不同肝组织炎症分级和纤维化分期的自身免疫性肝炎患者外周血单个核细胞TLR2和CTLA-4水平变化研究.pdf

基金项 目:湖 北 省 科 技 厅 科 研 基 金 资 助 项 目(编 号:WJ2020M080)作者单位:428000 湖北省黄冈市中心医院消化内科(黄静,王菁);黄冈市中医院超声科(商惠民);武汉大学中南医院消化内科(周娟)第一作者:黄静,女,45 岁,大学本科,主治医师。E-mail:自身免疫性肝病不同肝组织炎症分级和纤维化分期的自身免疫性肝炎患者外周血单个核细胞 TLR2 和 CTLA-4 水平变化研究黄 静,商惠民,王 菁,周 娟【摘要】目的 调查不同肝组织炎症分级和纤维化分期的自身免疫性肝炎(AIH)患者外周血单个核细胞(PBMCs)Toll 样受体 2(TLR2)和细胞毒性 T 淋巴细胞相关抗原 4(CTLA-4)水平变化。方法 2018 年 6 月 2022 年 6 月我院诊治的 47 例 AIH 患者和同期 50 例健康人,所有 AIH 患者接受肝活检。抽取外周血,分离 PBMCs,采用 PCR 法检测 PBMCsTLR2 和 CTLA-4 mRNA 水平,使用流式细胞仪检测 TLR2 和 CTLA-4 阳性的 PBMCs 百分比。结果AIH 患者 PBMCsTLR2 mRNA 水平和细胞表面 TLR2 阳性的 PBMCs 百分比分别为(1.70.4)和(34.27.9)%,均显著高于健康人【分别为(0.90.2)和(21.43.5)%,P0.05】,而 PBMCs CTLA-4 mRNA 水平和细胞表面 CTLA-4 阳性的 PBMCs 百分比分别为(0.50.2)和(2.30.8)%,均显著低于健康人【分别为(1.10.2)和(13.73.9)%,P0.05】;21 例肝组织 G3/G4 级患者 TLR2 mRNA 水平和细胞表面 TLR2 阳性的 PBMCs 百分比分别为(1.90.3)和(37.25.7)%,均显著高于26 例 G1/G2级患者【分别为(1.50.3)和(30.56.2)%,P0.05】,而 PBMCs CTLA-4 mRNA 水平和细胞表面 CTLA-4 阳性的 PBMCs百分比分别为(0.30.1)和(1.90.6)%,均显著低于 G1/G2 级患者【分别为(0.70.2)和(2.60.8)%,P0.05】;17 例肝组织 F3/F4 期患者 TLR2 mRNA 水平和细胞表面 TLR2 阳性的 PBMCs 百分比分别为(1.90.3)和(37.65.3)%,均显著高于 25 例 F1/F2 期患者【分别为(1.60.3)和(32.94.2)%,P0.05】或 5 例 F0 期患者【分别为(1.30.2)和(28.71.9)%,P0.05】,而 PBMCs CTLA-4 mRNA 水平和细胞表面 CTLA-4 阳性的 PBMCs 百分比分别为(0.30.1)和(1.80.6)%,均显著低于 F1/F2 期患者【分别为(0.60.2)和(2.30.7)%,P0.05】或 F0 期患者【分别为(0.90.2)和(4.20.4)%,P0.05】。结论 AIH 患者 PBMCs TLR2 mRNA 和 TLR2 阳性的 PBMCs 百分比升高,而 PBMCs CTLA-4 mRNA 水平和 CTLA-4 阳性的 PBMCs 百分比降低,并与肝组织炎症活动度和纤维化程度相关,值得进一步研究。【关键词】自身免疫性肝炎;外周血单个核细胞;Toll 样受体 2;细胞毒性 T 淋巴细胞相关抗原 4;病理学特征 DOI:10.3969/j.issn.1672-5069.2023.05.014 Changes of peripheral blood mononuclear cell TLR2 and CTLA-4 in patients with autoimmune hepatitisHuang Jing,Shang Huimin,Wang Jing,et al.Department of Gastroenterology,Central Hospital,Huanggang 428000,Hubei Province,China【Abstract】Objective The aim of this study was to analyze the changes of peripheral blood mononuclear cell(PBMC)Toll-like receptor 2(TLR2)and cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4(CTLA-4)in patients with autoimmune hepatitis(AIH).Methods 47 patients with AIH and 50 healthy subjects were encountered in our hospital between June 2018 and June2022,and all patients with AIH received liver biopsies.The peripheral blood was drawn for separation of PBMCs,the TLR2 andCTLA-4 mRNA in PBMCs were detected by PCR,and the percentages of TLR2 and CTLA-4 positive PBMCs were detected byflow cytometry.Results The PBMC TLR2 mRNA level and the percentage of TLR2 positive PBMCs in patients with AIH were(1.70.4)and(34.27.9)%,both significantly higher than(0.90.2)and(21.43.5)%,respectively,P0.05,whilethe PBMCs CTLA-4 mRNA level and the percentage of CTLA-4 positive PBMCs were(0.50.2)and(2.30.8)%,bothsignificantly lower than(1.10.2)and(13.73.9)%,respectively,P0.05 in healthy persons;the PBMC TLR2 mRNAlevel and the percentage of TLR2 positive PBMCs in 21 AIH patients with grade G3/G4 were(1.90.3)and(37.25.7)%,bothmuch higher than(1.50.3)and(30.56.2)%,respectively,P0.05 in 26 AIH patients with grade G1/G2,while thePBMCs CTLA-4 mRNA level and the percentage of CTLA-4 positive PBMCs were(0.30.1)and(1.90.6)%,both muchlower than(0.70.2)and(2.60.8)%,respectively,P0.05 in patients with G1/G2;the PBMC TLR2 mRNA leveland the percentage of TLR2 positive PBMCs in 17 AIH patientswith stage F3/F4 were(1.90.3)and(37.65.3)%,bothmuch higher than(1.6 0.3)and(32.9 4.2)%,respectively,P 0.05 in 25 patients with stage F1/F2 or(1.30.2)and(28.71.9)%,respectively,P0.05 in 5patients without liver fibrosis,while the PBMCs CTLA-4 mRNA856实用肝脏病杂志 2023 年 9 月第 26 卷第 5 期 J Prac Hepatol,September.2023.Vol.26 No.5level and the percentage of CTLA-4 positive PBMCs were(0.30.1)and(1.80.6)%,both much lower than(0.60.2)and(2.30.7)%,respectively,P0.05 in patients with stage F1/F2 or(0.90.2)and(4.20.4)%,respectively,P0.05)。本研究获得我院医学伦理委员会批准,患者签署知情同意书。1.2 肝活检常规对 AIH 患者行肝穿刺检查,肝组织炎症活动度分为 G1 G4 级,肝纤维化程度分为F1 F4 期9。根据界面破坏范围和细胞浸润程度,分为:轻度:局部或少数门管区被破坏;中度:50%门管区被破坏或纤维间隔形成;重度:50%门管区被破坏或纤维间隔形成。1.3 PBMCs TLR2 和 CTLA-4 mRNA 检测采集空腹静脉血,使用淋巴细胞分离液(中国科学院天津试剂厂)和采用 Ficoll 密 度 梯 度 离 心 法 分 离 得 到PBMCs,4冷藏、备用。采用 Trizol 法提取 PBMCs总 RNA,使用紫外分光光度计(美国 Thermo 公司)检测并记录总 RNA 浓度和纯度。使用逆转录试剂盒(FINNZYMES 公司)将总 RNA 逆转录为 cDNA。取cDNA,建立 20L 反应体系,行 PCR 扩增。TLR2 上游引物(上海生工生物公司)为 5-TTTGCTGGACT-TACCTTCCTTG-3,下游为 5-CAGTATCTCGCAGT-TCCAAACA-3;CTLA-4 上游引物(上海生工生物公司)为 5-GACCAGGGACTCTACATCTGC-3,下游为 5-TCACATTCTGGCTCTGTTGG-3。PCR 反应如下:95 5 min,94 30 s,57 60 s,72 60 s,共35个循环。PCR 扩增产物经 2%琼脂糖凝胶(北京瑞达恒辉科技发展有限公司)电泳,计算 TLR2 和CTLA-4 mRNA 相对水平,以 2-Ct表示。1.4 PBMCs 表面 TLR2 和 CTLA-4 表达水平检测使用美国贝克曼 CytoFLEX 流式细胞仪检测 PBMCs表面 TLR2 和 CTLA-4 表达水平,抗体均购自美国BD 公司。1.5 统计学方法 应用 R 4.1.2 软件进行统计学分析。对计量资料先行 Shapiro-Wilk 检验,判断是否服从正态分布。对符合正态分布者,以(xs)表示,采用 t 检验。P0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1 两组 PBMCs 和细胞表面 TLR2 和 CTLA-4 比较956实用肝脏病杂志 2023 年 9 月第 26 卷第 5 期 J Prac Hepatol,September.2023.Vol.26 No.5AIH 患者 PBMCs TLR2 mRNA 水平和 TLR2 阳性的细胞百分比显著高于健康人,而 PBMCs CTLA-4mRNA 水平和 CTLA-4 阳性的细胞百分比显著低于健康人(P0.05,表 1)。表 1 两组 PBMCs 和细胞表面 TLR2 和 CTLA-4(xs)比较例数细胞 mRNATLR2CTLA-4细胞表面TLR2(%)CTLA-4(%)AIH471.70.40.50.234.27.92.30.8健康人500.90.21.10.221.43.513.73.9 与健康人比,P0.052.2 不同病情严重程度的 AIH 患者 PBMCs TLR2 和CTLA-4 水平及表面分子阳性细胞百分比比较重度 AIH 患者 PBMCs TLR2 mRNA 水平和 TLR2 阳性的 PBMCs 百分比显著高于中度或轻度患者(P 0.05),而 PBMCs CTLA-4 mRNA 水平和 CTLA-4 阳性的 PBMCs 百分比显著低于中度或轻度患者(P0.05,表 2)。表 2 不同病情患者细胞 TLR2 和 CTLA-4 mRNA 水平及表面分子阳性细胞百分比(xs)比较例数TLR2 mRNACTLA-4 mRNATLR2(%)CTLA-4(%)轻度151.40.30.60.226.23.92.60.5中度241.70.40.50.135.65.32.30.3重度82.20.30.30.145.210.81.70.3 与轻度比,P0.05;与中度比,P0.052.3 不同肝组织炎症分级的 AIH 患者细胞 TLR2 和CTLA-4 mRNA 水平及表面分子阳性细胞百分比比较 肝组织 G3/G4 级患者 PBMCs TLR2 mRNA 水平和 TLR2 阳性的 PBMCs 百分比显著高于 G1/G2 级,而 PBMCs CTLA-4 mRNA 水平和 CTLA-4 阳性的PBMCs 百分比显著低于 G1/G2 级(P0.05,表 3)。表 3 不同炎症分级患者细胞 TLR2 和 CTLA-4 mRNA 水平及表面分子阳性细胞百分比(xs)比较炎症分级例数TLR2 mRNACTLA-4 mRNATLR2(%)CTLA-4(%)G1/G2261.50.30.70.230.56.22.60.8G3/G4211.90.30.30.137.25.71.90.6 与 G1/G2 级比,P0.052.4 不同肝纤维化分期的 AIH 患者细胞 TLR2 和CTLA-4 mRNA 水平及表面分子阳性细胞百分比比较 肝组织 F3/F4 期患者 PBMCs TLR2 mRNA 水平和 TLR2 阳性的 PBMCs 细胞百分比显著高于 F1/F2期或 F0 期,而 PBMCs CTLA-4 mRNA 水平和 CTLA-4 阳性的 PBMCs 百分比显著低于 F1/F2 期或 F0 期(P0.05,表 4)。表 4 不同肝纤维化分期患者细胞 TLR2 和 CTLA-4 mRNA 水平及表面分子阳性细胞百分比(xs)比较例数TLR2 mRNACTLA-4 mRNATLR2(%)CTLA-4(%)F0 期51.30.20.90.228.71.94.20.4F1/F2 期251.60.30.60.232.94.22.30.7F3/F4 期171.90.30.30.137.65.31.80.6 与 F0 期比,P0.05;与 F1/F2 期比,PG 位点基因多态性与AIH 易感性有关,可能与 CTLA4 基因突变降低了CTLA-4 mRNA 水平或导致 CTLA4 蛋白结构的修饰改变有关。本研究发现不同病情严重程度、不同肝组织炎症分级和不同肝纤维化程度的 AIH 患者 PB-MCs TLR2 和 CTLA-4 均存在显著性差异,并与肝组织炎症分级和纤维化分期存在明显的关联,提示随着病情加重、炎症程度加深和纤维化加剧,AIH 患者PBMCs TLR2 mRNA 水平越高,而 CTLA-4 阳性的PBMCs 百分比越低。国外研究20表明,相较于健康人,AIH 患者血清 TLR2 明显升高,且与细胞因子水平有关。他们认为 AIH 发病与单核细胞 TLR2/TLR4 通路被激活有关,该通路被激活后可导致肝组织炎症小体增多,引起过度炎症反应,损伤肝组织,同时驱动相关炎症性细胞因子分泌,调节 T 细胞表型,造成 T 淋巴细胞功能障碍。TLR2 相关信号通路被激活可刺激巨噬细胞功能,促进肝星状细胞增殖,加剧肝纤维化,提示 TLR2 与肝组织纤维化程度有关21-23。TLR2 相关通路可调控多条炎症通路和相关的细胞因子水平,参与了 AIH 患者肝组织炎症和纤维化进程。【参考文献】1Komori A.Recent updates on the management of autoimmune hepa-titis.Clin Mol Hepatol,2021,27(1):58-69.2Weiler-Normann C,Lohse AW.Autoimmune hepatitis:from im-munopathogenesis to diagnostic and therapeutic innovation.CurrOpin Gastroenterol,2021,37(2):86-90.3Sirbe C,Simu G,Szabo I,et al.Pathogenesis of autoimmune hepa-titis-cellular and molecular mechanisms.Int J Mol Sci,2021,22(24):13578.4Cai T,Xu L,Xia D,et al.Polyguanine alleviated autoimmune hep-atitis through regulation of macrophage receptor with collagenousstructure and TLR4-TRIF-NF-B signalling.J Cell Mol Med,2022,26(22):5690-5701.5Mo R,Feng XX,Wu YN,et al.Hepatocytes paradoxically affectintrahepatic IFN-production in autoimmune hepatitis due to Gal-9 expression and TLR2/4 ligand release.Mol Immunol,2020,123:106-115.6Li Y,Sun Y,Liu Y,et al.Genome-wide meta-analysis identifiessusceptibility loci for autoimmune hepatitis type 1.Hepatology,2022,76(3):564-575.7Czaja AJ.Immune inhibitory proteins and their pathogenic and ther-apeutic implications in autoimmunity and autoimmune hepatitis.Au-toimmunity,2019,52(4):144-160.8中华医学会肝病学分会,中华医学会消化病学分会,中华医学会感染病学分会.自身免疫性肝炎诊断和治疗共识(2015 年).中华传染病杂志,2016,34(4):193-208.9中华医学会肝病学分会.自身免疫性肝炎诊断和治疗指南(2021 年).中华内科杂志,2021,60(12):1038-1049.10 Suarez-Quintero CY,Patarroyo Henao O,Muoz-Velandia O.Con-cordance betweenhepatic biopsy and the APRI index(AST to plateletratio index)for the diagnosis of cirrhosis in patients with autoimmuneliver disease.Gastroenterol Hepatol,2021,44(7):465-471.11 居峰,姚上志,王栋,等.自身免疫性肝炎患者血清白细胞分化抗原 38 和白细胞介素 21 水平变化及其临床意义探讨.实用肝脏病杂志,2022,25(6):824-827.12 Covelli C,Sacchi D,Sarcognato S,et al.Pathology of autoimmunehepatitis.Pathologica,2021,113(3):185-193.13 陈世赓,周光文.自身免疫性肝炎肝硬化的临床诊治进展.中华普通外科杂志,2021,36(5):393-396.14 Razin M,Abdel-Ghaffar AB,Hamdy GM,et al.TLR3 TLR7 asdifferentially expressed markers among viral,nonviral,and autoim-mune diseases in Egyptian patients.Viral Immunol,2021,34(9):607-621.15 Andrews LP,Yano H,Vignali DAA.Inhibitory receptors and lig-ands beyond PD-1,PD-L1 and CTLA-4:breakthroughs or back-ups.Nat Immunol,2019,20(11):1425-1434.16 Bengsch B,Thimme R.Success of immune checkpoint blockadetherapies-mechanisms and implications for hepatology.Z Gastroen-terol,2019,57(1):74-86.17 Marks KE,Cho K,Stickling C,et al.Toll-like receptor 2 in auto-immune inflammation.Immune Netw,2021,21(3):e18.18 卢喜玲,刘俊平,曹永革,等.重症肝病合并腹腔感染患者 TLR2和 TLR4mRNA 水平及其应用价值.中华医院感染学杂志,2020,30(20):3071-3075.19 Chaouali M,Carvalho A,Tezeghdenti A,et al.Cytotoxic T lympho-cyte antigen-4 gene polymorphisms and susceptibility to type 1 au-toimmune hepatitis in the Tunisian population.Genes Dis,2017,5(3):256-262.20 Arterbery AS,Yao J,Ling A,et al.Inflammasome primingmediated via Toll-like receptors 2 and 4,induces Th1-like regula-tory T cells in de novo autoimmune hepatitis.Front Immunol,2018,9:1612.21 Xie X,Lyu H,Liu C,et al.HBeAg mediates inflammatory func-tions of macrophages by TLR2 contributing to hepatic fibrosis.BMCMed,2021,19(1):247.22 Silva RCP,da Silva RPC,Souto FO,et al.Extract from Ascaris su-um and N-acetyl-L-cysteine induces an immunosuppressant effectin model of autoimmune hepatitis.Parasite Immunol,2021,43(6):e12826.23 Fadriquela A,Kim CS,Lee KJ,et al.Soluble type immune check-point regulators using multiplex luminex immunoassay in chronichepatitis B patients,J Clin Pathol,2021,74(12):780-786.(收稿:2023-01-06)(本文编辑:刘波)166实用肝脏病杂志 2023 年 9 月第 26 卷第 5 期 J Prac Hepatol,September.2023.Vol.26 No.5