正常和肿瘤组织细胞的培养专家讲座.pptx

正常和肿瘤组织细胞培养正常和肿瘤组织细胞培养BinLu,Ph.D.正常和肿瘤组织细胞的培养第1页内内 容容正常组织细胞培养正常组织细胞培养 上皮细胞体外培养上皮细胞体外培养 血管内皮细胞体外培养血管内皮细胞体外培养 肾小管上皮细胞培养肾小管上皮细胞培养 巨噬细胞培养巨噬细胞培养 淋巴细胞培养淋巴细胞培养肿瘤细胞培养肿瘤细胞培养正常和肿瘤组织细胞的培养第2页不一样组织细胞和器官结构和功效、生不一样组织细胞和器官结构和功效、生长特征不一样，在体外培养中所需分离方长特征不一样，在体外培养中所需分离方法和生长条件也不一样。法和生长条件也不一样。正常和肿瘤组织细胞的培养第3页上皮细胞体外培养上皮细胞体外培养许多器官上上皮细胞含有特定功效，如肾和肠道上皮细胞含许多器官上上皮细胞含有特定功效，如肾和肠道上皮细胞含有吸收功效，肝和胰上皮细胞分泌功效，肺上皮细胞气体交有吸收功效，肝和胰上皮细胞分泌功效，肺上皮细胞气体交换功效；换功效；上皮组织还常发生肿瘤。上皮组织还常发生肿瘤。正常和肿瘤组织细胞的培养第4页上皮细胞基本特征：上皮细胞基本特征：1.上皮组织形态结构上皮组织形态结构群体依赖性（群体依赖性（populationdependence)接触抑制（接触抑制（contactinhibition)2.上皮细胞极性上皮细胞极性贴壁依赖性细胞贴壁依赖性细胞-贴壁生长贴壁生长生长基质生长基质3.上皮细胞间连接上皮细胞间连接正常和肿瘤组织细胞的培养第5页体外培养上皮组织细胞生长生物学体外培养上皮组织细胞生长生物学1.形态学结构：形态学结构：均质性、透明性很强，结构不显著均质性、透明性很强，结构不显著正常和肿瘤组织细胞的培养第6页2.体外培养上皮组织生长与增殖特征体外培养上皮组织生长与增殖特征(1)体外培养特殊条件：体外培养特殊条件：l防范微生物污染防范微生物污染l生长基质支持生长基质支持l特殊培养基特殊培养基M199RPMI1640DMEMFamF12无血清培养基无血清培养基l去成纤维细胞去成纤维细胞正常和肿瘤组织细胞的培养第7页依据上皮组织分布特征，位于体表或衬贴消化道、依据上皮组织分布特征，位于体表或衬贴消化道、呼吸道内等处上皮组织，直接暴露或同外环境相接触，呼吸道内等处上皮组织，直接暴露或同外环境相接触，组织本身带有各种病原微生物或受其污染机会较多。组织本身带有各种病原微生物或受其污染机会较多。要求在组织取材时就严格灭菌；分离、种植、培养等很多操作要求在组织取材时就严格灭菌；分离、种植、培养等很多操作步骤上都要设法消除可能会出现微生物污染。步骤上都要设法消除可能会出现微生物污染。培养中所使用各种液体，包含细胞培养中所使用各种液体，包含细胞保留液、分离液保留液、分离液以及以及培养基培养基等需添加等需添加抗生素抗生素，抗生素抗生素浓度比其它组织培养高。浓度比其它组织培养高。防范微生物污染防范微生物污染正常和肿瘤组织细胞的培养第8页皮细胞依赖贴附于某种支持物上才能生长，即所谓皮细胞依赖贴附于某种支持物上才能生长，即所谓贴壁依赖性细胞。贴壁依赖性细胞。在培养器皿表面包被生长基质，如胶原或其它细胞外基在培养器皿表面包被生长基质，如胶原或其它细胞外基质成份等，模拟体内基膜结构，不但尤其有利于上皮质成份等，模拟体内基膜结构，不但尤其有利于上皮细胞贴附和生长，也有利于培养细胞分化使细胞细胞贴附和生长，也有利于培养细胞分化使细胞极性表现更为显著。极性表现更为显著。生长基质支持生长基质支持正常和肿瘤组织细胞的培养第9页M199和和RPMI1640培养基仅适适用于上皮组织短期培养和维持培养基仅适适用于上皮组织短期培养和维持其生存，对上皮组织长久培养和促增殖作用并不显著。其生存，对上皮组织长久培养和促增殖作用并不显著。DMEM和和HamFl2培养基用于上皮组织培养时有其特殊作用。培养基用于上皮组织培养时有其特殊作用。可促进上皮细胞贴附；维持上皮细胞在体外培养状态分化。可促进上皮细胞贴附；维持上皮细胞在体外培养状态分化。HamFl2培养基特殊性尤其适用原代上皮细胞培养，培养基培养基特殊性尤其适用原代上皮细胞培养，培养基成份中添加微量元素无机离子，愈加利于细胞生长和代谢。成份中添加微量元素无机离子，愈加利于细胞生长和代谢。在实际培养时，将在实际培养时，将DMEM与与HamFl2按一定百分比混适用于上皮组按一定百分比混适用于上皮组织培养。织培养。特殊培养基特殊培养基正常和肿瘤组织细胞的培养第10页去除成纤维细胞去除成纤维细胞上皮组织借薄层基膜和结缔组织相连。取材分离细胞时上皮组织借薄层基膜和结缔组织相连。取材分离细胞时会带入少许结缔组织成份，经常造成成纤维细胞与上皮会带入少许结缔组织成份，经常造成成纤维细胞与上皮细胞混和生长。因为成纤维细胞含有增殖能力和粘附能细胞混和生长。因为成纤维细胞含有增殖能力和粘附能力强特点，很轻易力强特点，很轻易“疯长疯长”为培养物中优势细胞群，为培养物中优势细胞群，从而干扰或抑制上皮细胞生长，成为上皮细胞从而干扰或抑制上皮细胞生长，成为上皮细胞“细胞污染源细胞污染源”。所以在上皮细胞取材、分离、种植和传代培养过程所以在上皮细胞取材、分离、种植和传代培养过程中，要尤其注意上皮细胞纯化，去除和抑制成纤维细中，要尤其注意上皮细胞纯化，去除和抑制成纤维细胞生长。胞生长。正常和肿瘤组织细胞的培养第11页(2)(2)体外培养上皮细胞形态学改变体外培养上皮细胞形态学改变体外培养上皮细胞形态学改变体外培养上皮细胞形态学改变正常和肿瘤组织细胞的培养第12页体外培养上皮组织细胞观察与检测体外培养上皮组织细胞观察与检测1.普通形态学观察普通形态学观察光镜：光镜：形态、轮廓、生长情况等。形态、轮廓、生长情况等。细胞规则、明亮而饱满、细胞轮廓不清细胞规则、明亮而饱满、细胞轮廓不清电镜：电镜：桥粒、形态结构特征、细胞间关系桥粒、形态结构特征、细胞间关系培养液培养液pH改变：改变：颜色改变？颜色改变？培养物污染情况：培养物污染情况：透明度改变？透明度改变？正常和肿瘤组织细胞的培养第13页2.组织化学与免疫组织化学观察与检测组织化学与免疫组织化学观察与检测酶类：酶类：碱性磷酸酶碱性磷酸酶琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶特异性抗原标识物：特异性抗原标识物：角蛋白、上皮细胞膜抗原角蛋白、上皮细胞膜抗原VIII因子、晶体蛋白、唾液酸糖蛋白因子、晶体蛋白、唾液酸糖蛋白正常和肿瘤组织细胞的培养第14页血管内皮细胞体外培养血管内皮细胞体外培养正常和肿瘤组织细胞的培养第15页人脐静脉内皮细胞培养人脐静脉内皮细胞培养组织起源：组织起源：婴儿脐带婴儿脐带培养用液：培养用液：M199+20%FCSD-Hanks0.1%胶原酶溶液胶原酶溶液1.主要材料：主要材料：正常和肿瘤组织细胞的培养第16页2.培养方法：培养方法：分离细胞培养法正常和肿瘤组织细胞的培养第17页1).将15-20cm长新生儿脐带放入无菌PBS溶液中储存。（注：4下最多贮存24小时，室温下不超出6小时，不然废弃）2).用一个钝头针头扎入脐带静脉管中，用无菌PBS溶液冲洗3-5次，将污血冲洗洁净为止。3).用手术钳夹紧脐带下端，加入15ml胶原酶（1mg/ml）室温下消化15-20分钟，并不时上下摇动脐带。4).消化完后，将下端手术钳松开，消化液流入一个50ml无菌离心管中，用无菌PBS溶液冲洗脐带2-3次。5).将搜集液离心（转/分）3分钟，去上清，加入RPMI1640培养液制成细胞悬液，接种入培养器皿中，置CO2培养箱中培养，两至三天可见细胞长成单层。正常和肿瘤组织细胞的培养第18页(1)关于接种材料制备关于接种材料制备取材与消化取材与消化消化酶、浓度、时间消化酶、浓度、时间(2)排除成纤维细胞排除成纤维细胞传代去除法传代去除法加肝素培养法加肝素培养法(90u/ml)刮除法刮除法(3)关于培养液关于培养液(4)关于传代培养关于传代培养5.讨论：正常和肿瘤组织细胞的培养第19页(1)光镜检验光镜检验(2)透射电镜检验：透射电镜检验：W-P小体小体(3)VIII因子相关抗原免疫组化检测因子相关抗原免疫组化检测6.内皮细胞判定：内皮细胞判定：正常和肿瘤组织细胞的培养第20页肾小管上皮细胞培养肾小管上皮细胞培养正常和肿瘤组织细胞的培养第21页1.主要材料：主要材料：a.细胞起源：细胞起源：b.无血清培养液：无血清培养液：基础培养液：基础培养液：DMEM/HamF12(1:1)添加物：添加物：胰岛素胰岛素5 g/ml转铁蛋白转铁蛋白5 g/ml硒硒5 g/ml氢化可松氢化可松36ng/mlT34ng/mlEGF10 g/ml正常和肿瘤组织细胞的培养第22页c.消化液：消化液：0.2%胰蛋白酶胰蛋白酶d.细胞筛网：细胞筛网：80和和100目目正常和肿瘤组织细胞的培养第23页2.原代培养：原代培养：切取切取1cm3外层肾皮质、剪碎成外层肾皮质、剪碎成1mm380目研磨冲洗、于目研磨冲洗、于100目上搜集肾小管节段目上搜集肾小管节段0.2%胰蛋白酶消化、调整细胞数胰蛋白酶消化、调整细胞数接种于纤维连接蛋白包被培养瓶进行培养接种于纤维连接蛋白包被培养瓶进行培养每隔每隔34天，更换培养液天，更换培养液正常和肿瘤组织细胞的培养第24页3.传代培养：传代培养：4.培养结果：培养结果：3d长出细胞长出细胞57d进入对数生长久进入对数生长久79d融合成单细胞层融合成单细胞层5.判定：判定：抗角蛋白抗体染色（抗角蛋白抗体染色（+）正常和肿瘤组织细胞的培养第25页6.注意事项：注意事项：a.分离方法：分离方法：b.判定方法：判定方法：正常和肿瘤组织细胞的培养第26页巨噬细胞培养巨噬细胞培养巨噬细胞属免疫细胞，有各种功效，是研究细胞吞噬、巨噬细胞属免疫细胞，有各种功效，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学主要对象。细胞免疫和分子免疫学主要对象。巨噬细胞轻易取得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细巨噬细胞轻易取得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活23周，多用做原周，多用做原代培养，难以长久生存。代培养，难以长久生存。巨噬细胞也建有没有限细胞系，大巨噬细胞也建有没有限细胞系，大多来自小鼠，如多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l，培养中呈巨，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功效，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。噬细胞形态和吞噬功效，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。培养巨噬细胞可用各样方法和各种起源来获取细胞，以小鼠培养巨噬细胞可用各样方法和各种起源来获取细胞，以小鼠腹腔取材法最为实用。腹腔取材法最为实用。正常和肿瘤组织细胞的培养第27页1、试验前三天，向小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤、试验前三天，向小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤lml（勿注（勿注入肠内！），以刺流产生大量巨噬细胞。入肠内！），以刺流产生大量巨噬细胞。2、引颈处死小鼠。、引颈处死小鼠。3、手提鼠尾将其全浸入手提鼠尾将其全浸入70%乙醇中乙醇中35秒。秒。4、置动物于解剖台，、置动物于解剖台，用针头固定四肢，持镊撕开腹部皮肤，但勿伤及腹膜壁，把皮肤用针头固定四肢，持镊撕开腹部皮肤，但勿伤及腹膜壁，把皮肤拉向上下两侧，暴露出腹膜壁。拉向上下两侧，暴露出腹膜壁。5、用、用70%酒精擦洗腹膜壁，注酒精擦洗腹膜壁，注射器吸射器吸10mlEagle液注入腹腔中，同时用手指从两侧压揉腹膜壁，液注入腹腔中，同时用手指从两侧压揉腹膜壁，使液体在腹腔内流动。使液体在腹腔内流动。6、用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧使、用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧使腹腔中液体集中于针头下吸收入针管内。腹腔中液体集中于针头下吸收入针管内。7、小心拔出针头，把、小心拔出针头，把液体注入离心管。液体注入离心管。8、4下下250g离心离心10分钟后，去上清，加分钟后，去上清，加10mlDMEM培养基。培养基。9、计数细胞。每只鼠可产生、计数细胞。每只鼠可产生20一一30106细胞，其中细胞，其中90%为巨噬细胞。为巨噬细胞。10、以、以3105个贴附细胞个贴附细胞/平方厘米平方厘米接种。接种。11、接种数小时后，除去培养液，可去除其它白细胞，纯、接种数小时后，除去培养液，可去除其它白细胞，纯化培养细胞，用化培养细胞，用DMEM液冲洗液冲洗1一一2次，再加新次，再加新DMEM培养液置培养液置CO2温箱中。温箱中。正常和肿瘤组织细胞的培养第28页巨噬细胞培养巨噬细胞培养动物：动物：小鼠、大鼠、兔、人小鼠、大鼠、兔、人培养基：培养基：EagleMEMRPMI1640HamF12惯用巨噬细胞：惯用巨噬细胞：肺泡和腹腔巨噬细胞肺泡和腹腔巨噬细胞正常和肿瘤组织细胞的培养第29页获取巨噬细胞方法获取巨噬细胞方法（一）肺泡巨噬细胞（一）肺泡巨噬细胞支气管肺泡灌洗法支气管肺泡灌洗法支气管镜肺泡灌洗法支气管镜肺泡灌洗法（二）腹腔巨噬细胞（二）腹腔巨噬细胞1.小鼠腹腔巨噬细胞获取：小鼠腹腔巨噬细胞获取：(1)主要材料：主要材料：试验动物试验动物:6周龄小鼠周龄小鼠培养液：培养液：10%FCSRPMI1640正常和肿瘤组织细胞的培养第30页巨噬细胞纯化巨噬细胞纯化1 1、原理：、原理：巨噬细胞黏附能力强、贴壁快特点巨噬细胞黏附能力强、贴壁快特点2.2.方法：方法：用帖壁法纯化巨噬细胞用帖壁法纯化巨噬细胞用不连续密度梯度离心纯化巨噬细胞用不连续密度梯度离心纯化巨噬细胞正常和肿瘤组织细胞的培养第31页1用含用含2040小牛血清小牛血清RPMI-1640培养液将巨噬细胞配成培养液将巨噬细胞配成21064106/ml浓度。以每平方厘米浓度。以每平方厘米21054105个巨噬细胞个巨噬细胞密度将细胞悬液接种到玻璃培养皿（瓶）或塑料培养皿（瓶）密度将细胞悬液接种到玻璃培养皿（瓶）或塑料培养皿（瓶）中。中。375CO2培养箱中培养培养箱中培养1小时或小时或24小时。小时。1小时培养节小时培养节约时间但会丢失一些粘附力弱巨噬细胞，而约时间但会丢失一些粘附力弱巨噬细胞，而24小时能够得到较小时能够得到较多巨噬细胞。多巨噬细胞。2040小牛血清能够降低小牛血清能够降低B淋巴细胞粘附。淋巴细胞粘附。2摇摆培养皿（瓶），悬浮未粘附细胞，吸出细胞悬液。用预摇摆培养皿（瓶），悬浮未粘附细胞，吸出细胞悬液。用预温温Hanks液洗涤细胞液洗涤细胞34次。悬浮细胞可重复粘附，得到更多次。悬浮细胞可重复粘附，得到更多巨噬细胞。用适量含巨噬细胞。用适量含2.5mMEDTA无钙镁无钙镁Hanks液消化细胞液消化细胞371530分钟。用吸管吹打分离细胞，离心分钟。用吸管吹打分离细胞，离心250g10分钟，分钟，去上清液。去上清液。3用预冷用预冷Hanks液洗涤细胞液洗涤细胞34次，每次离心次，每次离心250g10min，去上清。最终用含去上清。最终用含10FBSRPMI-1640培养液悬浮细胞，台盼培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数细胞并测细胞活力，将细胞配成所需浓度。蓝染色计数细胞并测细胞活力，将细胞配成所需浓度。用帖壁法纯化巨噬细胞用帖壁法纯化巨噬细胞 正常和肿瘤组织细胞的培养第32页1取取15ml离心管，将制备好各浓度密度梯度材料按下浓上淡离心管，将制备好各浓度密度梯度材料按下浓上淡次序依次分层加在离心管中，每个浓度次序依次分层加在离心管中，每个浓度2ml。最终加上上述巨。最终加上上述巨噬细胞悬液噬细胞悬液35ml（约含（约含21075107细胞）。细胞）。24中，水平离心中，水平离心1000g30分钟，垂直取出离心管，小心分钟，垂直取出离心管，小心吸出各交界面细胞。分别用预冷含吸出各交界面细胞。分别用预冷含1小牛血清小牛血清RPMI-1640培培养液洗涤各交界面细胞养液洗涤各交界面细胞2次，每次次，每次200g10分钟。用含分钟。用含10小小牛血清牛血清RPMI-1640培养液将细胞配成所需浓度。培养液将细胞配成所需浓度。用不连续密度梯度离心纯化巨噬细胞用不连续密度梯度离心纯化巨噬细胞 正常和肿瘤组织细胞的培养第33页巨噬细胞接种和培养巨噬细胞接种和培养（一）主要材料：（一）主要材料：培养液：培养液：RPMI1640等等+1040%FCS+抗生素抗生素（二）试验步骤：（二）试验步骤：a.冷分离冷分离b.调整细胞浓度：调整细胞浓度：24106/mlc.接种培养接种培养正常和肿瘤组织细胞的培养第34页（三）培养结果：（三）培养结果：大大小：小：2050 m形形态：态：菱形、星形、圆形菱形、星形、圆形功功能：能：吞噬功效吞噬功效增殖情况：增殖情况：不增殖、存活不增殖、存活13周周正常和肿瘤组织细胞的培养第35页（四）巨噬细胞判定（四）巨噬细胞判定1.吞噬试验：吞噬试验：加入加入0.001M(finalcon.)SiO2吞噬泡吞噬泡2.抗胰蛋白酶消化能力试验：抗胰蛋白酶消化能力试验：0.25%胰蛋白酶消化胰蛋白酶消化20min、再用吸管重复吹打、再用吸管重复吹打细胞变园但不脱落细胞变园但不脱落3.细胞化学试验：细胞化学试验：ACP酶染色：棕黑色酶染色：棕黑色NSE酶染色：紫蓝色酶染色：紫蓝色正常和肿瘤组织细胞的培养第36页淋巴细胞培养淋巴细胞培养正常和肿瘤组织细胞的培养第37页各类淋巴细胞主要特征各类淋巴细胞主要特征各类淋巴细胞主要特征各类淋巴细胞主要特征表面标志：表面标志：1.表面受体：TCRSRBCRFcRMRMeaslesviruseRT淋巴细胞：淋巴细胞：正常和肿瘤组织细胞的培养第38页MHCCD2.表面抗原正常和肿瘤组织细胞的培养第39页B淋巴细胞淋巴细胞1.表面受体表面受体BCRFcRCR丝裂原受体丝裂原受体EBVR2.表面抗原表面抗原MHC抗原抗原CD抗原（抗原（CD19、20、21、23、45）正常和肿瘤组织细胞的培养第40页血淋巴细胞分离血淋巴细胞分离（一）单个核细胞分离（一）单个核细胞分离密度梯度离心法密度梯度离心法外周血各种血细胞密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液外周血各种血细胞密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作）作密度梯度离心密度梯度离心，使一定比重细胞群按对应密度梯，使一定比重细胞群按对应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。度分布，从而将各种血细胞加以分离。正常和肿瘤组织细胞的培养第41页外周血外周血红细胞红细胞粒细胞粒细胞单个核细胞单个核细胞血小板血小板淋巴细胞淋巴细胞单核细胞单核细胞1.0931.0301.0351.0751.090Ficoll：1.0770.001(PBMC)1.092PBMC:Peripheralbloodmononuclearcell正常和肿瘤组织细胞的培养第42页1.1.每毫升外周血液大约可获每毫升外周血液大约可获1101106 6单个核细胞单个核细胞 2.Ficoll2.Ficoll应适量，外周血应充分稀释应适量，外周血应充分稀释 2.2.温度直接影响到温度直接影响到FicollFicoll比重和分离效果比重和分离效果 3.3.在在FicollFicoll上加入稀释外周血时，应迟缓加，以免冲散界面上加入稀释外周血时，应迟缓加，以免冲散界面 4.4.吸收单个核细胞层时，应防止吸出过多上清液或分层液吸收单个核细胞层时，应防止吸出过多上清液或分层液而造成血小板污染而造成血小板污染正常和肿瘤组织细胞的培养第43页1500rpm,20,30minPBMC红细胞红细胞粒细胞粒细胞Ficoll稀释外周血Ficoll稀释血浆、稀释血浆、血小板血小板正常和肿瘤组织细胞的培养第44页（二）纯淋巴细胞制备（二）纯淋巴细胞制备1.玻璃黏附法玻璃黏附法2.羰基铁粉法羰基铁粉法正常和肿瘤组织细胞的培养第45页（三）三）T、B淋巴细胞分离淋巴细胞分离1.T细胞花环沉降法细胞花环沉降法2.尼龙毛柱分离法尼龙毛柱分离法正常和肿瘤组织细胞的培养第46页（四）大颗粒淋巴细胞分离（四）大颗粒淋巴细胞分离（五）（五）FACS仪分离仪分离（六）免疫磁珠法（六）免疫磁珠法正常和肿瘤组织细胞的培养第47页三、血淋巴细胞体外培养应用三、血淋巴细胞体外培养应用正常和肿瘤组织细胞的培养第48页（一）淋巴细胞转化试验（一）淋巴细胞转化试验（二）（二）B细胞产生细胞产生Ig检验检验（三）（三）T细胞介导细胞毒试验细胞介导细胞毒试验（四）（四）NK细胞毒性试验细胞毒性试验（五）（五）K细胞毒性试验细胞毒性试验 （六）（六）LAK细胞制备细胞制备 （七）（七）TIL细胞制备细胞制备正常和肿瘤组织细胞的培养第49页（八）淋巴细胞体外长久培养（八）淋巴细胞体外长久培养1.用用IL-2建立建立T淋巴细胞克隆淋巴细胞克隆2.用用EB病毒转化病毒转化B淋巴细胞淋巴细胞3.用用B细胞生长因子建立细胞生长因子建立B淋巴细胞株淋巴细胞株正常和肿瘤组织细胞的培养第50页肿瘤细胞体外培养肿瘤细胞体外培养正常和肿瘤组织细胞的培养第51页肿瘤细胞与体内正常细胞相比，不论在体内或在肿瘤细胞与体内正常细胞相比，不论在体内或在体外，在形态、生长增值、遗传性状等方面都有显著体外，在形态、生长增值、遗传性状等方面都有显著不一样。生长在体内肿瘤细胞和在体外培养肿瘤细胞，不一样。生长在体内肿瘤细胞和在体外培养肿瘤细胞，其差异较小，但也并非完全相同。培养中肿瘤细胞具其差异较小，但也并非完全相同。培养中肿瘤细胞具以下突出特点：以下突出特点：肿瘤细胞在体外生长生物学特征肿瘤细胞在体外生长生物学特征形态和性状形态和性状培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态，大多数培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态，大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清楚，核膜、核仁轮肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清楚，核膜、核仁轮廓显著，核糖体颗粒丰富。电镜观察癌细胞表面微绒廓显著，核糖体颗粒丰富。电镜观察癌细胞表面微绒毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则，可能与肿毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则，可能与肿瘤细胞含有不定向运动和锚着不依赖性相关。瘤细胞含有不定向运动和锚着不依赖性相关。正常和肿瘤组织细胞的培养第52页生长增殖生长增殖肿瘤细胞在体内含有不受控增殖性，在体外培养中仍如此。正常二倍体细胞在体外培养中不加血清不能增殖，是因血清中含有很细胞增殖生长因子，而癌细胞在低血清中（25）仍能生长。已证实肿瘤细胞有自泌或内泌性产生促增殖因子能力。正常细胞发生转化后，出现能在低血清培养基中生长现象，已成为检测细胞恶变一个指标。癌细胞或培养中发生恶性转化后单个细胞培养时，形成集落（克隆）集落（克隆）能力比正常细胞强。另外癌细胞增殖数量增多扩展时，接触抑制消除，细胞能相互重合向三维空间发展，形成堆积物。正常和肿瘤组织细胞的培养第53页永生性也称不死性。在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡（Apoptosis）。体外培养中肿瘤细胞系或细胞株都表现有这种性状，体内肿瘤细胞是否如此尚无直接证实。多数肿瘤细胞初代培养时并不那么轻易。生长增殖并不旺盛；经过纯化成单一化瘤细胞后，也大多增殖若干代后，便出现类似二倍体细胞培养中停滞期。过此阶段后才取得永生性，顺利传代生长下去。说明体外肿瘤细胞永生性有可能是体外培养后取得。从一些含有永生性而无恶性性细胞系，如NIH3T3、Rat1、10T1/2等细胞证实，永生性和恶性（包含浸润性）是两种性状，受不一样基因调控，但却有相关性。可能永生性是细胞恶变阶段。最少在体外是如此。肿瘤细胞永生性肿瘤细胞永生性正常和肿瘤组织细胞的培养第54页（四）浸润性（四）浸润性浸润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为，培养癌细胞仍持有这种浸润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为，培养癌细胞仍持有这种性状。在与正常组织混合培养时，能浸润入其它组织细胞中，并性状。在与正常组织混合培养时，能浸润入其它组织细胞中，并有穿透人工隔膜生长能力。有穿透人工隔膜生长能力。（五）异质性（五）异质性全部肿瘤都是由有增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性全部肿瘤都是由有增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不一样细胞组成。异质性组成同一肿瘤内细胞活力有差异瘤组状不一样细胞组成。异质性组成同一肿瘤内细胞活力有差异瘤组织；处于瘤体周围区细胞取得血液供给多，增殖旺盛，中心区有织；处于瘤体周围区细胞取得血液供给多，增殖旺盛，中心区有细胞衰老退化，有处于周期阻滞状态，那些呈活跃增殖状态细胞细胞衰老退化，有处于周期阻滞状态，那些呈活跃增殖状态细胞称干细胞（称干细胞（StemCells）、只有这些干细胞才是支持肿瘤生长成）、只有这些干细胞才是支持肿瘤生长成份。肿瘤干细胞培养时易于生长增殖；把干细胞分离出来培养方份。肿瘤干细胞培养时易于生长增殖；把干细胞分离出来培养方法称干细胞培养。法称干细胞培养。正常和肿瘤组织细胞的培养第55页（六）细胞遗传（六）细胞遗传大多数肿瘤细胞有遗传学改变，如失去二倍体核型、呈异大多数肿瘤细胞有遗传学改变，如失去二倍体核型、呈异倍体或多倍体等。肿瘤细胞群常由多个细胞群组成，有干细胞倍体或多倍体等。肿瘤细胞群常由多个细胞群组成，有干细胞系和数个亚系，并不停进行着适应性演变。系和数个亚系，并不停进行着适应性演变。正常和肿瘤组织细胞的培养第56页（七）其它（七）其它肿瘤细胞在体外不易生长原因可能因为：肿瘤细胞在体外不易生长原因可能因为：依赖性：肿瘤细胞虽有较强克隆生长力，但仍有一定群体性或依赖性：肿瘤细胞虽有较强克隆生长力，但仍有一定群体性或与其它细胞相依存关系。一是肿瘤细胞与肿瘤细胞相互依存，二与其它细胞相依存关系。一是肿瘤细胞与肿瘤细胞相互依存，二是肿瘤细胞与基质成纤维细胞依赖。体外分散培养和排除成纤维是肿瘤细胞与基质成纤维细胞依赖。体外分散培养和排除成纤维细胞后也会同时消除或减弱这些依存关系，可能影响癌细胞增殖细胞后也会同时消除或减弱这些依存关系，可能影响癌细胞增殖生长活性；生长活性；肿瘤细胞自泌也会因分散培养而被稀释，达不到肿瘤生长需求，肿瘤细胞自泌也会因分散培养而被稀释，达不到肿瘤生长需求，降低肿瘤细胞生长增殖力；降低肿瘤细胞生长增殖力；并非全部肿瘤细胞都有强生长活力和长并非全部肿瘤细胞都有强生长活力和长LifeSpan，只有干细，只有干细胞才有强增殖生长能力，但这些细胞数量极少；胞才有强增殖生长能力，但这些细胞数量极少；离体培养肿瘤细胞可能需求与体内相同特殊生存条件。离体培养肿瘤细胞可能需求与体内相同特殊生存条件。正常和肿瘤组织细胞的培养第57页海拉细胞海拉细胞（英语：HelaCells，有时音译为海乐细胞海乐细胞，亦称试验用试验用增殖表皮癌细胞增殖表皮癌细胞）是生物学与医学研究中使用一个细胞，源自一位美国妇女海莉耶塔拉克斯（HenriettaLacks）子宫颈癌细胞细胞系1。这名美国妇女在1951年死于该癌症。为了让拉克斯保持匿名，此细胞株原宣称是依“HelenLane”命名。HeLa细胞系被视为“不死”（即不一样于其它普通人类细胞，此细胞株不会衰老致死，并能够无限分裂下去），至今都被不间断培养。此细胞系跟其它癌细胞相比，增殖异常快速2。海拉细胞系被GeorgeGey分送给众研究单位（并未通知拉克斯本人也未得到她许可），并用作癌症模式细胞（modelcancercells）研究。HeLa细胞系也被用作研究细胞信号传导（cellularsignaltransduction）。维基百科，自由百科全书维基百科，自由百科全书http:/zh.wikipedia.org/wiki/%E6%B5%B7%E6%8B%89%E7%BB%86%E8%83%9E正常和肿瘤组织细胞的培养第58页HeLa细胞源自一个宫颈癌（细胞源自一个宫颈癌（cervicaltumour）活检组织活检组织块，这块肿瘤组织就是在块，这块肿瘤组织就是在1951年时从年时从HenriettaLacks体内取出，体内取出，当初当初Lacks这位非洲裔美国劳动妇女就住在美国巴尔摩。不过这位非洲裔美国劳动妇女就住在美国巴尔摩。不过当初可没人告诉当初可没人告诉Lacks要从她体内取出这些肿瘤细胞，当然也要从她体内取出这些肿瘤细胞，当然也就无所谓取得她允许了。就无所谓取得她允许了。这些细胞也是头一个能够在试验室里这些细胞也是头一个能够在试验室里体外培养环境下良好生长人类细胞。体外培养环境下良好生长人类细胞。HeLa细胞对我们人类贡细胞对我们人类贡献可谓数不胜数，因为有了这些献可谓数不胜数，因为有了这些HeLa细胞，才推进了脊细胞，才推进了脊髓灰髓灰质炎疫苗（质炎疫苗（poliovaccine）开发工作进展，才让科学家们发觉）开发工作进展，才让科学家们发觉了了端粒酶（端粒酶（telomerase），），以及其它多项重大科研进展。在以及其它多项重大科研进展。在PubMed数据库里以数据库里以“HeLa细胞细胞”为关键词进行搜索能够得到为关键词进行搜索能够得到7.5万多篇论文。就连万多篇论文。就连Collins在接收在接收自然自然杂志采访时都说：杂志采访时都说：“我们试验室里现在还养着我们试验室里现在还养着HeLa细胞，我们需要用这些细胞细胞，我们需要用这些细胞开展各种基因表示试验，几乎在每一个分子生物学试验室里都开展各种基因表示试验，几乎在每一个分子生物学试验室里都少不了少不了HeLa细胞。细胞。”正常和肿瘤组织细胞的培养第59页肿瘤细胞培养方法肿瘤细胞培养方法肿瘤细胞培养成功关键在于：肿瘤细胞培养成功关键在于：取材取材、成纤维细胞排成纤维细胞排除除、选取、选取适宜培养液适宜培养液和和培养底物培养底物等几个方面。在详细培等几个方面。在详细培养方法方面，肿瘤细胞培养与正常组织细胞培养并无标养方法方面，肿瘤细胞培养与正常组织细胞培养并无标准差异，初代培养应用组织块和消化培养法均可。准差异，初代培养应用组织块和消化培养法均可。正常和肿瘤组织细胞的培养第60页RPMI1640+1020%FCS+0.03%谷氨酰胺：谷氨酰胺：上皮性癌细胞或悬浮性肿瘤细胞上皮性癌细胞或悬浮性肿瘤细胞DMEM、199、MEM：肉瘤细胞培养肉瘤细胞培养F12、L-15:上皮性癌细胞培养（如肝癌细胞）上皮性癌细胞培养（如肝癌细胞）加加:2g/LNaHCO320mmol/LHEPES肿瘤细胞培养方法：肿瘤细胞培养方法：肿瘤细胞体外培养惯用培肿瘤细胞体外培养惯用培养基养基（一）培养液种类和选择（一）培养液种类和选择正常和肿瘤组织细胞的培养第61页（二）培养液特殊添加剂二）培养液特殊添加剂惯用促细胞生长因子及使用终浓度惯用促细胞生长因子及使用终浓度添加剂添加剂终浓度终浓度BSA10-5mol/mlTRF510ug/mlInsulin5ug/ml氢化可松氢化可松10-6mol/mlEGF5ng/mlFGF5ng/mlNGF5ng/ml正常和肿瘤组织细胞的培养第62页肿瘤组织细胞原代培养肿瘤组织细胞原代培养取材：取材：人肿瘤细胞来自外科手术、活检瘤组织、胸腹水穿刺、细人肿瘤细胞来自外科手术、活检瘤组织、胸腹水穿刺、细针头穿刺、内窥镜活检等。针头穿刺、内窥镜活检等。取材部位非常主要，体积较大肿瘤组织中有退变或坏死取材部位非常主要，体积较大肿瘤组织中有退变或坏死区，取材时尽可能防止用退变组织，要挑选活力很好部位。癌区，取材时尽可能防止用退变组织，要挑选活力很好部位。癌性转移淋巴结或胸腹水是好培养材料。性转移淋巴结或胸腹水是好培养材料。关键：新鲜、无菌、及时、准确关键：新鲜、无菌、及时、准确正常和肿瘤组织细胞的培养第63页技术技术-分离纯化分离纯化分离：分离：剪碎、酶消化、剪碎、酶消化、Ficoll、Percoll等等密度沉降分离密度沉降分离纯化：纯化：重复贴壁去除成纤维细胞重复贴壁去除成纤维细胞自然淘汰去除正常细胞自然淘汰去除正常细胞利用特异抗原标志筛选法利用特异抗原标志筛选法(panning)分亚型分亚型流式细胞仪分选流式细胞仪分选克隆建株克隆建株高转移株建立：重复接种高转移株建立：重复接种正常和肿瘤组织细胞的培养第64页技术技术-培养培养l原代培养：原代培养：去除纤维细胞及淋巴细胞，去除纤维细胞及淋巴细胞，预防细菌、真菌污染。预防细菌、真菌污染。l传代培养：传代培养：增殖力低细胞需要喂养增殖力低细胞需要喂养细胞适当密度细胞适当密度,基本长满后基本长满后传代传代,前前10代不稳定，注意代不稳定，注意培养条件，适当调整培养基。培养条件，适当调整培养基。正常和肿瘤组织细胞的培养第65页技术技术-判定与建株判定与建株l判定：判定：组织起源组织起源、形态特征、核型染色体分析、生、形态特征、核型染色体分析、生长特征、对细胞因子反应（长特征、对细胞因子反应（TNF)、集落形成、致瘤、集落形成、致瘤试验（裸小鼠）试验（裸小鼠）l建株：建株：生长六个月以上，病理诊疗、光镜及电镜观生长六个月以上，病理诊疗、光镜及电镜观察、生长特征、染色体分析、肿瘤标志、致瘤及转察、生长特征、染色体分析、肿瘤标志、致瘤及转移情况移情况l注意：注意：不是每一肿瘤组织都能建株不是每一肿瘤组织都能建株正常和肿瘤组织细胞的培养第66页肿瘤瘤细胞胞对培养基要求不如正常培养基要求不如正常细胞胞严格，普通格，普通惯用用 RPMIl640RPMIl640、DMEMDMEM、Mc-Coy5AMc-Coy5A等培养基等皆可用于等培养基等皆可用于肿瘤瘤细胞胞培养。培养。肿瘤瘤细胞胞对血清需求比正常血清需求比正常细胞低，正常胞低，正常细胞培养胞培养不加血清不能生不加血清不能生长，肿瘤瘤细胞在低血清培养基中也能生胞在低血清培养基中也能生长。肿瘤瘤细胞胞对培养培养环境适境适应性性较大，是因大，是因肿瘤瘤细胞有自泌胞有自泌（AutocrineAutocrine）性）性产生促生生促生长物物质之故。但之故。但这并不并不说明明肿瘤瘤细胞完全不需要胞完全不需要这些成份。按不一些成份。按不一样细胞需要不一胞需要不一样生生长因子；因子；肿瘤瘤细胞与正常胞与正常细胞之胞之间、肿瘤瘤细胞与胞与肿瘤瘤细胞之胞之间对生生长因子需求都存在着差异。但大多数因子需求都存在着差异。但大多数肿瘤瘤细胞培养胞培养中仍需要生中仍需要生长因子。有因子。有还需特异性生需特异性生长因子因子 如乳腺癌如乳腺癌细胞胞等）。等）。总之培养之培养肿瘤瘤细胞仍需加血清和相关生胞仍需加血清和相关生长因子培养因子培养更易成功。更易成功。正常和肿瘤组织细胞的培养第67页成成纤维细胞排除：胞排除：成成纤维细胞常与胞常与肿瘤瘤细胞同胞同时混混杂生生长，致，致难以以纯化化肿瘤瘤细胞。胞。而且成而且成纤维细胞常比胞常比肿瘤瘤细胞生胞生长得快，最得快，最终能能压制制肿瘤瘤细胞胞生生长。所以排除成。所以排除成纤维细胞成胞成为肿瘤瘤细胞培养中关胞培养中关键。正常和肿瘤组织细胞的培养第68页去除成纤维细胞方法去除成纤维细胞方法正常和肿瘤组织细胞的培养第69页是用不锈钢丝末端插有橡胶刮头（用胶塞剪成三角形插以不 锈钢丝）、或裹少许脱脂棉制成，装入试管中高压灭菌后备用（也可用特制电热烧灼器刮除）。刮除程序为：（1）标识：镜下观察，用不脱色笔在培养瓶皿后面圈下生长肿瘤细胞部位；（2）刮除：弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜窥视下，刮除无标识空间；（3）用 Hanks液冲洗一两次，洗除被刮掉细胞；（4）注入培养液继续培养，如发觉仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全除掉为止。1 1、机械刮除法：、机械刮除法：正常和肿瘤组织细胞的培养第70页2、重复、重复贴壁法：壁法：依据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢特点，并结合使用不加血清营养液，把含有两类细胞细胞悬液重复贴壁，使两类细胞相互分离，操作方法与传代相同。（1）待细胞生长达一定数量后，倒出旧培养液，用胰酶消化后，Hanks 冲洗 2次，加入不含血清培养液，吹打制成细胞悬液；（2）取编号为此 A、B、C三个培养瓶；首先把悬液接种入 A培养瓶中。置温箱中静止培养 520分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养液，再接种入 B培养瓶中后；向 A瓶中补充少许完全培养液置温箱中继续培养；（3）培养B瓶中细胞 520分钟后，接处理 A方法，把培养液注入 C培养瓶中；再向 B瓶中补加完全培养基。正常和肿瘤组织细胞的培养第71页当三个瓶内都含有培养液后，均在温箱中继续培养。如操作成当三个瓶内都含有培养液后，均在温箱中继续培养。如操作成功，次日观察可见功，次日观察可见A瓶主要为成纤维细胞，瓶主要为成纤维细胞，B瓶两类细胞相杂，