per knee,once every 7 days,3 times as a course).The control group only underwent arthroscopic LRR surgery.Visual analog scale(VAS)and Kujala score were used to compare the therapeutic effects.The therapeutic effect of the experimental group was further evaluated by MRI imaging.Results The follow-up time was 1213(12.40.5)months.VAS score before and after operation was 5.640.54 and 1.46 0.28 in the experimental group,respectively,5.460.37 and 2.550.28 in the control group.Kujala score increased from 61.094.40 to 90.731.94 in the experimental group.Kujala score increased from 66.823.84 to 82.822.53 in the control