HSP90通过PTK2B影响Aβ_%281-42%29诱导的痴呆小鼠学习记忆功能.pdf

Chinese Journal of Neuroanatomy志杂解经部神2023,39(3):333340HSP90通过 PTK2B影响A142诱导的痴呆小鼠学习记忆功能刘思钰，郝凯敏，王冰怡，王浩玉，祁文秀*（山西医科大学汾阳学院，汾阳0 32 2 0 0）摘要目的：探讨热休克蛋白9 0(HSP90）和蛋白酪氨酸激酶2（PT K 2 B）与A1.42诱导痴呆模型小鼠学习记忆功能的关系。方法：32 只C57BL/6J小鼠分为对照组（NS）、痴呆模型组（A142+NS）、H SP9 0 抑制剂Lumi-nespib处理组（A142+Lum)以及PTK2B抑制剂PF431396处理组（Ai.42+PF）。实验组侧脑室注射A142构建痴呆模型后分别注射HSP90抑制剂或PTK2B抑制剂进行处理。采用水迷宫对小鼠学习记忆功能进行检测，WesternBlot检测海马HSP90、PT K 2 B的表达情况以及tau蛋白磷酸化水平（p-tau），免疫组织化学染色检测海马HSP90和PTK2B的表达，realtimeRT-PCR检测PTK2BmRNA表达。结果：在A142诱导的痴呆模型小鼠海马中,PTK2B及p-tau水平均升高,HSP90水平降低（P0.01）。而应用HSP90抑制剂则更进一步导致小鼠海马PTK2B、PT K 2 Bm RNA 及p-tau的水平升高（P0.05），并使小鼠学习记忆功能减退；抑制PTK2B后小鼠海马中tau磷酸化水平降低（P0.05）。结论：A142诱导的痴呆模型小鼠海马组织中HSP90降低,PTK2B升高。抑制HSP90可能通过促使PTK2B表达和tau蛋白磷酸化水平上升使小鼠学习记忆功能减退关键词阿尔茨海默病；淀粉样蛋白；tau蛋白；热休克蛋白9 0；蛋白酪氨酸激酶2；小鼠D0I:10.16557/ki.1000-7547.2023.03.013HSP90 affects the learning and memory function ofAi-42 induced dementia mice through PTK2BLIU Siyu,HAO Kaimin,WANG Bingyi,WANG Haoyu,QI Wenxiu*(Fenyang College of Shanxi Medical University,Fenyang 032200,China)Abstract Objective:To investigate the relationship between heat shock protein 90(HSP90)and protein tyrosinekinase 2(PTK2B),and learning and memory function of A142 induced dementia mice.Methods:Thirty-twoC57BL/6J mice were divided into control group(NS),dementia model group(Ai-42+NS),HSP90 inhibitor Lumi-nespib treatment group(A142+Lum)and PTK2B inhibitor PF431396 treatment group(A142+PF).The experimen-tal group was injected with A142 in the lateral ventricle to establish dementia model,and treated with HSP90 inhibitoror PTK2B inhibitor respectively.The learning and memory ability of mice was tested by water maze.Western Blot wasused to detect the expression of HSP90,PTK2B,and tau phosphorylation levels(p-tau)in hippocampus,and immuno-histochemistry was used to detect the expression of HSP90 and PTK2B in hippocampus.The expression of PTK2B mR-NA was detected by RT-PCR.Results:In the hippocampus of A1-42 induced dementia mice,PTK2B and p-tau levelswere increased,while HSP90 levels were decreased(P0.01).The application of HSP90 inhibitor further increasedthe levels of PTK2B mRNA,PTK2B mRNA,and p-tau in hippocampus of mice(P0.05),and decreased the learn-ing and memory ability of mice.After application of PTK2B inhibition,tau phosphorylation level in hippocampus of基金项目：山西省自然科学基金（2 0 18 0 1D121348）；山西医科大学汾阳学院科学研究项目（2 0 2 0 B02）*通信作者：祁文秀电话：[phone],E-mail：f y c q w x 16 3.c o m3342023年5月第39 卷第3期神经解学杂志，mice was decreased(P 0.05).Conclusion:The expression of HSP90 decreased and PTK2B increased in hipp-ocampal tissue of Ai42 induced dementia mice.Inhibition of HSP90 may decrease the learning and memory ability ofmice by promoting PTK2B expression and tau phosphorylation level.Key wordsAlzheimers disease(AD);amyloid-beta(A);tau;heat shock protein 90(HSP90);protein tyro-sine kinase 2 beta(PTK2B);mouse阿尔茨海默病（Alzheimerdisease，A D）以记忆丧失和认知障碍为临床表现。AD脑组织中主要病理性标志物-淀粉样蛋白（amyloid-beta，A）和tau蛋白异常磷酸化聚集促使慢性炎症、氧化应激以及突触丢失的发生，二者共同作用导致了神经系统功能障碍及认知行为学能力下降1。热休克蛋白（heatshock protein,HSP)在促进错误折叠蛋白降解及维持细胞内蛋白稳定方面有重要作用2 。HSP90（h e a tshockprotein90,HSP90）作为遗传上高度保守的分子伴侣之一，可以帮助A寡聚体（Aoligomers，AOs)通过蛋白酶体系统降解3 并直接与tau结合，减少tau的磷酸化和聚集4AD易感基因之一ptk2b基因及其表达产物蛋白酪氨酸激酶2（p r o t e i n t y r o s i n e k i n a s e 2 b e t a，PTK2B)在APP/PS1小鼠脑中上调5.6 并导致APP/PS1小鼠突触密度丢失以及记忆障碍7 ,且通过调节A的产生促使了淀粉样斑块形成8 。前期研究发现,A142诱导的认知障碍模型大鼠脑中PTK2BmRNA及蛋白上调的同时，AOs以及tau蛋白磷酸化(phosphorylation of tau,p-tau）水平有所增加，同时组蛋白乙酰化参与对ptk2b或HSP90的乙酰化修饰，进而影响认知障碍模型动物学习记忆功能或神经元细胞发育9.10 。但 HSP90 与 pth2b 基因在AD病理学以及学习记忆功能之间的关系如何，目前还未见明确报道。本研究通过对A142诱导的痴呆模型小鼠侧脑室注射HSP90抑制剂或PTK2B抑制剂，分析HSP90是否通过PTK2B影响痴呆模型小鼠脑中p-tau水平及其学习记忆功能。材料与方法1.材料1.1实验动物32只雄性C57BL/6J小鼠购于山西医科大学动物实验中心，合格证号：SYXK（晋）2019-0007，分笼饲养于SPF清洁级动物房。温度（2 42)、湿度（50 10）%，每12 h明暗交替一次。动物自由摄食摄水。1.2试剂和仪器A142（a b 12 0 30 1）、兔抗大鼠HSP90多克隆抗体（ab203126）购于英国Abcam公司，Luminespib（H Y-10 2 15）购于美国MCE公司，PF431396（42 7 8）购于英国TocrisBioscience公司，兔抗大鼠PTK2B多克隆抗体（ab-402）购于美国Sigma公司，兔抗大鼠磷酸化tau蛋白单克隆抗体（150 13S）、兔抗大鼠tau单克隆抗体（46 6 8 7 S）购于美国CST公司，辣根过氧化物酶（horseradish peroxi-dase,HRP）标记的山羊抗兔IgG二抗（BA1050）、免疫组化试剂盒（SA1022）购于武汉博士德公司，水迷宫软件购于西班牙Panlab公司，显微镜购于德国Leica公司，化学发光成像系统、荧光定量PCR仪购于美国Bio-Rad公司。2.方法2.1A142寡聚体制备根据课题组以往配制方法9 ,A142溶人六氟异丙醇中,室温下振荡溶解，氮气吹干后加人45l杜氏磷酸盐缓冲液和5l二甲基亚砜,37 孵育36 h，-2 0 保存。2.2动物处理与分组根据完全随机数字法将32只雄性C57BL/6J小鼠分为对照组（NS）、痴呆模型组（A142+NS）、H SP9 0 抑制剂Luminespib处理组（A 142+Lum）以及PTK2B抑制剂PF431396处理组（A142+PF），每组各8 只。各组小鼠均行侧脑室插管术，术后3d，各实验组小鼠侧脑室（intracere-broventricular,i.c.v.)注射 A142(2 g/ml,2.5 l)建立痴呆模型，对照组注射等量生理盐水（normalsaline,NS）。3d 后,实验组小鼠i.c.v.注射HSP90抑制剂Luminespib（A 142+Lum 组,5g/ml）、PTK2B抑制剂PF431396（A 142+PF组,15g/ml)或NS（A 1.42+NS组），各2 l;对照组动物注射等量NS(NS组)。2.3Morris水迷宫选取Morris水迷宫对小鼠进行学习记忆功能检测。逃生平台置于第一象限，水迷宫注水没过逃生平台1cm，水温（2 0 2）。遵循以往实验方法9 ,1 5d为定位航行试验,第6 d为空间探索试验。实验前1d上、下午各游泳12 0 s335刘思钰：HSP90通过PTK2B影响A142诱导的痴呆小鼠学习记忆功能进行适应性训练。定位航行实验：用于判定小鼠空间学习能力。将水迷宫分4个象限，小鼠于4个象限中点入水。将逃避潜伏期记为小鼠在6 0 s内登上逃生平台的时间。如果小鼠6 0 s内未登上平台，则辅助小鼠登上平台并停留10 s，逃避潜伏期记录为60s。空间探索实验：用于判定小鼠空间记忆能力。将逃生平台撤去，小鼠按原入水点放人4个象限，观察小鼠在6 0 s内穿过平台原本位置的次数以及在该象限的驻足时间并记录。2.4Western Blot各组取5只小鼠，腹腔注射1%戊巴比妥钠（35mg/kg）麻醉后固定于手术台上，打开胸腔，暴露心脏，右心耳剪小口，注射器抽取生理盐水行心脏灌流，冰上取右侧脑分离海马，海马称重后以10 0:1:1的比例加人RIPA裂解液、PMSF和广谱磷酸酶抑制剂，经超声破碎后于4、138 0 0 r/min、离心15min,取上清。BCA试剂盒测定浓度后进行电泳、转膜、封闭并根据蛋白分子量裁剪条带，置于兔抗HSP90（1:10 0 0 0）、兔抗PTK2B（1:50 0 0）、兔抗p-tau(1:5000）、兔抗tau（1:10 0 0）或兔抗-ac-tin（1:10 0 0 0）中4过夜。次日，条带置于HRP标记的山羊抗兔二抗（1:6 0 0 0）中室温孵育2 h，T BST漂洗后滴加ECL发光液曝光显影。2.5免疫组织化学染色各组取5只小鼠左侧脑置于含4%多聚甲醛的磷酸缓冲液中固定2 4h后脱水机脱水，进行连续冠状切片。55烘干1h，二甲苯及梯度乙醇脱蜡脱水。蒸馏水洗涤,3%的H,02-甲醇孵育30 min后进行抗原热修复。5%BSA封闭30min，滴加兔抗PTK2B（1：10 0）或兔抗HSP90（1:10 0 0），4过夜。次日加入生物素标记的山羊抗兔二抗（1:2 0 0 0）孵育30 min;SABC孵育30 min；PBS洗涤后DAB显色，中性树胶封片，通过显微镜观察并记录结果。2.6RNA提取和real time RT-PCR每组取3只小鼠海马使用Trizol法提取总RNA，酶标仪测定总RNA的纯度及浓度，参照荧光定量试剂盒SYRBGreen法说明书,进行去除基因组DNA反应、反转录以及实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitativepol-ymerase chain reaction,qPCR）检测。PTK2B 的上游引物为：5-CACAGTGCAGACAGAGATCCA-3，下游引物为:5-CCCTATTCGCCCACTCAG-3；内参GAP-DH的上游引物为：5-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3，下游引物为：5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3。循环条件：9 4预变性5min、9 4变性30 s、6 0 退火延伸6 0 s，共40 个循环。根据2-AC计算各组目的基因相对表达量。2.7丝统计学分析通过SPSS26.0软件进行数据分析。结果以均值标准差(xs)表示。水迷宫中逃避潜伏期使用重复测量方差分析（Repeatedmeas-urementANOVA）；组间数据通过单因素方差分析(one-wayANOVA）和LSD-t检验进行分析,P0.05时视为有统计学差异。结果.抑制HSP90可导致痴呆小鼠学习记忆功能减退水迷宫定位航行实验结果表明（Fig.1A），实验组A142+NS组较对照组NS组,小鼠平均潜伏期在第3d开始延长。实验组比较后发现，相较于A142+NS组，应用HSP90抑制剂的A142+Lum组小鼠平均潜伏期明显延长（P0.01），而应用PTK2B抑制剂的A142+PF组小鼠平均潜伏期则缩短（P0.01)。空间探索实验结果显示（Fig.1B-D），A 142+NS组较NS组，小鼠穿过逃生平台原本位置的次数及在原象限的驻足时间均减少（均P0.01）。而实验组进行组间比较后发现，与A142+NS 组相比，A142+PF组小鼠穿过逃生平台原本位置的次数及在原象限的驻足时间均增加（均P0.01），而A142+Lum组两个指标则减少（均P0.05）。由结果可知,抑制PTK2B后可明显提高痴呆模型小鼠的学习记忆功能，而抑制HSP90则相反。3362023年5月第39 卷第3期神经解剖学杂志，60元NSaA1-42+NS50王A1-42+Lum40aA1-42+PF30a2010FA012345Time(d)40F30420210F0dd+tigy0SN+tIgVSN+trIgVdd+trlgvBSCApPi-42+LumAP1-42+LumDNSA1-42+NSAi-42+LumA1-42+PFFig.1 The results of learning and memory ability detection in four groups of mice.A:The escape latency of dayl-day5.B:The aver-age number of crossing platform.C:The average rest time in the platform quadrant.D:Swimming trajectory.P0.01 vs NSgroup,bP0.05 us A142+NS group,P0.01 us A142+NS group.2.抑制HSP90促使痴呆小鼠海马中PTK2B的表达及tau磷酸化水平升高WestermBlot结果表明（Fig.2）,A 142+NS模型组较NS组，小鼠海马中PTK2B及p-tau表达有所增加(均P0.01）,而HSP90表达下降（P0.01)。实验组之间进行比较后发现，与A1.42+NS组相较，抑制HSP90后（A142+Lum组）PTK2B及p-tau的表达水平增加（均P0.05)；而抑制PTK2B（A 142+PF组）后p-tau表达降低（P0.05）。以上结果表明,抑制HSP90的同时PTK2B及p-tau的表达有所增加，而抑制PTK2B虽减少了痴呆模型小鼠海马中p-tau的表达，但不影响HSP90蛋白的表达。337刘思钰：HSP90通过PTK2B影响A小鼠学习记忆功能秀宇的保SN+t-1dVunT+ztr1idvdd+rigvPTK2B116kDaHSP9090kDa-actin42kDaA1.51.20.9一1.0公d0.6F0.50.3SN+trIdV0.0SN+trigvwnT+trlgy0.0BCNS2.5FunT+r-igvb2.0Fogui ner/nef-d1.5p-tau55kDa1.0F0.5tau50kDaSN+trldV0.0dd+trigvDENSFig.2 Expression levels of PTK2B,HSP90 and p-tau in hippocampus of mice.A:Western Blot.B-C:Protein expression of PTK2Band HSP90.D:Westem Blot.E:Protein expresion of p-tau.*P0.01 us NS group,bP0.05 us A142+NS group,P0.05 us A142+NS group.3.抑制HSP90促使痴呆小鼠海马中PTK2B免疫阳性反应物的表达据小鼠海马PTK2B和HSP90的免疫阳性反应物（PTK2B-LI和HSP90-LI）表达的显微照相（Fig.3A)和平均IOD值（Fig.3B)可见，A142+NS较NS组,PTK2B-LI表达增加（P0.01），而HSP90-LI表达明显降低（P0.01）。相较于A142+NS组，A142+Lum组小鼠海马中PTK2B-LI水平增加（P0.05）4.抑制HSP90促使痴呆小鼠海马中PTK2BmRNA的表达RT-PCR结果表明（Fig.4），A 142+NS较NS组,小鼠海马中PTK2B mRNA表达明显增加（P0.01）。实验组比较后发现，相较于A142+NS组，抑制HSP90（A 1.42+Lum组）后小鼠海马组织中PTK2BmRNA表达升高(P0.05)。3382023年5月第39 卷第3期神经解剖学杂志，NSA1-42+NSA1-42+LumA1-42+PF06dSHA0.25r0.4rb0.20F0.3a0.150.2一0.100.10.05B0.000.0dd+trigvAPi-42-+LumAPi-42+LumFig.3 Results of immunohistochemistry staining of PTK2B and HSP90 in hippocampus of mice.A:Immunohistochemistry staining forPTK2B and HSP90.B:The average IODs of PTK2B-LI and HSP90-LI in hippocampus CA3 area.Scale bar,250 m.aP0.01 us NS group,bp0.05 us A142+NS group.86a42SN+triVAPi-42+LumFig.4 The PTK2B mRNA expression in hippocampus of mice.P0.01 us NS group,bp0.05 us A142+NS group.讨论研究表明，在应激状态下HSP90能够防止蛋白质变性,且热休克蛋白的功能和水平随神经退化而下降12 。本研究结果显示,A142诱导的痴呆模型小鼠海马组织中,HSP90蛋白和免疫阳性反应物的表达均降低，而tau磷酸化水平升高。应用HSP90抑制剂后tau蛋白磷酸化水平明显升高且小鼠学习记忆能力减退。tau蛋白是一种微管相关蛋白并在刺激微管聚合以及稳定微管运输方面有重要作用13,而tau的过度磷酸化或其它病理性标志物的增加可使神经元发生凋亡、核离散等神经退行性病理变化14，进而影响突触数量和突触传递信息功能,导致AD病人的认知行为学能力下降。有研究表明,HSP90可以维持tau的稳态并阻止tau纤维339刘思钰：HSP90通过PTK2B影响A1小鼠学习记忆功能异常缠结和磷酸化15。因此,抑制HSP90可能促使tau过度磷酸化导致AD脑组织的病理性变化,进而促使其学习记忆能力减退16 。AD的易感基因ptk2b的表达产物PTK2B蛋白也称为 Pyk2（p r o l i n e-r i c h p r o t e i n t y r o s i n e k i n a s e 2,Pyk2）,属于非受体酪氨酸蛋白激酶家族,在AD的发生中有一定的作用8 。研究发现,APP/PS1 小鼠行为学功能随年龄增加呈进行性下降趋势且海马中PTK2BmRNA及PTK2B蛋白与A寡聚体和p-tau均呈现递增趋势17 。同时,PTK2B可能通过与tau蛋白相互作用，促使tau蛋白磷酸化18 。这些均与本研究在痴呆模型小鼠海马中所观察到的PTK2B和PTK2BmRNA以及p-tau表达升高相一致。文献表明,HSP90可以通过调节非受体酪氨酸激酶影响疾病发生19.2 0 。有研究发现 HSP90 可以结合Pyk2分泌外泌体作用于肿瘤的发病和转移2 1,HSP也可以通过抑制一些信号分子如Pyk2、AKT的磷酸化来调节T细胞介导的炎症反应2 。那么HSP90是否可以通过影响PTK2B而参与到AD的发生发展中呢？本研究结果显示，应用HSP90抑制剂后PTK2B蛋白及PTK2BmRNA表达有所增加，同时AD病理性标志物p-tau表达升高且小鼠学习记忆能力明显减退。而抑制PTK2B后p-tau表达水平降低，但HSP90表达未受影响。基于以上结果推测,HSP90可能通过影响ptk2b基因或PTK2B蛋白表达影响痴呆模型小鼠脑组织中tau磷酸化水平及学习记忆能力。在正常机体内，HSP90可以陪伴客户蛋白避免有害刺激,但在衰老或病理因素的刺激下,HSP90会改变其特性并影响某些易感基因的表达2 3。有文献报道，HSP90可能通过热休克转录因子1（heatshock transcription factor 1,HSF1）影响疾病的发生2 4,而 HSF1 可以通过与 ptk2b基因有增强子效应的rs2279590位点等位基因A相结合从而影响转录调控并在衰老性疾病中发挥作用2 5。这表明HSP90可能通过转录水平修饰调控ptk2b基因进而影响AD的发生。综上所述，在A142诱导的痴呆模型小鼠海马中HSP90的表达明显降低,PTK2B蛋白和PTK2BmR-NA表达则明显增加。在抑制PTK2B后没有对HSP90的表达产生影响，但却影响了模型鼠脑组织中tau磷酸化水平及学习记忆能力。这提示，抑制HSP90可能通过影响ptk2b基因或PTK2B蛋白促使模型鼠海马组织中tau蛋白过度磷酸化及学习记忆能力的变化。但是,HSP90对ptk2b的作用是否在转录水平进行，从而影响AD的进程还未可知，仍需我们进一步探讨。参考文献1 Roda AR,Serra-Mir G,Montoliu-Gaya L,et al.Amyloid-beta pep-tide and tau protein crosstalk in alzheimers diseaseJ.Neural Re-gen Res,2022,17(8):1666-1674.D0I:10.4103/1673-5374.332127.2 de Los Reyes T,Casas-Tinto S.Neural functions of small heat shockproteinsJ.Neural Regen 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