P75NTR裂解抑制剂对CPZ诱导脱髓鞘小鼠认知功能及海马髓鞘的改善作用.pdf

6期在中枢神经系统（central nervous system，CNS）中，髓鞘不仅在神经冲动的传导中发挥重要作用，在维持正常行为方面也至关重要1。因此，当髓鞘受损后，神经冲动的传导会被延迟甚至阻滞，行为方面也会有异常表现。研究2显示，脱髓鞘疾病（如多发性硬化、精神分裂症等）的各个脑区均存在不同程度的髓鞘脱失，其中海马髓鞘的脱失与记忆、学习及认知功能最为相关。并且，髓鞘损伤后，促进髓鞘的形成可以在一定程度上改善认知功能3。因此，探究髓鞘损伤后促进海马髓鞘形成的途径，具有重要的理论意义和实际应用价值。在 CNS 中，神经营养素在中枢正常功能的维持与损伤后的修复中都具有重要作用4。神经营养素通过 P75 神经营养素受体（neurotrophin re原ceptor P75，P75NTR）而介导下游通路，发挥生物学效应5。根据细胞内环境的不同，P75NTR 在结合神经营养素后既可以通过核因子-资B 途径提高细胞存活率，也可以在 琢 和 酌-分泌酶的顺序性切割（也称 P75 裂解）作用下诱导细胞凋亡6。进一步的研究7-9表明，脊髓、脑损伤后，阻断P75NTR 裂解，可以减少神经元、少突胶质细胞的凋亡，轴突可塑性及认知功能障碍也可以得到改善。最新研究10显示，P75NTR 参与神经保护及再生。本研究选用双环己酮草酰二腙（cuprizone，CPZ）构建脱髓鞘模型，通过观察抑制 P75 裂解对小鼠行为学及海马组织中髓鞘的影响，以明确P75NTR 在脱髓鞘模型小鼠认知功能及海马中髓鞘形成的作用。1材料与方法1.1实验动物56 周龄健康雄性 C57BL/6 小鼠 40 只，体质量（21依2）g，购自宁夏医科大学实验动物中心合格证编号：SCXK（宁）2020-0001，本研究经宁夏医科大学实验动物中心实验动物福利伦理委员会审核（批准号：2014-014）。所有小鼠饲养于 SPF 级动物房 温度（24.0依1.0）益，湿度 55%收稿日期：2022-11-23基金项目：国家自然科学基金项目（82060238）；宁夏自然科学基金项目（2022AAC03154）作者简介：陈飞飞（1989），男，在读硕士研究生，研究方向：神经损伤与修复。E-mail：通信作者：刘娟（1970），女，教授，研究方向：精神疾病与海马神经发生。E-mail：P75NTR 裂解抑制剂对 CPZ 诱导脱髓鞘小鼠认知功能及海马髓鞘的改善作用陈飞飞1，2，米晓娟1，丰子琦1，李君洁3，杨治伦1，刘娟1，4（1.宁夏医科大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系，银川750004；2.汾阳市人民医院，汾阳032200；3.宁夏医科大学口腔医学院，银川750004；4.宁夏医科大学宁夏颅脑疾病重点实验室，银川750004）摘要：目的探究 P75 神经营养素受体（neurotrophin receptor P75，P75NTR）裂解抑制剂对双环己酮草酰二腙（cuprizone，CPZ）诱导脱髓鞘小鼠认知功能及海马髓鞘的改善作用。方法采用连续喂食 0.2%CPZ 的方法构建急性脱髓鞘模型（CPZ 小鼠），同时设立对照组；5 周后，在 CPZ 小鼠海马区注射 P75NTR 裂解抑制剂或生理盐水。在第 6 周，通过水迷宫、高架十字迷宫实验检测小鼠行为学的改变；通过快蓝染色检测髓鞘脱失情况；通过 Western blot 检测海马组织中 P75NTR 及髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）的表达变化；通过免疫组织化学检测海马组织中 MBP 阳性表达量的变化。结果与对照组相比，CPZ 小鼠逃避潜伏期增加，跨台次数、进入开臂及在开臂中活动时间减少（P均约0.05）；快蓝染色结果显示，CPZ 小鼠胼胝体区髓鞘结构疏松，着色明显变浅；CPZ 小鼠海马区 P75NTR 表达增加（P约0.05）；CPZ 小鼠海马区 MBP 表达减少（P约0.05）。相比于生理盐水的干预，P75NTR 裂解抑制剂干预后，小鼠逃避潜伏期降低，进入开臂及在开臂中活动时间增加（P均约0.05）；P75NTR 裂解抑制剂干预后，小鼠海马区 MBP 表达上升（P约0.05）。结论抑制 P75NTR 的裂解可以改善 CPZ 模型小鼠的认知功能障碍，其作用机制与减轻海马中髓鞘脱失有关。关键词：脱髓鞘；P75 神经营养素受体；酌-分泌酶抑制剂；海马；双环己酮草酰二腙中图分类号：R322.8文献标识码：ADOI院10.16050/ki.issn1674-6309.2023.06.002第 45 卷6 期2023 年 6 月宁夏医科大学学报Journal of Ningxia Medical University文章编号：1674-6309（2023）06-547-06论著547窑窑宁夏医科大学学报4缘卷耀65%，12 h 昼夜循环，每笼 5 只，小鼠饮食、饮水自由。1.2主要试剂及仪器CPZ（C9012）购自美国 Sigma 公司，兔抗MBP多克隆抗体（ab218011）购自美国 Abcam 公司，鼠抗 茁-actin 单克隆抗体（TA-09）、兔抗 GAPDH 单克隆抗体（TA-08）均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，兔抗 P75NTR 购自成都正能生物技术有限责任公司（381005）。全蛋白提取试剂盒（KGP250）、BCA 蛋白含量检测试剂盒（KGPBCA）均购自江苏凯基生物技术股份有限公司，化学发光检测试剂盒（SQ202）购自上海雅酶生物医药科技有限公司。奥林巴斯 BX51 正置显微镜购自日本 Olympus 公司。AI600 成像系统购自美国通用电气公司，DB001 Morris 水迷宫实验装置购自北京智鼠多宝生物科技有限责任公司，荧光显微镜购自德国 LEICA 公司。1.3脱髓鞘模型的制备和动物分组将 40 只小鼠随机分为正常（Control）组、模型（CPZ）组、酌-分泌酶抑制剂 DAPT 处理（CPZ-DAPT）组和生理盐水处理（CPZ-NS）组，每组 10只。Control 组小鼠正常饲养，其他组别喂食含0.2%CPZ 的饲料，5 周后分别在 CPZ-DAPT 组和 CPZ-NS 组小鼠海马区注射 DAPT 和生理盐水，注射完成后继续同前饲养 1 周。第 6 周进行后续实验。实验流程均严格按照 关于善待实验动物的指导性意见 的相关规定执行。1.4方法1.4.1Morris 水迷宫实验选用经典的 Morris水迷宫系统，泳池内注入适量自来水（淹没平台约 1 cm）后加入无毒、环保的白色色素染色剂，使水变成白色不透明状，水温恒定（24.0依1.0）益，实验过程中保持安静的周围环境。实验分为定位巡航和空间探索两部分11。1.4.2高架十字迷宫实验所采用的高架十字迷宫包括开放臂和封闭臂各 圆 个，四臂互相交汇形成十字状。实验过程中保持周围环境的安静，且每只小鼠在进行该实验前均用 75%乙醇擦拭各臂，以消除前只小鼠残留的气味12。1.4.3立体定位注射称重小鼠，吸入 3.5%异氟醚 N2O颐O2（70颐30）的混合物，待小鼠无深度反射后进行手术。实验中 DAPT 的剂量为 0.03 mg kg-1，注射泵推进速度为 0.05 滋L min-1，注射结束后继续等待 5 min 以保证药物弥散。将术后小鼠放置于电热毯中直至恢复清醒，然后继续饲养13。1.4.4快蓝染色检测模型组小鼠髓鞘脱失将小鼠完整的脑组织经固定、脱水及石蜡包埋后切片。将组织切片用二甲苯脱蜡后浸于 95%乙醇4耀6 min，再将切片浸入配制好的快蓝染液中 56 益过夜；次日取出复温后用蒸馏水冲洗，依次浸入碳酸锂和 75%乙醇中分化；再经梯度乙醇、二甲苯脱水，透明后封片，于镜下观察脑组织脱髓鞘情况。1.4.5Western blot 检测 MBP 和 P75NTR 蛋白的表达行为学实验结束后麻醉、脱颈处死小鼠，于冰上快速取出海马组织，提取小鼠海马总蛋白后 BCA 法测定蛋白浓度。将蛋白按照提前计算好的上样量加到各泳道，进行电泳。转膜：裁剪适当大小的 PVDF 膜，在 4 益冰箱中按照 1耀1.5 kDa min-1进行恒流/恒压转膜。封闭及孵育抗体：转膜完成，将 PVDF 膜置于 5%脱脂牛奶中室温封闭 1 h 后孵育一抗（1颐1 000），4 益过夜；次日，漂洗后室温下孵育二抗（1颐5 000）1 h，再次漂洗后曝光。曝光：ECL 显色并记录，Image J 软件分析目的蛋白条带结果，最后经均一化处理后进行统计分析。1.4.6免疫组织化学检测海马组织中 MBP 阳性细胞数量的变化将小鼠完整的脑组织经固定、脱水及石蜡包埋后切片。切片分别于二甲苯、梯度乙醇中脱蜡，置于柠檬酸盐缓冲液中进行抗原修复 10 min，自然降至室温后滴加内源性过氧化物酶阻断剂到海巴组织上，室温孵育 20 min，加一抗（1颐200）4 益过夜，次日复温 1 h 后滴加酶标羊抗小鼠/兔 IgG 聚合物，室温孵育 1 h，滴加新鲜配制的 DAB 显色液，显色满意后用苏木素复染，1%盐酸乙醇分化并脱水，透明后用中性树脂封片。用奥林巴斯 BX51 正置显微镜拍摄采片后，Image J 软件统计小鼠海马区的阳性细胞。1.5统计学方法采用 SPSS 23.0 软件及 GraphPad Prism 8.0软件对数据进行统计学分析，经正态性检验呈正态分布的计量资料以均数依标准差（x依s）表示，两组间比较采用 t 检验，多组间比较采用单因素方差分析；非正态分布的计量资料采用中位数（第25 百分位数，第 75 百分位数）M（P25，P75）描述，组间比较采用非参数检验。P臆0.05 为差异有统计学意义。548窑窑6期2结果2.1CPZ 诱导小鼠出现认知功能减退2.1.1Morris 水迷宫相比于 Control 组，CPZ 组小鼠逃避潜伏期 （19.43依1.79）s vs.（29.55依3.47）s延长，跨越平台次数 （1.50依0.97）次 vs.（0.70依0.67）次 减少（P 均约0.05），提示 CPZ 组小鼠学习记忆能力和空间认知能力下降，见图 1A。2.1.2高架十字水迷宫与 Control 组相比，CPZ组小鼠进入开臂的次数 （20.90依8.77）次 vs.（10.10依4.68）次 及在开臂中滞留的时间 （106.00依35.91）s vs.（49.78依34.93）s 减少（P 均约0.05），提示CPZ组小鼠出现焦虑样症状，见图 1B。2.2CPZ 对小鼠胼胝体髓鞘完整性的作用快蓝染色可显示髓鞘的完整性，结果如图 2所示：Control 组小鼠大脑胼胝体区着色明显，CPZ 组着色减少，提示 CPZ 诱导后小鼠脑内出现明显的髓鞘脱失。悦ontrol 组悦PZ 组50 滋m50 滋m图 2快蓝染色检测 CPZ 对小鼠胼胝体髓鞘的影响2.3CPZ 对小鼠海马组织中 P75NTR 蛋白表达的作用与 Control 组相比，CPZ 组小鼠海马组织中P75NTR 的表达升高（P约0.0员），提示 CPZ 诱导P75NTR 高表达，P75NTR 可能参与脱髓鞘过程，见图 3。2.4CPZ 对小鼠海马组织中 MBP 表达的作用与对照组相比，CPZ 喂养可降低 MBP 的表达（P约0.05），提示 CPZ 诱导小鼠海马组织中髓鞘脱失，见图 4。2.5DAPT 可改善 CPZ 诱导的小鼠认知功能减退2.5.1Morris 水迷宫实验相比于生理盐水干预，DAPT 干预的小鼠逃避潜伏时长 （28.95依1.73）s vs.（24.50依1.29）s 缩短（P约0.05），而跨越平台次数 （0.70依0.63）次 vs.（1.20依0.67）次 差异无统计学意义（P跃0.05），见图 5粤。2.5.2高架十字水迷宫实验相比于生理盐水干 预，DAPT 干预 的小鼠进入 开放臂 的 次数（8.50依3.13）次 vs.（12.20依3.34）次 及在开放臂中滞留的时间 （68.28依33.73）s vs.（93.41依13.35）A.Morris 水迷宫实验；B.高架十字水迷宫实验；*P0.05，*P0.01。图 1水迷宫、高架十字迷宫检测 CPZ 对小鼠行为的影响陈飞飞，等.P75NTR裂解抑制剂对CPZ诱导脱髓鞘小鼠认知功能及海马髓鞘的改善作用AB*源园猿园圆园员园园猿圆员园猿园圆园员园园圆园园员缘园员园园缘园园缘园源园猿园圆园员园园P75NTRGAPDH月粤*2.01.51.00.50.0A.小鼠海马组织中 P75NTR 的 Western blot 结果；B.小鼠海马组织中 P75NTR 蛋白相对表达量；*P0.01。图 3CPZ 对小鼠海马 P75NTR 表达的影响549窑窑宁夏医科大学学报4缘卷A.小鼠海马组织中 MBP 的 Western blot 结果；B.小鼠海马组织中 MBP蛋白相对表达量统计结果；C.小鼠海马组织中MBP的阳性表达量结果；D.小鼠海马组织中 MBP 阳性百分比统计结果；*P0.01；Bar=20 滋m。图 4Western blot、免疫组化检测 CPZ 对小鼠海马 MBP 表达的影响A.Morris 水迷宫实验；B.高架十字水迷宫实验；*P0.05。图 5DAPT 对小鼠行为的影响s 延长（P 均约0.05），见图 5B。2.6DAPT 对小鼠海马组织中 MBP 表达的作用与生理盐水干预相比，DAPT 的干预可逆转MBP 表达水平的降低（P约0.05），提示 DAPT 阻止了海马中髓鞘的脱失，见图 6。3讨论目前，通过实验研究发现了很多脱髓鞘疾病的治疗靶点，但因其发病机制尚未完全阐明，临床转化过程受阻，该类疾病也一直缺乏有效的治疗手段。该类疾病髓鞘脱失后恢复的完整程度与患者预后相关，即髓鞘损伤后修复活跃的患者病变程度更轻14。P75NTR 在神经损伤和疾病过程中的独特作用使它成为研究者关注的焦点。本研究表明，急性脱髓鞘模型中，P75NTR 蛋白表达上调；在髓鞘脱失后髓鞘碎片增多的情况下，靶向性抑制 P75 裂解可增加海马区髓鞘蛋白的表达，小鼠认知功能也得到了改善。P75NTR 是一种跨膜蛋白，属于低亲和力受体，能以相同的亲和力与所有的营养素结合15。在神经发育期 P75NTR 呈高表达状，成年后表达BADC*悦ontrol 组悦PZ 组MBP茁-actin1.51.00.50.0151050AB*2.01.51.00.50.04030201002015105015010050050403020100悦ontrol 组悦PZ 组550窑窑6期下降且维持在较低水平，而在阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化及多发性硬化等神经退行性疾病中，P75NTR 的表达再次上调16。CPZ是一种铜离子螯合剂，持续低剂量给药可以诱导CNS 中海马、胼胝体及皮层等多个脑区出现脱髓鞘，模型中实验小鼠的行为及病理改变与脱髓鞘患者类似，且停药后受损的髓鞘可自行修复17。本研究通过连续喂食含 0.2%CPZ 饲料的方法构建模型，模型中 P75NTR 表达上调，因此推测P75NTR 与髓鞘的脱失过程有关。在神经退行性疾病中，P75NTR 通过介导其下游的多条信号通路而导致疾病的发生与发展。其中，在轴突的生成和可塑性方面，P75NTR 在与神经元、少突胶质细胞表面的相关受体形成复合物后被激活，再经 琢 和 酌-分泌酶切割（P75 裂解）后调控细胞的生长、发育及凋亡，也影响着认知功能18。脊髓损伤后，P75NTR 具有介导少突胶质细胞脱髓鞘的作用；敲除 P75NTR，损伤后少突胶质细胞的凋亡减少7。在外周神经系统损伤后的修复中，虽然 P75NTR 发挥作用的具体机制尚不完全清楚，但抑制 P75NTR 裂解后神经元轴突的变性、回缩及神经功能障碍均得到改善19。还有研究20-21显示，P75NTR 在神经损伤后的神经行为变化中发挥着关键作用。本实验靶向性抑制P75 裂解，脱髓鞘小鼠海马区 MBP 的表达上调，小鼠的认知功能也得到改善，本实验结果进一步印证了 P75NTR 影响认知功能的论证。综合以上实验结果，本课题组推测在髓鞘脱失后髓鞘碎片增多的微环境中，P75NTR 通过抑制髓鞘的形成进而影响轴突的生成与可塑性，最终影响认知功能，导致疾病的发生与发展。但是，在髓鞘损伤后的微环境中，P75NTR 究竟与什么细胞作用最终影响了 MBP 的表达，与该细胞表面的相关受体是否形成了复合物，形成复合物后激活的下游通路是什么，特别是对直接参与髓鞘形成的少突胶质细胞及少突胶质前体细胞的影响仍不明确，需要进一步深入研究。因此，后续将进一步探讨 P75NTR 在髓鞘修复过程中的具体机制，特别是在体外细胞层面加以明确相关机制，为阐明脱髓鞘疾病的机制提供证据，以期为临床治疗脱髓鞘疾病提供新的理论依据，也为相关药物的研发提供新思路。参考文献：1 Teuscher C，Bunn JY，Fillmore PD，et al.Gender，age，and season at immunization uniquely influence thegenetic control of susceptibility to histopathological le原sions and clinical signs of experimental allergic en原cephalomyelitis：implications for the genetics of multi原ple sclerosis J.Am J Pathol，2004，165（5）：1593-1602.2 Barry DN，Maguire EA.Remote memory and the hip原pocampus：A constructive critique J.Trends Cogn Sci，2019，23（2）：128-142.3 Chen JF，Liu K，Hu B，et al.Enhancing myelin renewalreverses cognitive dysfunction in a murine model ofAlzheimer s disease J.Neuron，2021，109（14）：2292-2307.4 Houlton J，Abumaria N，Hinkley SFR，et al.Therapeu原tic potential of neurotrophins for repair after brain in原A.小鼠海马组织中 MBP 的 Western blot 结果；B.小鼠海马组织 MBP蛋白相对表达量统计结果；C.小鼠海马组织中 MBP的阳性表达量结果；D.小鼠海马组织中 MBP阳性表达量的统计结果；*P0.05；Bar=20 滋m。图 6Western blot、免疫组化检测 DAPT 对小鼠海马 MBP 表达的影响BADCMBP茁-actinCPZ-DAPT 组悦PZ-NS 组MBP*陈飞飞，等.P75NTR裂解抑制剂对CPZ诱导脱髓鞘小鼠认知功能及海马髓鞘的改善作用0.80.60.40.10.01086420551窑窑宁夏医科大学学报4缘卷Effect of P75NTR Cleavage Inhibitor on Cognitive Function and MyelinSheath in Hippocampus of Cuprizone-induced Demyelination MiceCHEN Feifei1，2，MI Xiaojuan1，FENG Ziqi1，LI Junjie3，YANG Zhilun1，LIU Juan1，4（1.Department of Human Anatomy and Tissue Embryology，School of Basic Medical Sciences，Ningxia MedicalUniversity，Yinchuan750004，China；2.Fenyang People s Hospital，Fenyang032200，China；3.Stomatology Medical College，Ningxia Medical University，Yinchuan750004，China；4.Ningxia KeyLaboratory of Cerebrocranial Disease，Ningxia Medical University，Yinchuan750004，China）Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of neurotrophin receptor P75（P75NTR）cleavage inhibitor oncognitive function and myelin sheath in hippocampus of demyelinating mice model induced by cuprizone（CPZ）.MethodsAcute demyelination model（CPZ mice）was established by continuous feeding with 0.2%CPZ，anda Control group was set up.After 5 weeks，CPZ mice were injected with P75NTR cleavagejury：A helping hand from biomaterials J.Front Neu原rosci，2019，13：790.5 Casaccia-Bonnefil P，Kong H，Chao MV.Neurotrophins：the biological paradox of survival factors elicitingapoptosis J.Cell Death Differ，1998，5（5）：357-364.6 Longo FM，Massa SM.Small-molecule modulation ofneurotrophin receptors：a strategy for the treatment ofneurological disease J.Nat Rev Drug Discov，2013，12（7）：507-525.7 Beattie MS，Harrington AW，Lee R，et al.ProNGF in原duces p75-mediated death of oligodendrocytes follow原ing spinal cord injury J.Neuron，2002，36（3）：375-386.8 Delbary-Gossart S，Lee S，Baroni M，et al.A novelinhibitor of p75-neurotrophin receptor improves func原tional outcomes in two models of traumatic brain in原jury J.Brain，2016，139（Pt 6）：1762-1782.9Simmons DA，Mills BD，Butler Iii RR，et al.Neu原roimaging，urinary，and plasma biomarkers of treat原ment response in Huntington s disease：preclinicalevidence with the p75NTR Ligand LM11A-31J.Neurotherapeutics，2021，18（2）：1039-1063.10 Delivanoglou N，Boziki M，Theotokis P，et al.Spatio-temporal expression profile of NGF and the two-re原ceptor system，TrkA and p75NTR，in experimentalautoimmune encephalomyelitis J.J Neuroinflamma原tion，2020，17（1）：41.11 Guo L，Xiao P，Zhang X，et al.Inulin amelioratesschizophrenia via modulation of the gut microbiota andanti-inflammation in mice J.Food Funct，2021，12（3）：1156-1175.12 Xue Y，Zhu X，Yan W，et al.Dietary supplementationwith acer truncatum oil promotes remyelination in amouse model of multiple sclerosis J.Acer truncatum，2022，16：860280.13Liu Q，Lv HW，Yang S，et al.NEP1-40 alleviatesbehavioral phenotypes and promote oligodendrocyteprogenitor cell differentiation in the hippocampus ofcuprizone-induced demyelination mouse modelJ.Neurosci Lett，2020，725：134872.14 Ritala JF，Lyne SB，Sajanti A，et al.Towards a com原prehensive understanding of p75 neurotrophin recep原tor functions and interactions in the brain J.NeuralRegen Res，2022，17（4）：701-704.15 Bramow S，Frischer JM，Lassmann H，et al.Demyeli原nation versus 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sepsis-induced synaptic andcognitiveimpairments J .Behav BrainRes，2018，347：339-349.（责任编辑：刘瑛）（下转第 559 页）552窑窑6期inhibitor or normal saline in the hippocampus.In the 6th week，the changes of mice behavior were detected byMorris Water Maze and Elevated Plus Maze.Fast blue staining was used to study the change of myelin sheath inthe corpus callosum.The expressions of P75NTR and myelin basic protein（MBP）in hippocampus were detectedby Western blot.Immunohistochemistry was used to detect the change of MBP positive expression in hippocam-pus.ResultsCompared with the Control group，CPZ mice showed increased in the escape latency，and de-creased the number of platform crossing，entering the open arm，and the time spent in the open arm（Pall0.05）.The fast-blue staining results showed that the mouse treated with CPZ presented demyelination inthe corpus callosum，the coloring is obviously lighter.The expression of MBP in the hippocampus of CPZgroup was decreased，while the expression of P75NTR was increased（P0.05）.Compared with salineintervention，the mice treated with P75NTR cleavage inhibitor showed decreased escape latency，and in-creased the number of entering the open arm，and the time spent in the open arm（P all0.05）.The expres-sion of MBP in the hippocampus of mice were increased after DAPT intervention（P0.05）.ConclusionIn-hibition of P75NTR cleavage can improve cognitive dysfunction in cuprizone model mice，and the mechanism isrelated to the alleviation of demyelination in the hippocampus.Key words：demyelination；neurotrophin receptor P75；-secretase inhibitor；hippocampal；cuprizoneConstruction and Phenotypic Analysis of Conditional Knockout Mice forthe POMC Neuron Isl1 GeneHUANG Liwen1，LI Xue1，2，PAN Pengge1，2，LIU Meichen2，ZHANG Qian2，MA Ping2，YIN Haitao2，PEI Xiuying1，2（1.Key Laboratory of Fertility Preservation and Maintenance of Ministry of Education，Ningxia MedicalUniversity，Yinchuan750004，China；2.School of Basic Medical Sciences，Ningxia Medical University，Yinchuan750004，China）Abstract：ObjectiveTo establish conditional knockout mice for Isl1 on POMC neurons and preliminary anal-ysis of their phenotype.MethodsA conditional knockout mouse model was constructed using the Cre/LoxPsystem，and Isl1flox/floxmice were obtained by Isl1flox/+self-crossing，then Isl1flox/floxmice were mated with POMCCregenotype mice to obtain POMCCre；Isl1flox/+male mice，POMCCre；Isl1flox/+male mice were then mated with Isl1flox/floxfemales and genotyped by PCR to obtain Isl1 conditional knockout mice on POMC neurons（POMCCre；Isl1flox/flox，abbreviated Isl1驻POMC），and the knockout efficiency was verified by immunoblotting.The presence of sponta-neous lesions in major tissues and organs were investigated by functional and histopathological methods.ResultsThe results showed that the knockout efficiency of ISL1 in the hypothalamic arcuate nucleus of Isl1驻POMCmicewas greater than 90%（P0.05），which proved the POMC neuronal Isl1 knockout mouse model was established successfully.The phenotypeof Isl1驻POMCmice showed spontaneous progressive obesity，metabolic syndrome and impaired fertility after puber-ty.ConclusionWe successfully constructed Isl1 conditional knockout