CRISPR_Cas系统在SARS-CoV-2检测中的应用.pdf

：综述 系统在 检测中的应用周建，詹远长，王馨，徐璞，张娜，李卓（西安医学院第一附属医院检验科，西安；西安航天总医院医学检验科，西安）摘要：新型冠状病毒（）全球流行，快速有效的检测方法对于疫情防控和患者救治极为重要。目前已有多种方法应用于 的检测，但均存在一定的局限性。研究发现，采用 系统构建的 检测方法具有快速、便捷的优势。目前应用于 检测的 系统主要包括 、和 ，多以 的核酸和蛋白质作为检测靶标。因此，该文对基于 系统的 检测方法分别从核酸和蛋白质 个角度进行综述，并就各自的优缺点及未来发展趋势进行分析，期望为 系统在传染病检测中的应用提供参考。关键词：系统；检测中图分类号：文献标志码：新型冠状病毒（，）的流行已对全球 多个国家和地区的医疗健康和经济造成严重影响，快速、有效的检测方法是防止 病 毒 扩 散 和 阻 断 患 者 感 染 的 基 本 手 段。针 对现已建立了多种检测方法，包括抗原、抗体和核酸检测，其中抗原和抗体检测存在特异性和敏感性较差等问题，核酸检测虽被认为是 检测的金标准，但传统的核酸检测方法中实时荧光定量（）耗时长，且对人员和实验室均有严格的准入要求，因此越来越多的研究者试图开发操作简单、价格便宜、敏感性和特异性较高的 检测方法。研究发现，成簇规律间隔短回文重复序列及其相关基因和 蛋白（，）系统可用于核酸检测，且因其具有简单、快捷等优势，更适用于医疗水平欠发达地区的 检测。基于 系统的优势，目前已陆续建立了针对 核酸和蛋白质水平的检测系统，极大的丰富了实验室检测方法的多样性。本文针对基于 系统的 检测方法作一综述，期望为开发更有效的传染病检测方法提供依据。新型冠状病毒 的命名源自世界卫生组织（，），属于 目，冠状病毒科和冠状病毒亚科，含有（）、（）、（）和（）个属。含有包膜，属于 冠状病毒属的正链单链 病毒。其基因组长度约为，结构基因含有开放阅 读 框 （，），分 别 为 和，。病毒颗粒含有核衣壳蛋白（，）、刺突蛋白（，）、包膜蛋白（，）和膜蛋白（，）等主要结构蛋白。其中 蛋白的受体结合区域（，）与宿主细胞表面血管紧张素转化酶（，）结合，感染宿主。目前对 的核酸检测，主要针对、和 设计靶向区域。应用于 检测的 系统类型 是细菌和古生菌的天然免疫系统。系统在引导（，）的作用下识别和切割靶向核酸序列，现已被广泛应用于基因编辑、核酸检测及转录调控等方面。目前自然界中已发现两大类 系统：和 ，主要包括 、共 种类型。应用于 检测的主要包括、和 （图）。其中，在 引导下 蛋白对目标 序列识别和切割；在 的引导下识别靶向核酸序列，激活 的靶向和非靶向切割活性，；在 的引导下识别和切割靶向单链（，），同时激活 的非靶向切割（）功能。临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，基金项目：陕西省卫生健康委联合攻关项目（类）（）；西安市科技局（西安市创新能力强基计划医学研究项目）（）；西安医学院校级科技创新团队项目（）。作者简介：周建，年生，男，副主任技师，博士，主要从事分子诊断研究。通信作者：李卓，教授，博士，：。注：，；，；，。图 应用于 检测的 系统类型 基于 系统的 检测技术 基于 的 核酸检测技术 基于无酶切活性的 蛋白（，）的 核酸检测技术其是 联合生物素与链霉亲和素过氧化物酶构建的检测系统。检测过程如下：首先将 固定在固定相载体上，然后将针对 的 和 基因设计的靶向 和用生物素标记的识别前间区邻近序列（，）递呈寡核苷酸（）加入检测体系，当检测系统中存在 的靶向序列时，复合体识别靶向序列与 识别序列形成复合体。标记有生物素的 与 识别靶向序列形成复合物，然后生物素与链霉亲和素过氧化物酶结合，与氧化四甲基联苯胺反应产生颜色变化，通过颜色反应即可检测 靶标的存在。该检测系统能够有效地将核酸靶标通过 转化为传统酶联免疫检测过程，可实现 孔的高通量检测能力。基于无切割活性的（，）构建的 核酸检测平台该平台是一种用 和生物素标记技术构建的侧向流试纸条技术。其检测基本过程为：首先通过生物素和荧光（，）分别标记上、下游引物，然后通过逆转录重组酶扩增技术（，）扩增目标区域。在 的引导下，靶向识别目标序列，形成含有生物素和 标记的复合体，应用侧向流试纸条检测信号。检测系统利用 的靶向识别能力转化核酸靶标信号为侧向流试纸条信号，实现了可视化读取信号，并可实现传染性疾病的核酸快速检测。基于 编辑器链接的同质化（，）的 检测平台该平台主要应用 联合 技术构建。酶具有高特异性识别靶向碱基的特点，其检测的基本过程为：首先采用生物素标记 引物，扩增目标区域，识别靶向区域序列进行 核酸检测，时间约需 。系统的 酶识别靶向序列具有高度特异性，可实现单个碱基区分，因此在未来传染性疾病的病原分型鉴定方面具有一定优势。可介导侧向流核酸检测（，）平台该平台主要采用 联合侧向流试纸条检测技术构建。通过地高辛（）和生物素标记的 引物，采用侧向流试纸条检测 靶标。检测系统针对 和 基因设计 扩增引物，分别用 和生物素标记重组酶等温扩增（，）上、下游引物，采用三线侧向流动（，）读取检测结果，其阴性符合率高达，阳性符合率为，曲线下面积（）为 。检测平台 是 采 用 技 术 联 合 构 建 的核酸检测平台，该系统能有效防止实验室扩增产物气溶胶的污染引起的假阳性结果。综上所述，基于 建立的 核酸检测系统，利用 系统的靶向识别和切割能力，通过核酸检测与侧向流技术及荧光信号技术的有机结合，实现了肉眼读取检测结果，具有简便快捷、特异性高等优势。但同样也存在一定局限性：其一，系统本身具有脱靶效应，可能产生假阳性结果；其二，核酸检测系统为了提高检测的灵敏度，均需联合等温扩增技术对靶向区域进行扩增，增加了操作步骤，也加大了污染机会；其三，核酸检测系统前期需要复杂的生物信息设计，增加了应用难度。基于 的 检测技术 基于荧光读取信号的 的 核酸检测技术基于 内切酶靶向 反式报告基因（，）的 核酸检测系统该系统是 联合和逆转录环介导等温扩增（，）技术构建的平台，该技术针对 的 和 基因设计引物和，在 的引导下识别靶向序列后，激活 非特异性切割双荧光标记单链临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，（，），产生荧光信号，检测时间 。另 一 种 基 于 一 步 法 内 切 酶 靶 向 反式报告基因（，）核酸检测平台，是采用 和逆转录重组酶等温扩增（，）技术构建的 核酸一步法检测平台，其检测限为 ，该系统可通过一步法完成检测，大幅缩短了检测流程，可有效避免检测过程中的污染机会。基于冻干 的（，）的核酸检测平台该平台采用 联合 技术构建，可以通过读取荧光信号检测 核酸。无 须 纯 化 的 环 介 导 等 温 扩 增 联 合（，）核酸检测平台是一种不需要核酸提取的 核酸检测方法，联合 检测 病毒的 基因，非靶向切割荧光标记的 产 生 荧 光 信 号，比 色 法 读 取 荧 光 信 号。检测平台无须核酸提取过程，减少了操作流程，也减少了污染机会。基于 链接的解锁反应（，）的 核酸 检 测 平 台 该 平 台 是 一 种 联 合构建的检测方法，具有检测时间短、设备简单等特点，提高了检测效率。基于 的增强（）核酸检测平台该平台采用 联合 或 技术构建，体外扩增 ，非靶向切割荧光标记的 产生荧光信号，通过荧光酶标仪或侧向流动试纸条读取检测结果，该平台可以实现 的现场检测。基于体外特异性（，）的 核酸检测平台该平台依赖于 联合 技术构建，非靶向切割荧光素标记的 产生荧光信号，侧向流动试纸条读取结果，检测时长。综上所述，基于荧光读取信号的 的 核酸检测技术是利用 蛋白的非靶向切割 能力，采用双荧光标记 序列，非特异性切割双荧光标记 序列产生荧光信号。该平台具有信号读取方便，耗时短等优势，尤其是基于侧向流动试纸条读取结果的检测系统，读取方式简单，操作简便，对人员要求低，可实现居家检测。可视化的 的 核酸检测技术基于 单管等温放大与可视化（，）的 核酸检测平台该平台针对 的、和 基因为靶标，反应 、扩增靶标区域，切割荧光标记的非靶向核酸序列，紫外灯检测信号，约需，特异性为。基于一步法 联合逆转录环介导的等温可视化（，）的 核酸检测平台 该 平 台 是 联 合，等温扩增 ，靶向识别 的 基因，激活非靶向切割荧光标记，蓝光下肉眼读取信号，实现可视化读取结果。基于 的肉眼可见的可视化读取的（，）核酸检测平台该平台通过 扩 增、基 因，非靶向切割荧光标记 序列，产生荧光信号，肉眼读取荧光信号，检测下限为 ，约需 。基于 灯光的 相关的（，）核酸可视化检测平台 识别靶向序列后，激活其非靶向切割 产生荧光信号，灯下 、读取信号，具有信号读取方便等优势。基于 一步法（，）的可视化 检测平台该平台通过一步法即可完成 的检测，用时 ，减少了操作步骤，也降低了污染机会。基于（，）的可视化 核酸检测技术该技术中 通过光密度可视化读取荧光信号，极大提高了检测灵敏度，一步法即可完成检测操作。综上所述，通过 系统建立的可视化信号读取方法极大地提高了 核酸检测的可操作性，通过 将 的核酸信号转化为可视化的荧光信号，有望实现传染性疾病核酸检测的居家自测目的，因此其在未来的核酸检测过程中具有巨大潜力。其他基于 的 核酸检测系统 基于便携式血糖仪的 （，）系统的 核酸检测方法、和非特异性 标记有蔗糖酶转化酶（）和磁珠（，），扩增靶向序列，在 的引导下采用 识别靶向序列激活其切割蔗糖酶转化酶和 标记的非靶向，获得自由的蔗糖酶转化酶，反应液中蔗糖转化为葡萄糖，通过检测反应液中的葡萄糖间接获取靶标 核酸。基于 联合 大片段诱导的早孕试纸条信号开发的（，）核酸检测方法 其是由 联合商品化的早孕试纸条构临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，建，主要由 和菜花状的大片段 组合体（，）以及 和人绒毛膜促性腺激素结合 探针（，）等元件构成。扩增靶向区域，非靶向序列为 标记，引导 切割靶向序列后非靶向切割 序列，获得游离的 与试纸条结合显色。而当体系中不存在靶向序列时，序列不能被切割，无法获得游离，阻碍其与早孕试纸底物结合，因此不显色。系统联合早孕试纸条技术提供了一种新的 核酸检测方法，便于推广应用。基于 等速增强电泳（，）的 检测技术该技术是采用 系统联合微流体芯片技术开发的，应用微流体芯片等速电泳（，）的选择性离子聚焦技术在微流体芯片产生优化的电场梯度，系统依赖微流体芯片的等速电泳提取病毒 约需 ，靶向基因扩增约 ，然后依赖微流体芯片联合 系统 完成检测，内可检测出样本中的核酸含量。基于（，）的 核酸检测技术主要通过 、联合微流控芯片（）技术进行 核酸检测，识别目标序列后激活非靶向荧光标记的 序列，应用微流控芯片读取检测信号，检测过程约需 。基于 的 的 蛋白检测技术一种基于 衍生的电化学传感器能够快速、高效、灵敏地检测 病毒核衣壳蛋白（）。其首先将亚甲蓝标记的聚腺嘌呤 序列（电化学报告基因）固定在金电极表面，然后制备核酸适配体弓形探针，当有 病毒存在时，病毒的核衣壳蛋白与适配体之间相互作用，激活 链从适配体探针释放（激活链为 识别的靶向 序列），然后激活 非靶向切割活性，即切割电极表面的 分子产生电位变化，其检测 的检测限（，）低至 ，在 内完成检测。该检测系统对其他蛋白质表现出很高的选择性，因此在 的早期诊断、环境监测、食品安全等方面具有巨大潜力。综上所述，基于 构建的 检测系统主要有 和 ，其识别的靶向序列有 和蛋白质，然而 为 病毒，因此检测过程中首先需要逆转录 为 序列，然后对靶标区域进行体外扩增，增加 识别的底物浓度和检测灵敏度，但是也相应增加了操作步骤。大部分基于 的 检测系统识别的靶标区域为 的、和 基 因。联合芯片检测 核酸能够极大地提高检测灵敏度，但是也增加了检测成本。利用 建立的一步法 核酸检测系统，有效减少了操作步骤，也降低了污染机会，但是一步法中 识别并切割靶向序列作为体外核酸扩增的模板，同时非特异性切割等温扩增引物序列，抑制体外扩增的效率，两步法策略虽避免了这一问题，但是却增加了污染可能，这也是 检测系统在未来研究中亟待解决的问题。基于此系统巧妙应用 蛋白的核酸适配体弓形探针技术，实现了 针对 蛋白的检测，增加了 系统检测靶标的多样性。在未来针对传染性疾病检测过程，通过设计不同靶标蛋白的探针可应用于更多的传染性疾病分子诊断过程。基于 的 核酸检测技术 在 的引导下能特异性识别靶向 序列，激活靶向和非特异性切割活性。研究者基于 的非靶向切割活性，陆续建立了一系列 核酸检测平台。基于 的高特异性、高灵敏度酶报告基因解锁（，）核酸检测平台该平台是 联合 和 启动子的体外转录技术构建，侧向流技术读取检测信号，此系统加入了防 酶污染的内控制系统，据报道 检测 的特异性和敏感性均高达，层析读取结果的特异性为，敏感性为。研究人员开发了 的 检测平台，针对 作为靶点，其检测下限为 ，检测时间为 ，但由于其耗时长等缺陷，无法满足疫情防控的需要，因此有学者在此基础上开发了一步法（）核酸技术，合并 和 启动子转录过程，检测 用时约 ，但检测的灵敏度随之大幅降低，检测下限仅为 。基于 的固化均一可扩展的（，）核酸检测系统 该系统依赖于 联合，针对 病毒 基因区域进行外扩增，利用 启动子转录反应体系中 转录为，识别靶向 后激活其非特异性切割荧光标记 产生荧光信号。基于敏感酶核酸序列报告系统（，）的 核酸检测系统 此系统是 联合 和 启动子转录技术构建的 检测平台，在 的引导下对、基因识别，切割荧光标记的非靶向 产生荧光信号，读取荧光信号或层析检测，检测下限为 。串联整合核酸酶快速（，）核酸平台该平台是 联合（，）的 核酸快速检测方法，引导 识别靶向序列，激活 切割荧光标记 序列，具有荧光信号放大的作用，其检测极限为 ，检测时间为 ，此过程不需要进行核酸扩增，因此缩短了检测时间和步骤。临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，基 于手机读取检测信号的（，）的 核酸检测平台该平台是应用（）技术裂解和灭 活 病 毒 ，然 后 联 合 一 步 法（）创建的 平台，该技术最大的优点是不需要进行 病毒核酸提取，检测 过 程 对 设 备 要 求 低，检 测 速 度 快。检 测病毒的灵敏度为，特异性可达，平均检测时间为 ，实现了应用手机 可直接读取检测结果。基于手机显微技术（）的 核酸检测系统 该平台是应用 联合手机显微技术构建的核酸检测系统，针对 的 基因设计双 序列，切割荧光标记非靶向的 后产生荧光信号，然后通过手机显微技术检测系统读取信号，无须核酸扩增，具有检测速度快、价格低廉的优点。基于 的 核酸检测系统 其是由 联合荧光显微镜技术构建 的 检 测 平 台，针 对 和 设 计，对荧光标记的非靶向 进行切割，通过数字化（）读取荧光信号。综上所述，针对 应用 构建的各种核酸检测系统，其靶向识别切割和非特异性切割的序列均为，针对 病毒，可以直接应用于检测而不需要借助于逆转录和转录技术，极大减少了操作过程，但由于临床原始样本中的病毒含量较低，为了提高检测灵敏度，需要对靶标区域进行扩增，以增加 识别的底物浓度，故而增加了检测步骤。因此，部分基于 系统的 核酸检测系统为一步法完成，如 系统，虽然有效避免了繁琐的操作步骤，但检测灵敏度却大幅降低。小结及展望 可应用于 检测的 系统主要有、和 。检测靶标的主要类型有核酸和蛋白质，其中核酸为直接检测靶标，但不同研究团队建立的系统特性各不相同，因此在未来需要进一步优化。针对 的 蛋白作为靶标建立的 系统，利用生物传感器策略间接检测 蛋白，实现了 系统在蛋白质检测中的应用，丰富了其检测靶标的种类，可能是未来 系统用于病毒检测的一个新方向。总体而言，基于 系统构建的分子诊断系统具有特异性高、无需特殊设备等优点，但也存在脱靶效应可能会产生假阳性结果的缺点。具体来看，（）基于 建立的 核酸检测系统主要有 和，利用靶向识别能力，检测过程联合侧向流及荧光信号等技术，实现肉眼读取检测结果，具有操作简单、特异性高的优势。但是 系统本身具有脱靶效应，可能产生假阳性结果，需要联合等温扩增技术对靶向区域进行扩增，增加了操作步骤，也增加了污染机会，需要复杂的生物信息设计，且需要对样本进行前期处理后方可进行检测，因此临床推广应用困难。针对应该通过基因工程的方法或从自然界寻找高保真的 蛋白酶，降低脱靶效应，降低假阳性率。（）基于 建立的 核酸检测系统面临商业化困境，主要原因是检测效率和成本之间矛盾。一步法有效减少了操作步骤，减少了污染机会，但是一步法中 靶向和非靶向切割抑制体外扩增的效率，两步策略避免此问题，但是却增加了污染可能，这是其商业化困境之一，针对此问题首先应该优化反应体系，调节不 同 反 应 阶 段 酶 活 性 改 善 检 测 效 率。因 此，基 于 的 检测是一种极具有潜力的检测方式，但是距离大规模临床应用还有很长一段时间。（）基于 建立的 核酸检测系统，其识别的靶向序列和非特异性切割的核酸均为，因此检测过程针对 靶标病毒或 检测靶标可直接进行检测，然而临床样本中靶标浓度很低，为了提高检测灵敏度需要进行体外核酸扩增，需要经过逆转录和转录 个过程，增加了检测时间和复杂程度。因此在未来研究中需要持续不断优化 检测的反应体系，使检测过程不需要转录和逆转录，可直接检测靶标，这样极大缩短了检测时间。因此 是针对 病毒的一种很有潜力分子诊断系统。目前基于 系统的核酸检测信号读取方式（图）包括荧光信号、基于紫外灯的可视化读取、法、侧向流检测技术、糖化试纸条法、早孕试纸条法、电化学信号法、基于微流体芯片法等。因此，基于 建立的 检测系统操作简单方便，形式丰富多样。在未来，需要持续不断地优化 检测系统，减少操作步骤，提高检测灵敏度，同时可以和更多传统的检测技术结合，提高检测效率，进行商业化的推广应用。临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，图 基于 系统检测 的信号读取方式 参考文献 ，（），（）：，：，（）：，：，：，（）：，：，：，：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（），：，临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，（）：，：，：，：，：，（）：，：，：，（）：，：，（）：，：，：，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：（收稿日期：）（本文编辑：许晓蒙）临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，