ctDNA检测KRAS基因在结直肠癌预后中价值的临床研究及Meta分析.pdf

DOI:10.12289/j.issn.1008-0392.23025临床研究 收稿日期:2023-01-29 基金项目:上海市卫健委卫生行业临床研究专项课题(201640222)作者简介:刘 骏(1984),男,主治医师,博士.E-mail:liujun356 通信作者:唐一帆.E-mail:tangyifan618 ctDNA 检测 KRAS 基因在结直肠癌预后中价值的临床研究及 Meta 分析刘 骏,吴双杰,李孟军,唐一帆(复旦大学附属华山医院普外科,上海 200040)【摘要】目的 通过临床病例数据研究,探讨 ctDNA 检测结直肠癌患者外周血中 KRAS 等基因突变在患者预后中的意义,并根据探索的结果做进一步的 Meta 分析,分析 ctDNA 检测 KRAS 突变对结直肠癌患者术后无病生存期的影响。方法 采集 30 例患者外周血标本,通过探索队列和验证队列,分析 KRAS 等基因突变与患者的临床病理特征、疗效及预后的关系。收集多个期临床试验中 KRAS 突变与结直肠癌患者术后无病生存期的数据,应用 Stata MP.17 软件进行 Meta 分析,评估 KRAS 突变对结直肠癌患者术后无病生存期的影响。结果 30 例临床病例中,共有 12 例发现 RAS 突变情况,其中 KRAS 突变 10 例,是突变频率最高的基因,探索队列分析显示 RAS、TP53、SMAD4 基因共突变患者无病生存期较短。按关键词共检索文献 513 篇,最终纳入 6 项临床试验(PETACC-3、CALGB、N0147、QUASAR2、NSABP-8、NSABP-C07),共 9 152 例患者,其中 KRAS 突变患者 3 090(33.8%)例,野生型患者 6 062(66.2%)例。Meta 分析结果显示,KRAS 突变患者的无病生存期较野生型患者差(合并效应值 HR=1.33,95%CI:1.11 1.59,P0.01),提示 KRAS 突变患者预后可能不良。亚组分析显示,未使用靶向药物治疗组KRAS 突变组和 KRAS 野生型组预后无显著差异I2=0%,P=0.899;DFS 合并效应值 HR(95%CI)为 1.09(0.961.24),P=0.172,而使用靶向药物治疗组 KRAS 突变组较 KRAS 突变组预后差I2=23.6%,P=0.270;DFS 合并效应值 HR(95%CI)为 1.58(1.351.83),P0.001,表明是否使用靶向药物治疗可能是部分异质性的来源。结论 KRAS突变与较短的无病生存期相关,通过 ctDNA 检测结直肠癌患者 KRAS 等基因的突变状态,可用于判断结直肠癌患者的预后并指导治疗。【关键词】结直肠癌;ctDNA;KRAS 基因;无病生存率【中图分类号】RR735.3+8【文献标志码】A【文章编号】10080392(2023)04058008Clinical study and meta-analysis of KRAS gene mutations detected by ctDNA technique for prognosis of colorectal cancerLIU Jun,WU Shuangjie,LI Mengjun,TANG Yifan(Department of General Surgery,Huashan Hospital Affiliated to Fudan University,Shanghai 200040,China)【Abstract】ObjectiveTo explore the detection of KRAS gene mutations detected by circulating tumor DNA(ctDNA)technique in prognosis of colorectal cancer.Methods Peripheral blood samples were collected from 30 patients with colorectal cancer and the KRAS gene mutations of circulating tumor DNA were detected by Circulating DNA Kits.The relationship of KRAS gene mutations with clinical pathological characteristics,treatment efficacy,and prognosis of patients was analyzed.The publications of related phase clinical trials were searched and retrieved;the meta-analysis of included literature was performed with Stata MP.17 software to evaluate the impact of KRAS mutations on postoperative disease-free survival of colorectal cancer patients.ResultsAmong 30 colorectal 085第 44 卷第 4 期2023 年 8 月同 济 大 学 学 报(医 学 版)JOURNAL OF TONGJI UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)Vol.44 No.4Aug.2023cancer patients,RAS mutations were detected in 12 cases,of which 10 cases had KRAS mutations.The clinical study showed that patients with co-mutations in RAS,TP53,and SMAD4 genes had poorer disease-free survival.The meta-analysis included 6 clinical trials(PETACC-3,CALGB,N0147,QUASAR 2,NSABP-8,NSABP-C07)with a total of 9 152 patients,including 3 090(33.8%)KRAS mutation patients and 6 062(66.2%)wild-type patients.The patients with KRAS mutations had poorer disease-free survival compared to wild-type patients(HR=1.33,95%CI:1.111.59,P 0.01).Subgroup analysis showed that there was no significant difference in prognosis between the KRAS mutant group and the KRAS wild-type group in patients without targeted drug treatment(I2=0%,P=0.899;HR=1.09,95%CI:0.961.24,P=0.172);while the KRAS mutant group in patients with targeted drug treatment had a poorer prognosis than the KRAS wild-type group(I2=23.6%,P=0.270;HR=1.58,95%CI:1.351.83,P 50%认为有显著的异质性。汇总估计的统计显著性基于 Wald 检验 P 值。双侧 P0.05为差异有统计学意义。2 结 果2.1 临床数据结果本研究组纳入的 30 例结直肠癌患者,根据肿瘤分期,期患者 5 例、期患者 8 例、期患者 12例、期患者 12 例;有淋巴结转移 15 例(50%),无淋巴结转移 15 例(50%);术后辅助化疗患者 24 例,没有参与术后辅助治疗 4 例患者(图 1A)。在 9 例探索队列患者当中,有 5 例患者存在 APC 基因突变,突变频率最高。其次是 TP53,有 4 例患者发生突变(图 1B)。其中 2 例患者发生了 RAS、TP53、285 同济大学学报(医学版)第 44 卷SMAD4 等基因的共突变,通过生存分析发现,发生3 个基因共突变的患者预后明显较差(图 1C)。与术前血浆相比,大多数患者术后血浆中的肿瘤突变数量和等位基因变异频率(VAF)显著下降。为此,绘制了病例 9 的 ctDNA 和 CEA 等指标的动态变化图(图 1D),从中可以看到 KRAS、TP53、SMAD4、APC 等基因 VAF(右侧纵坐标)在术后 1周和术后 3 个月(黄色阴影时间段发现患者肝转移)的显著变化,CEA、AFP、CA199 等常见肿瘤标志物(左侧纵坐标)也有类似的变化趋势。在实验当中显示,术后 ctDNA 阳性的患者预后较差(图 1E)。通过对 21 例验证队列人群进行 12 个关键基因的检测发现(图 1F),有 10 例患者发生了 RAS 突变,是突变频率最高的基因。图 1 临床数据基因检测结果Fig.1 Genetic test results and clinical dataA:30 例结直肠癌患者基本临床特征;B:9 例患者基因突变图谱;C:RAS、TP53、SMAD4 基因共突变患者 DFS 分析;D:病例 9 手术前后基因突变和肿瘤标志物动态监控结果;E:术后 ctDNA 结果对 DFS 的影响;F:21 例验证人群队列关键基因变异图谱2.2 Meta 分析文献检索结果研究选择最初检索到 623 篇文章,全面审查这些文章是否是期临床试验、DFS 是否为结局终点等,具体见文献筛选流程及结果见图2。最终确定了符合纳入标准的 6 项试验:PETACC-323、CALGB24、N014725、QUASAR226、NSABP-827、NSABP-C0728,共纳入 9 152 例患者,KRAS 突变患者 3 090(33.8%)例,野生型患者 6 062(66.2%)例,见表 1。2.3Meta 分析 KRAS 突变对结直肠癌患者 DFS的影响结果 在纳入分析的 6 项研究中,KRAS 突变对 DFS影响的异质性检验采用 I2检验,结果显示,异质性较高(I2=72.4%,P0.01),故采用随机效应模型。结果显示,KRAS 突变患者的 DFS 较野生型患者差385 第 4 期刘 骏 等:ctDNA 检测 KRAS 基因在结直肠癌预后中价值的临床研究及 Meta 分析(DFS 的合并 HR=1.33,95%CI:1.111.59,P 0.01)(图 3),即 KRAS 突变患者提示预后可能不良。2.4 敏感性分析和亚组分析结果通过依次剔除每项研究进行敏感性分析,探究分析结果的稳定性。结果显示,没有单独的研究影响 DFS 合并的 HR 效应值和 95%CI(图 4),这表明该分析结果稳定可信。由于有研究表明根据 KRAS 基因发生突变后,会导致 EGFR 依赖的 RAS-RAF-MAPK 信号通路持续激活,引起细胞过度增殖和分化,从而诱发结直肠癌。多个临床证据数据显示抗 EGFR 单克隆抗体对KRAS 野生型患者的治疗有益,因此根据纳入文献的队列,将有无基础的贝伐单抗或者西妥昔单抗等靶向药物治疗进行分组,未使用靶向药物治疗的队列为 A组,使用靶向药物治疗的队列为 B 组进行亚组分析。图 2 文献筛选流程及结果Fig.2 Flowchart of literature selection 表 1 纳入研究的基本资料Tab.1 Basic characteristics of the included literature作者发表年份试验名称国家结直肠癌TNM 分期KRAS 突变患者人数KRAS 野生型患者人数治疗方案DFSHR(95%CI)NOS 评分(分)Roth 等232012PETACC-3瑞士/4769285-FU+LV+IRI A1.05(0.851.30)7Ogino 等242012CALGB美国1763305-FU+LV+IRI A1.09(0.771.55)8Gavin 等282012NSABPC-07美国/79314335-FU+LV+OX A1.12(0.941.33)7Sinicrope 等252015N0147美国8842021OX+Cetuxi B1.45(1.241.69)7Taieb 等272016PETACC-8法国5581042OX+Cetuxi B1.64(1.292.08)9Domingo 等262018QUASAR2澳大利亚/203308CAP+Beva B1.99(1.372.91)8 5-FU:5-氟尿嘧啶;LV:甲酰四氢叶酸;IRI:伊立替康;OX:奥沙利铂;Cetuxi:西妥昔单抗;Beva:贝伐单抗;CAP:卡培他滨图 3 KRAS 突变对 DFS 影响的 Meta 分析森林图Fig.3 Meta-analysis of the effect of KRAS mutation on DFS485 同济大学学报(医学版)第 44 卷 结果显示,各亚组异质性均下降(图 5),在未使用靶向药物治疗组分析中,合并后的效应值显示KRAS 突变组和 KRAS 野生型组预后无显著差异I2=0%,P=0.899,DFS 合并效应值 HR(95%CI):1.09(0.96 1.24),P=0.172。而在使用靶向药物治疗组分析中,合并后的效应值显示 KRAS 突变组较 KRAS 野生型组预后差(I2=23.6%,P=0.270,DFS 合并效应值 HR(95%CI):1.58(1.351.83)(P0.001)。这表明是否使用靶向药物治疗可能是部分异质性的来源。2.5 发表偏倚检验结果由于纳入研究数量较少,采用 Begg 和 Egger 检验法评估纳入研究的发表偏移。结果显示,Egger 检验(图 6A):P=0.6880.05;Begg 检验(图 6B):P=0.4520.05,均提示无明显发表偏移。图 4 纳入研究的敏感性分析Fig.4 Sensitivity analysis of included literature图 5 亚组分析结果森林图Fig.5 Forest plots of subgroup analysis图 6 发表偏移的 Egger 检验图(A)和 Begg 检验图(B)Fig.6 Eggers publication bias plot(A)and Beggs funnel plot(B)585 第 4 期刘 骏 等:ctDNA 检测 KRAS 基因在结直肠癌预后中价值的临床研究及 Meta 分析3 讨 论对于结直肠肿瘤术后患者,如何尽早发现疾病的复发、转移,在疾病进展前作出有效的医学判断,采取合适的治疗方案,对提高生存时间至关重要。除了传统的血清肿瘤标志物、影像学检查等,ctDNA动态监测肿瘤复发也在较多的临床研究中得到证实。ctDNA 检测 KRAS 突变结直肠癌患者临床预后较差的现象已在多个转移队列 当 中 得 到 验证13-15,对于经过根治性切除的、期结直肠癌患者,KRAS 突变对预后的影响和对辅助治疗的选择依然有不同的研究结果。为了进一步探索 KRAS突变对结直肠癌患者预后的影响,研究组整合多个前瞻性期临床研究数据,分析 KRAS 突变对期和期结直肠癌患者 DFS 的影响。经过 Meta 分析发现,KRAS 突变人群有更高的疾病复发风险,但结果异质性较大。亚组分析结果提示,未涉及到靶向药物治疗组的 KRAS 突变组和 KRAS 野生型组预后无显著差异,而涉及到靶向药物治疗的队列,KRAS 突变组较 KRAS 野生型组预后差。这表明KRAS 突变结直肠癌患者较野生型患者的预后差,可能只是针对在有靶向药物治疗的前提下。如果未进行靶向药物治疗的患者,KRAS 突变与否,预后可能并无差异。这也提示了是否可以根据 KRAS 突变情况来进一步指导/期结直肠癌患者是否选取靶向药物的治疗。本研究的临床数据通过生存分析显示 RAS、TP53、SMAD4 等基因的共突变患者预后明显较差。有研究表明,BRAF 突变情况、MSI 状态等因素对、期结直肠癌患者的预后影响较大,因此综合考虑 KRAS、BRAF 等基因的突变情况和 MSI 状态,并将患者的临床病理特征纳入分析,能得到更优的预后分析模型以及指导治疗分层。同时也有研究表明,在结直肠癌肝转移手术切除的患者当中,单独的RAS 突变不足以准确预测预后,RAS 与 TP53、SMAD4 的共突变患者 OS 和 PFS 更低。本研究的数据也表明,在、期患者当中,RAS、TP53、SMAD4 等基因共突变与不良预后有一定的相关性,术后 ctDNA 阳性患者的预后较差。综上所述,ctDNA 检测 KRAS 等基因突变对于结直肠癌患者具有重要的临床价值,在判断预后、治疗选择等方面有广阔的应用前景。本研究中术后ctDNA 检测到 RAS 等基因突变的患者,目前也在继续密切地随访过程当中,期待进一步验证 RAS 突变以及 TP53、SMAD4 等基因共突变对患者预后的影响。同时,也期待用更大队列的研究,探索 ctDNA检测在判断患者预后、辅助治疗的分层选择、辅助治疗的时长等诸多临床问题,从而提供更好的临床参考价值。【参考文献】1 SUNG H,FERLAY J,SIEGEL R L,et al.Global cancer statistics 2020:GLOBOCAN estimates of inci-dence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countriesJ.CA Cancer J Clin,2021,71(3):209-249.2 XIA C F,DONG X S,LI H,et al.Cancer statistics in China and United States,2022:profiles,trends,and determinantsJ.Chin Med J,2022,135(5):584-590.3 BOUVIER A M,LAUNOY G,BOUVIER V,et al.Incidence and patterns of late recurrences in colon canc-er patientsJ.Int J Cancer,2015,137(9):2133-2138.4 DUINEVELD L A M,VAN ASSELT K M,BEMELMAN W A,et al.Symptomatic and asympto-matic colon cancer 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