FoxM1靶向肽9R-P49对L929成纤维细胞的抑制作用及机制.pdf

doi:10.3969/j.issn.2095-1736.2023.04.031FoxM1 靶向肽 9R-P49 对 L929 成纤维细胞的抑制作用及机制常 苗,项 坤,何佳萌,梁安平,花欣怡,刘新荣,江育虹,茆灿泉(西南交通大学 生命科学与工程学院,成都 610031)摘 要 为探究 9R-P49 多肽对 FoxM1 的作用及其对成纤维细胞的调控机制,采用 CCK-8 检测细胞抑制率、AO/EB双染和流式细胞术检测细胞凋亡、Transwell 检测细胞迁移、细胞平板克隆检测细胞增殖;使用 PyMOL 分子对接软件预测 P49 多肽与 FoxM1-DBD 的潜在结合位点;采用 0、30.0 和 60.0 g/mL 的 9R-P49 多肽处理小鼠成纤维 L929 细胞,Western Blot 检测 FoxM1 蛋白的表达,最后通过 RNA 转录组分析差异基因及相关通路。结果表明:在 L929 细胞中 9R-P49 下调 FoxM1 蛋白的表达,同时,9R-P49 能够抑制细胞增殖和迁移、促进细胞凋亡;P49 多肽与 FoxM1-DBD上的 Arg 297、Ser 290 和 Asp 293 位点存在潜在结合;给药处理后转录组差异基因 GO 分类主要富集于细胞过程、单一组织过程、生物调节过程和新陈代谢过程等,KEGG 分类主要富集于免疫系统、内分泌系统、信号转导和新陈代谢等通路。在成纤维 L929 细胞中 9R-P49 能够通过调控 FoxM1 表达抑制 L929 细胞增殖和迁移并促进凋亡。关键词 9R-P49;FoxM1;纤维化;转录组;多肽中图分类号 Q78;R363文献标识码 A文章编号 2095-1736(2023)04-0031-06Inhibition and preliminary mechanisms of a FoxM1-targetingpolypeptide 9R-P49 on fibroblast L929 cellsCHANG Miao,XIANG Kun,HE Jiameng,LIANG Anping,HUA Xinyi,LIU Xinrong,JIANG Yuhong,MAO Canquan School of Life Science and Engineering Southwest Jiaotong University Chengdu 610031 China Abstract To explore the regulatory effect of 9R-P49 peptide on FoxM1 and its preliminary mechanism on fibroblast L929 cells CCK-8 was used to detect cell inhibition rate AO/EB double staining and flow cytometry to detect cell apoptosis transwell assay to detect cell migration and cell plate clone to detect cell proliferation.The potential binding sites of the P49 peptide to FoxM1-DNA binding do-main FoxM1-DBD were predicted using PyMOL molecular docking software.Mouse fibroblast L929 cells were treated with 0 30.0 and 60.0 g/mL 9R-P49 peptide and the expression of FoxM1 protein was detected by Western Blot.Finally the differential ex-pressed genes and related pathways were analyzed by RNA transcriptome.The results showed that 9R-P49 could inhibit FoxM1 protein expression in L929 cells.At the same time 9R-P49 could inhibit cell proliferation and promote cell apoptosis of L929 cells.P49 pep-tide binds potentially to the Arg 297 Ser 290 and Asp 293 sites on FoxM1-DBD.The GO classification of differentially expressed genes in the transcriptome after drug treatment was mainly enriched in cellular process single-organism process biological regulation and metabolic process.The KEGG classification was mainly enriched in the immune system endocrine system signal transduction and metabolism pathways.In conclusion 9R-P49 can inhibit the proliferation of L929 cells and promote apoptosis by regulating the expres-sion of FoxM1 in L929 cells.Keywords 9R-P49 FoxM1 fibrosis transcriptome polypeptide 叉头盒(Forkhead box,FOX)蛋白属于进化高度保守的转录因子超家族1,在细胞稳态和发育过程中可13第 40 卷第 4 期2023 年 8 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.2023收稿日期:2022-05-09;最后修回日期:2022-06-09基金项目:国家自然科学基金资助项目(No.81872789);成都市重点研发支撑计划项目(No.2018-YF05-00004-SN)作者简介:常苗,硕士研究生,研究方向为肿瘤靶向多肽药物,E-mail:1624953557 通信作者:茆灿泉,博士,教授,研究方向为生物医药研发,E-mail:maocq 调控多种转录途径并发挥生物学效应2。在 FOX 家族成员中,叉头盒 M1(Forkhead box M1,FoxM1)是一种重要的有丝分裂调控蛋白,在多种细胞(如上皮细胞、T 细胞、B 细胞和树突状细胞)的细胞周期调控中起到重要作用3-4,如通过调控细胞周期蛋白 D1(CC-ND1)、细胞周期蛋白 B1(CCNB1)和 Polo 样激酶 1(PLK1)参与 S/G/M 期转换;同时,FoxM1 也能够通过上调 BIRC5 从而调控有丝分裂纺锤体功能及其抗凋亡活性5。FoxM1 在肺纤维化、心脏纤维化和肝纤维化等纤维化疾病中存在潜在功能,在这些疾病中,FoxM1的表达显著增加,其下游通路及与多种纤维化效应因子相关的信号通路,如 TGF-1/Smad、PI3K/Akt、p38 MAPK 或 WNT/-catenin 均显著上调6-7。针对 FoxM1的靶向调控,大多数研究均集中于大分子蛋白或非编码 RNA 等领域,靶向多肽的研究报道较少。本课题组前期通过噬菌体展示技术筛选和获得能够靶向结合FoxM1 的DNA 结合区(FoxM1-DBD)的P201多肽并显示具有强的抗肿瘤活性8-9。鉴于 FoxM1 表达与纤维化的密切相关性,本研究基于 P201 的优化肽 9R-P49,研究其对 FoxM1 的调控作用及其在成纤维细胞L929 细胞中的作用机制,最后结合转录组数据,探究9R-P49 在成纤维细胞中的生物学功能,为抗纤维化靶向FoxM1 潜在多肽药物的研发提供重要基础。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 细胞小鼠成纤维 L929 细胞由四川大学华西医院教育部移植工程与移植免疫重点实验室提供。1.1.2 试剂与仪器多肽 9R-P49(上海强耀生物科技有限公司合成,纯度98%);胎牛血清、DMEM 高糖培养基、胰蛋白酶(美国 Gibco 公司);Transwell 小室(美国 Corning 公司);CCK-8 细胞增殖检测试剂盒、AO/EB 法细胞凋亡检测试剂盒(江苏凯基生物技术有限公司);Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit(南京诺唯赞生物科技有限公司);BSA、TEMED 及硝酸纤维素滤膜(北京索莱宝科技有限公司);FoxM1、GAPDH 兔源单克隆抗体(英国 Abcam 公司);HRP 标记的山羊抗兔 lgG(武汉三鹰技术有限公司)。酶标仪(美国 Biotek 公司);光学显微镜、荧光倒置显微镜(日本 Olympus 公司);流式分析仪(美国 Beckman 公司)。1.2 方法1.2.1 CCK-8 法检测多肽对 L929 细胞的抑制作用复苏 L929 细胞,不同浓度的 9R-P49 多肽(20.0、30.0、40.0 和 60.0 g/mL)加药处理,培养 12、24、48 h后向每孔加入 10 L 的 CCK-8 检测溶液,置于 37 孵育 2 h,酶标仪在 450 nm 波长处检测每孔吸光值。细胞抑制率=(1-加药组 OD450/对照组 OD450)100%,使用 Grahpad Prism 9 计算 IC50。1.2.2 AO/EB 荧光双染检测细胞凋亡状态良好的 L929 细胞按每孔 2.0105个细胞铺12 孔板,37 培养箱培养约 12 h,不同浓度的 9R-P49(0、30.0 和 60.0 g/mL)处理 L929 细胞 24 h。PBS 洗3 次,AO 溶液和 EB 溶液按 1 1混合成工作液后加入,室温孵育 5 min,于荧光倒置显微镜下观察并拍照。1.2.3 FITC/PI 荧光双染检测细胞凋亡培养 L929 细胞 24 h 后收集培养液,经不含 EDTA的胰酶消化后,离心收集细胞。用预冷的 PBS 洗涤细胞 2 次,加入 Binding Buffer 重悬细胞。再加入 5 L Annexin V-FITC 和 10 L PI Staining Solution,轻轻混匀后避光室温反应 10 min。最后加入 400 L 1Binding Buffer,混匀后置于冰上,用流式细胞仪检测。1.2.4 细胞平板克隆检测细胞增殖将 L929 细胞按每孔 700 个细胞数铺至 6 孔板,37 孵 育 约 24 h,不 同 浓 度 9R-P49(0、30.0 和60.0 g/mL)处理 L929 细胞后每隔 3 d 换液,共处理 2周。到达作用时间后 PBS 洗 3 次,多聚甲醛固定,结晶紫染色,相机拍照,克隆数50 计作一个克隆。1.2.5 Transwell 实验检测细胞迁移L929 细胞培养 24 h,弃培养液,PBS 清洗去除残留培养液,胰酶消化获得细胞,用 DMEM 高糖培养基重悬细胞,计数。按 1104 cell/well 加入 Transwell 上室,体积 200 L,下室加入 600 L 含 10%胎牛血清的培养基,在 37 培养 24 h。到达作用时间后,取出小室,PBS 清洗,4%多聚甲醛固定,0.1%结晶紫染色,光学显微镜下观察并拍照。1.2.6 P49 与 FoxM1-DBD 的分子对接从 PDB 数据库(http:/www.rcsb.org/)中下载FoxM1-DBD 三维结构(PDB ID 为 3G73);Pymol 软件处理蛋白,删除 DNA 双链、删除水分子、给 FoxM1-DBD加氢;将 P49 的序列在 Discovery Studio 2016 中使用Protein Building 功能构建出配体分子;利用 DS2016 进行分子对接,PyMOL 2.3.0 可视化分析结果。1.2.7 Western Blot 检测 FoxM1 蛋白表达复苏 L929 细胞后传代至 12 孔板,37 培养至细胞融合达 70%80%;不同浓度 9R-P49(0、30.0 和60.0 g/mL)处理 L929 细胞 24 h 后用 RAPI 裂解液裂解细胞,提取细胞总蛋白。经 BCA 蛋白定量后,取20.0 g 蛋白,常规 Western Blot 测定。主要实验过程:10%SDS-PAGE 电泳,经转膜、5%脱脂奶粉封闭,一抗孵育FoxM1(11 000)、GAPDH(1 5 000),二抗孵育后,用 ECL 曝光显影。23第 40 卷第 4 期2023 年 8 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.20231.2.8 转录组测序分析不同浓度 9R-P49(0、30.0 和 60.0 g/mL)处理L929 细胞 24 h。到达作用时间后,显微镜下观察细胞,确定生长状态良好(正常细胞融合度在 80%左右),弃去培养基,向培养皿中加入 DEPC-PBS,洗 2 次后弃尽 DEPC-PBS,加入适量 Trizol Reagent 细胞裂解液,反复吸打直至形成清亮不黏稠的细胞裂解液,将裂解好的细胞转移至 1.5 mL 离心管(RNase free)中,送上海伯豪生物技术有限公司进行 mRNA 测序。1.2.9 统计学处理细胞实验均重复 3 次。采用 SPASS 16.0、Image J及 Graphpad Prism 9 软件分析数据,用 Prism 8 软件计算 IC50值和各组数据的平均数和标准差(xs),以 P0.05 和 P0.01 为统计标准,P0.05 被认为具有统计学意义。2 结果与分析2.1 9R-P49 多肽对 L929 细胞的抑制作用CCK-8 结果显示(图 1),随着处理浓度的增加,细胞形态逐渐发生变化,细胞密度减小,皱缩程度增大,细胞碎片逐渐增多,活细胞数量明显减少。依次添加 4 个不同浓度梯度 9R-P49 多肽处理 L929 细胞,随着给药浓度的增大细胞抑制率逐渐变高,并在 40.060.0 g/mL 时达到 100%左右,趋于饱和;同时随着给药处理时间的延长,从 12 h 到 24 h 细胞抑制率呈现增高趋势,48 h 后基本保持稳定。给药处理 12、24 和 48 h 的 IC50依次为(33.591.28)g/mL、(26.921.58)g/mL、(24.852.02)g/mL,12 h 与 24 h 相比差异极显著(P0.01),24 h 与 48 h 相比差异显著(P0.05)。2.2 9R-P49 多肽对 L929 细胞凋亡作用的影响 经 AO/EB 荧光双染细胞主要呈现 3 种形态,即正常细胞核呈现绿染且核结构正常、早期凋亡细胞核呈现新月状或颗粒状的黄-绿染并伴随核染色体片段化、晚期凋亡细胞和死细胞核呈现橙染并伴随着核染色体的固缩等。经 9R-P49 多肽处理 L929 细胞 24 h 后,对照组未见明显的凋亡信号,细胞为绿染;加药处理后细胞中部分被染成黄绿色和橙色,同时随着给药浓度的增加,细胞凋亡信号明显增强(图 2)。进一步流式细胞结果显示(图 3),随着给药浓度的增加,凋亡细胞逐渐增加,在 3 组处理中依次为 1.23%、5.66%、29.72%,加药组与对照组差异均极显著(P0.01)。2.3 9R-P49 多肽对 L929 细胞增殖的作用L929 细胞平板克隆结果显示(图 4),随着给药浓度的增加,细胞形成的克隆斑显著下降,当给药浓度为60.0 g/mL 时,已经无明显的克隆斑。2.4 9R-P49 多肽对 L929 细胞迁移的作用Transwell结果显示,经9R-P49多肽处理L929细(a)9R-P49 处理后 L929 细胞形态(100);(b)9R-P49 不同浓度和时间处理后的细胞抑制率。图 1 CCK-8 法检测 9R-P49 多肽对 L929 细胞的抑制作用(xs,n=3)Figure 1 Inhibitory effect of 9R-P49 polypeptide in L929 cellsdetected by CCK-8 method(xs,n=3)(a)AO/EB 荧光双染;(b)细胞凋亡量化图。为 P0.01。图 2 AO/EB 双染检测 9R-P49 对 L929 细胞的凋亡作用(xs,n=3)Figure 2 AO/EB double staining detection of the apoptosis inL929 cells treated by 9R-P49(xs,n=3)胞 24 h 后,对照组有大量细胞穿过小室且状态良好,给药组穿过细胞大量减少,当浓度为 60.0 g/mL 时,基本无细胞迁移现象(图 5)。33第 40 卷第 4 期2023 年 8 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.2023(a)流式细胞分析;(b)细胞凋亡和坏死量化图。为 P0.01。图 3 流式细胞术检测不同浓度 9R-P49 处理的 L929 细胞的凋亡作用(xs,n=3)Figure 3 Detection of L929 cells treated with different concentrationsof 9R-P49 by flow cytometry(xs,n=3)图 4 细胞平板检测 9R-P49 对 L929 细胞的增殖抑制作用Figure 4 Inhibitory effect of 9R-P49 on the proliferation of L929cells detected by cell plate assay(a)Transwell 细胞形态学结果;(b)细胞迁移量化图。为 P0.01。图 5 Transwell 小室检测 9R-P49 对 L929 细胞的迁移抑制作用(xs,n=3)Figure 5 Inhibitory effect of 9R-P49 on the migration of L929cells detected by transwell chamber assay(xs,n=3)2.5 P49 多肽与 FoxM1-DBD 的分子对接分析用 Discovery Studio 2016 软件 C-DOCKER 半柔性对接预测 P49 多肽配体与 FoxM1-DBD 蛋白的相互作用。分子对接结果显示,P49 多肽能够与 FoxM1-DBD上的 Arg 297、Ser 290 和 Asp 293 位点形成氢键相互作用,这些位点位于 FoxM1-DBD 结合 DNA 的沟槽内,结合细胞水平实验结果推测 P49 多肽能够通过这些位点对 FoxM1 的表达起调控作用(图 6)。图 6 FoxM1-DBD 与 P49 序列的分子对接Figure 6 Molecular docking between FoxM1-DBD and P49 sequence2.6 9R-P49 多肽对 L929 细胞 FoxM1 蛋白表达的影响经9R-P49 多肽处理L929 细胞24 h 后,Western Blot结果显示,FoxM1 蛋白在 L929 细胞中有表达,分子质量约为 84 ku(图 7),与预期大小一致。用 9R-P49 多肽按30.0 g/mL 和 60.0 g/mL 给药处理 L929 细胞后蛋白表达量呈现下降趋势,差异极显著(P0.01)。(a)Western Blot 分析;(b)蛋白表达水平量化图。为 P0.01。图 7 Western Blot 检测 9R-P49 对 FoxM1 蛋白的抑制作用(xs,n=3)Figure 7 Inhibitory effect of 9R-P49 on the expression of FoxM1by Western Blot(xs,n=3)2.7 L929 细胞给药处理的 RNA 转录组数据分析筛选 Pvalue1 的基因作为差异表达43第 40 卷第 4 期2023 年 8 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.2023基因。从火山图(图 8)可以看出,当 9R-P49 多肽处理浓度为 30.0 g/mL 时共得到 419 个差异基因,其中,170 个基因表达上调,249 个基因表达下调;给药浓度为 60.0 g/mL 时共得到 2 705 个差异基因,其中,1 654 个表达上调,1 051 个表达下调,FoxM1 转录水平下调 1.49 倍,与 Western Blot 结果一致;给药浓度30.0 g/mL 与 60.0 g/mL 组相比存在 1 431 个差异表达基因,其中,1 026 个表达上调,405 个表达下调,包括与纤维化强相关的 Col 家族成员:Col1a2(下调)、Col8a1(下调)、Col3a1(下调)等,Fox 家族成员:Foxl1(下调)、Foxn2(上调)、FoxM1(下调)等,TNF 家族成员:TNFsf9(下调)、TNF(上调)、TNFsf15(上调)等。(a)30.0 g/mL 的 9R-P49 和对照组处理细胞;(b)60.0 g/mL 的9R-P49 和对照组处理细胞;(c)60.0 和 30.0 g/mL 的 9R-P49 处理细胞。图 8 用 9R-P49 多肽处理的 L929 细胞的转录组火山图Figure 8 Transcriptome volcano map of L929 cells treated with9R-P49 polypeptideGO 分类下加药组在生物学过程途径中主要富集于结合、催化活性,细胞组分途径中主要富集于细胞、细胞器、细胞组分等,分子功能途径中差异基因数目最多,主要富集于细胞过程、单一组织过程、生物调节过程和新陈代谢过程等,且加药浓度的提高影响的整体生物学功能具有一致性(图 9)。KEGG 分类下加药组差异基因主要富集于免疫系统、内分泌系统、信号转导和新陈代谢等通路,暗示 9R-P49 主要参与这些信号通路的相关转导(图 10)。(a)30.0 g/mL 的 9R-P49 和对照组处理细胞;(b)60.0 g/mL 的9R-P49 和对照组处理细胞;(c)60.0 和 30.0 g/mL 的 9R-P49 处理细胞。图 9 用 9R-P49 多肽处理的 L929 细胞的转录组 GO 分析Figure 9 Transcriptome GO classification of L929 cells treatedwith 9R-P49 polypeptide53第 40 卷第 4 期2023 年 8 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.2023(a)30.0 g/mL 的 9R-P49 和对照组处理细胞;(b)60.0 g/mL 的9R-P49 和对照组处理细胞;(c)60.0 和 30.0 g/mL 的 9R-P49 处理细胞。图 10 用 9R-P49 多肽处理的 L929 细胞的转录组 KEGG 分析Figure 10 Transcriptome KEGG classification of L929 cells treatedwith 9R-P49 polypeptide3 讨论与结论纤维化是一种医学常见疾病,包括肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化和心脏纤维化等10-11。在纤维化过程中,组织微环境会发生剧烈的变化,其中包括细胞外基质分泌、细胞因子和趋化因子分泌等。大多疾病的发病和死亡都是由于纤维性增生损害身体重要器官功能所导致,而成纤维细胞的过度增殖是其主要的驱动因素之一。FoxM1 是一个比较经典的原癌基因,也是细胞增殖调控的关键因子。多项研究发现,FoxM1 也是成纤维细胞激活及纤维化进展的关键驱动因子。Penke等12确定 FoxM1 是肺成纤维细胞激活的驱动因子,并强调其可作为肺纤维化治疗的潜在靶点。Balli 等13通过谱系追踪研究发现,在体内辐射诱导的肺纤维化过程中,FoxM1 能够加重肺部炎症并影响 EMT 过程中重要基因的表达,同时有研究表明 FoxM1 通过发挥转录因子作用调控心脏纤维化进程,并强调了靶向FoxM1 治疗心脏纤维化的治疗潜力。成纤维细胞的活化和增生是组织纤维化的重要特征,FoxM1 的表达量与纤维化程度呈正相关性12。通过 9R-P49 给药处理后,FoxM1 表达量显著下降;通过不同浓度的 9R-P49 处理 L929 细胞,发现 9R-P49 能够显著抑制细胞增殖、迁移并增强细胞凋亡能力,证实该多肽能够通过调控 FoxM1 的表达影响成纤维细胞的生物学功能。Gu 等14研究证明二甲双胍作为一种有机合成物能够通过激活 AMPK 并下调 FoxM1 的表达,从而减轻肺纤维化小鼠模型的各项症状,证明 FoxM1 在肺纤维化途径中起到不可忽略的作用。推测 9R-P49多肽类药物可能发挥比较类似的生物学功能。为此,我们进行了 L929 细胞 9R-P49 多肽给药处理的 RNA转录组测序。给药细胞组在不同浓度均有大量差异基因,随着给药浓度的加大差异基因逐渐增多。与纤维化密切相关的基因家族包括 MMP 家族、TNF 家族、TGF 家族、FGF 家族和 Col 家族。另外,还包括多个FOX 家族相关基因的调控,如 FoxM1、Foxl1、Foxn2、Foxg1 和 Foxs1 等。Foxl1 被证实与肺纤维化高表达相关15。同时还有一些其他 FOX 蛋白参与纤维化的进展,如 FOXA、FOXC16和 FOXO 家族17等。从 GO 分类可以看出,参与调控的基因主要包括炎症因子、TGF和 FGF 等。研究证明炎症因子家族成员在组织纤维化过程中发挥重要作用18-19。KEGG 分类主要影响免疫系统、内分泌系统、信号转导和新陈代谢等通路。本研究初步确认了 FoxM1-DBD 靶向结合肽 9R-P49 能够通过下调 FoxM1 表达从而抑制 L929 细胞增殖和迁移并促进凋亡,最后通过转录组数据进行佐证。多肽类药物具有活性高、用量小、低免疫原性的特点被广泛应用,本研究为靶向 FoxM1 抗纤维化潜在多肽药物研发提供了重要工作基础。但 9R-P49 结合肽是否通过分子对接所预测的位点起到调控作用仍值得进一步研究。更值得关注的是,FoxM1 作为原癌基因在多种肿瘤细胞起重要作用,9R-P49 在调控纤维化途径中具体涉及的信号转导途径及其与肿瘤之间的关系仍需要进一步深入探究。参考文献 1 GURNARI C FALCONI G BELLIS E D et al.The role of fork-head box proteins in acute myeloid leukemia J.Cancers 2019 11 6 865-884.2 GOLSON M L KAESTNER K H.Fox transcription factors from de-velopment to disease J.Development 2016 143 24 4558-4570.3 ZHANG H ACKERMANN A M GUSAROVA G A et al.The FOXM1 transcription factor is required to maintain pancreatic-cell mass J.Molecular Endocrinology 2006 20 8 1853-1866.下转第 47 页 63第 40 卷第 4 期2023 年 8 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.2023chondrial protection promoted by astaxanthin in the SH-SY5Y cells exposed to hydrogen peroxide J.Neurochemistry International 2021 146 1-15.13 ZHOU F M HUANG J J HU X J et al.Protective effects of fla-vonoids from the leaves of Carya cathayensis Sarg.against H2O2-in-duced oxidative damage and apoptosis in vitro J.Experimental and Therapeutic Medicine 2021 22 6 1443.14 YEN G C CHEN H Y.Antioxidant activity of various tea extracts in relation to their antimutagenicity J.Journal of Agricultural and Food Chemistry 1995 43 1 27-32.15 李露壮 姜衍 徐爱华 等.虾青素对过氧化氢诱导的骨髓间充质干细胞氧化应激的保护作用 J.中国医科大学学报 2021 50 2 124-129.16 WANG X MA J BAI X et al.Antioxidant properties of astaxan-thin produced by cofermentation between Spirulina platensis and re-combinant Saccharomyces cerevisiae against mouse macrophage RAW 264.7 damaged by H2O2 J.Food and Bioproducts Processing 2019 118 318-325.17 向忠 王宇航 吴金波 等.过氧化氢检测方法研究进展 J.纺织学报 2020 41 10 197-204.18 CAO G H ALESSIO H M CUTLER R G.Oxygen-radical absorb-ency capacity assay for antioxidants J.Free Radical Biology and Medicine 1993 14 3 303-311.19 OU B X HAMPSCH-WOODILL M PRIOR R L.Development and validation of an improved oxygen radical absorbance capacity assay using fluorescein as the fluorescent probe J.Journal of Agri-cultural and Food Chemistry 2001 49 10 4619-4626.20 PAZDZIOCH-CZOCHRA M WIDENSKA A.Spectrofluorimetric determination of hydrogen peroxide scavenging activity J.Analyti-ca Chimica Acta 2002 452 2 177-184.21 PAITAL B.A modified fluorimetric method for determination of hy-drogen peroxide using homovanillic acid oxidation principle J.Bi-omed Research International 2014 2014 1-2.22 BOKARE A D CHOI W.Review of iron-free Fenton-like systems for activating H2O2 in advanced oxidation processes J.Journal of Hazardous Materials 2014 275 121-135.23 ZHANG T ZHU H CROUE J P.Production of sulfate radical from peroxymonosulfate induced by a magnetically separable CuFe2O4 spinel in water efficiency stability and mechanism J.Environmental Science&Technology 2013 47 6 2784-2791.24 WANG J WANG S.Reactive species in advanced oxidation processes formation identification and reaction mechanism J.Chemical Engineering Journal 2020 401 1-16.25 OUCHI A AIZAWA K IWASAKI Y et al.Kinetic study of the quenching reaction of singlet oxygen by carotenoids and food extracts in solution.Development of a singlet oxygen absorption capacity SOAC assay method J.Journal of Agricultural and Food Chem-istry 2010 58 18 9967-9978.26 HAMA S UENISHI S YAMADA A et al.Scavenging of hydroxyl radicals in aqueous solution by astaxanthin encapsulated in lipo-somes J.Biological&Pharmaceutical Bulletin 2012 35 12 2238-2242.27 LIU X J LUO Q X RAKARIYATHAM K et al.Antioxidation and anti-ageing activities of different stereoisomeric astaxanthin in vitro and in vivo J.Journal of Functional Foods 2016 25 50-61.28 LI J SUN J LI B et al.Astaxanthin protects ARPE-19 cells a-gainst oxidative stress injury induced by hydrogen peroxide J.Bio-technology&Biotechnological Equipment 2018 32 5 1277-1284.29 MACEDO R C BOLIN A P MARIN D P et al.Astaxanthin ad-dition improves human neutrophils function in vitro study J.Eu-ropean Journal of Nutrition 2010 49 8 447-457.30 SHIMIDZU N GOTO M MIKI W.Carotenoids as singlet oxygen quenchers in marine or