PDGFRA调控p53信号通路介导卵巢癌细胞增殖、凋亡和侵袭的作用及机制.pdf

Role and mechanism of PDGFRA in regulating p53 signaling pathway tomediate proliferation，apoptosis and invasion ofovarian cancer cellsXIONG Tingchuan1，WANG Yinghong2，ZHU Changjun3（1.Department of Gynecologic Surgery，The 3rd Affiliated Teaching Hospital of Xinjiang Medical University（Affiliated Cancer Hospital），Urumqi 830011，China；2.Center of Heath Management，The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China；3.Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance，Tianjin Normal University，Tianjin 300387，China）Abstract：To investigate the role and specific mechanism of platelet derived growth factor receptor（PDGFRA）in regulat-ing the proliferation，apoptosis and invasion of ovarian cancer cells，differential expression of PDGFRA in ovarian cancer wasverified firstly based on the analysis of relevant gene chips（GSE4122 and GSE14407）in the GEO database.Then SangerBoxwas used to analyse the association between PDGFRA and the prognosis of ovarian cancer patients online.The PDGFRA over-expression plasmid was created，the effect of PDGFRA on OVCAR3 cell proliferation was explored using MTT，the effect ofPDGFRA on OVCAR3 cell apoptosis was detected using flow cytometry，the effect of PDGFRA on OVCAR3 cell invasion wasdetected using Transwell，and the expression levels of p-p53，p53 and p21 proteins were measured using Western blot.Theresults showed that PDGFRA expression was significantly up-regulated in ovarian cancer，and patients with high PDGFRAexpression had a worse prognosis compared to those with low PDGFRA expression.Cell proliferation and invasion were signifi-cantly higher in the PAGFRA group compared to vector-NC group，while apoptosis and p-p53 and p21 protein expression levelswere significantly lower.It is concluded that PDGFRA can influence OVCAR3 cell proliferation，apoptosis and invasion by me-diating the regulation ofthe p53 signalling pathway.PDGFRA 调控 p53 信号通路介导卵巢癌细胞增殖、凋亡和侵袭的作用及机制熊廷川1，王迎洪2，朱长军3（1.新疆医科大学第三临床医学院（附属肿瘤医院），妇外三科，乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学第一附属医院健康管理中心，乌鲁木齐 830011；3.天津师范大学 天津市动植物抗性重点实验室，天津 300387）摘要：为了探究血小板源性生长因子受体 （platelet derived growth factor receptor，PDGFRA）调控卵巢癌细胞的增殖、凋亡和侵袭的作用以及具体机制，首先基于 GEO 数据库中相关基因芯片（GSE4122 和 GSE14407）分析验证PDGFRA 在卵巢癌中存在的表达差异，再应用 SangerBox 在线分析 PDGFRA 与卵巢癌患者预后的关联性.构建PDGFRA 过表达质粒，用 MTT 检测 PDGFRA 对 OVCAR3 细胞增殖的影响，用流式细胞术检测 PDGFRA 对 OVCAR3细胞凋亡的影响，用 Transwell 检测 PDGFRA 对 OVCAR3 细胞侵袭能力的影响，用 Western blot 法检测 p-p53、p53及 p21 蛋白的表达水平.结果发现：PDGFRA 在卵巢癌中显著上调，与 PDGFRA 低表达患者相比，PDGFRA 高表达患者的预后更差；与 vector-NC 相比，PAGFRA 组细胞的增殖和侵袭显著提高，细胞凋亡及 p-p53、p21 蛋白的表达水平均显著下降.由此得出，PDGFRA 通过介导 p53 信号通路调控影响 OVCAR3 细胞的增殖、凋亡和侵袭.关键词：卵巢癌；差异表达基因；血小板源性生长因子受体；p53 信号通路中图分类号：Q291；R737.31文献标志码：A文章编号：1671-1114（2023）03-0035-05收稿日期：2022-10-23基金项目：天津市多元投入基金重点资助项目（21JCZDJC00960）；新疆维吾尔自治区科技支疆项目（2017E0263）；新疆医科大学科研创新基金资助项目（XYDCX201569）第一作者：熊廷川（1982），男，博士研究生.通信作者：朱长军（1972），男，教授，主要从事细胞周期调控与肿瘤发生方面的研究.E-mail：.第 43 卷第 3 期2023 年 5 月天 津 师 范 大 学 学 报（自 然 科 学 版）Journal of Tianjin Normal University（Natural Science Edition）Vol.43 No.3May 2023doi：10.19638/j.issn1671-1114.20230306天 津 师 范 大 学 学 报（自 然 科 学 版）2023 年 5 月Keywords：ovarian cancer；differentially expressed gene；platelet derived growth factor receptor；p53 signalling pathway卵巢癌（ovarian cancer，OV）是常见的妇科肿瘤之一，死亡率在妇科癌症中占首要位置，严重影响女性健康1-2.患者早期多无症状或症状并无特异性，且筛查作用有限，导致患者就诊治疗时已经处于晚期，错过了最佳治疗时间.临床上治疗卵巢癌以手术切除为主，辅以化疗、放疗等手段，但卵巢癌患者预后极差，5 年生存率低于 30%3.近年来，随着分子生物学技术的快速发展，越来越多的研究证实靶向分子在调控癌症进展中发挥了重要作用.因此，寻找疾病治疗靶点对于提高卵巢癌患者的诊疗水平以及改善患者的预后具有重要临床意义.血小板源性生长因子受体 （platelet derived grow-th factor receptor，PDGFRA）具有蛋白酪氨酸激酶活性，与血小板源性生长因子结合后，以活化的形式通过各种信号转导通路在细胞生长、增殖、分化中发挥重要作用.研究4证实，PDGFRA 参与器官的正常发育、组织损伤修复及恶性肿瘤进展等生理和病理过程.如 PDGFRA 可调节伤口愈合中的成纤维细胞到肌成纤维细胞的转化以促进组织修复5；LncRNA SNHG8可通过靶向 miR-491/PDGFRA 轴促进胃癌细胞的增殖和侵袭6；CircCDK14 通过调节 PDGFRA 促进胶质瘤的恶性进展和铁死亡抵抗过程7.Ye 等8研究发现，PDGFRA 在卵巢癌组织中表达上调，然而其在卵巢癌进展中的功能作用及具体机制尚未完全阐明.因此，本研究首先基于相关基因芯片 GSE4122 和 GSE14407，分析验证 PDGFRA 在卵巢癌中存在的表达差异，再应用 SangerBox 在线分析 PDGFRA 与卵巢癌患者预后的关联性.进一步通过构建 PDGFRA 过表达质粒、MTT、流式细胞术、Transwell 检测等实验验证 PDGFRA在卵巢癌进展中的功能作用及具体机制，以期为改善卵巢癌患者预后提供新的途径.1实验方法1.1生物信息学分析1.1.1筛选差异表达基因在 GEO 基因数据库中（https：/www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载 2 个 OV 相关基因芯片 GSE4122（包含32 例卵巢癌样本、14 例正常样本）和 GSE14407（包含12 例卵巢癌样本、12 例正常样本）.从 GPL201 获取GSE4122 注释信息，从 GPL570 获取 GSE14407 注释信息，用 R 语言包与 limma 工具包对 2 个相关芯片数据集进行分析，筛选出差异表达基因（|logFC|2，P 2、P 0.05 筛选在 OV 中呈差异表达的基因，结果如图 1 所示.二者取交集，其中包含 PDGFRA.用 SangerBox 在线分析PDGFRA 与 OV 患者预后的关联性，结果如图 2 所示.（b）ROC 曲线UpDown1086420-88-6-2246adj.P.Val（-log10）logFC（b）芯片 GSE14407 中的差异表达基因-40真阳性率1.000.750.500.2501.0000.250.500.75假阳性率1 年3 年5 年t/d（a）KM 生存曲线UpDown1086420-66-4-2024logFCadj.P.Val（-log10）（a）芯片 GSE4122 中的差异表达基因5 00001.000.750.500.250高低生存率分组高表达低表达实验组P=0.004 7HR=1.13，95%CI（1.01，1.26），cut?=?4.044 0003 0002 0001 00003900516422541759151 3723351熊廷川，等：PDGFRA 调控 p53 信号通路介导卵巢癌细胞增殖、凋亡和侵袭的作用及机制37天 津 师 范 大 学 学 报（自 然 科 学 版）2023 年 5 月由图 2 可知，在 374 例 OV 患者中，PDGFRA 的表达与 OV 患者的预后密切相关，与 PDGFRA 低表达患者相比，PDGFRA 高表达患者的预后更差.PDGFRA的表达水平对 OV 患者 1 年、3 年、5 年预后生存预测的 AUC 分别为 0.5795%CI（0.460.67）、0.5695%CI（0.490.63）、0.5395%CI（0.450.60）.2.2PDGFRA 过表达质粒的构建构建 PDGFRA 过表达质粒，分别将 PDGFRA 过表达质粒（PDGFRA 组）和对照质粒（vector-NC 组）转染至 OVCAR3 细胞中，通过 qPCR 和 Western blot 检测转染效率，结果如图 3 所示.由图 3 可以看出，PDGFRA 过 表 达 质 粒 转 染 组 细 胞 中 PDGFRA 的mRNA 和蛋白质丰度均显著高于对照组的数值（P0.05）.因此认为，PDGFRA 过表达质粒可在细胞中成功实现 PDGFRA 的过表达.2.3PDGFRA 对 OVCAR3 细胞增殖、凋亡、侵袭的影响通过 MTT 实验检测 PDGFRA 对 OVCAR3 细胞增殖的影响，用流式细胞术检测 PDGFRA 对 OVCAR3细胞凋亡的影响，用细胞生长抑制剂培养转染质粒的细胞，Transwell 检测 PDGFRA 对 OVCAR3 细胞侵袭能力的影响，结果如图 4 所示.MTT 实验检测发现，PDGFRA 可促进 OVCAR3图 3PDGFRA 过表达质粒转染后 OVCAR3 细胞中PDGFRA 的 mRNA 和蛋白质丰度Fig.3mRNA and protein abundance of PDGFRA inPDGFRA overexpression plasmids-transfectedOVCAR3 cells2.52.01.51.00.50vector-NC 组PDGFRA 组mRNA 相对表达水平*（b）Westem blot 检测 PDGFRA 蛋白水平2.52.01.51.00.50蛋白相对表达水平PDGFRAGAPDHvector-NCPDGFRA*实验组实验组（a）qPCR 检测 PDGFRA mRNA 水平注：*，P 0.01.vector-NC 组PDGFRA 组vector-NC 组 PDGFRA 组2520151050vector-NC 组 PDGFRA 组1.51.00.50080204060t/hvector-NC 组PDGFRA 组细胞增殖活性（OD490nm）（a）MTT 实验检测细胞增殖*（b）流式细胞术检测细胞凋亡（c）Transwell 检测细胞侵袭能力图 4PDGFRA 对OVCAR3 细胞增殖、凋亡、侵袭的影响Fig.4Effects of PDGFRA on the proliferation，apoptosisand invasion of OVCAR3 cells200150100500*细胞凋亡率/%细胞侵袭数量/个107.1106.0105.0104.0103.0102.0100.9PE-HPDGFRA 组103.0104.0106.4105.0FITC-HQ2-10.36%Q2-21.53%Q2-393.27%Q2-44.83%Q2-11.08%Q2-29.99%Q2-377.22%Q2-411.71%vector-NC 组107.1106.0105.0104.0103.0102.0100.9PE-H104.0106.4105.0103.0FITC-H*注：*，P 0.01.实验组实验组vector-NC 组PDGFRA 组38第 43 卷第 3 期（下转第 52 页）熊廷川，等：PDGFRA 调控 p53 信号通路介导卵巢癌细胞增殖、凋亡和侵袭的作用及机制细胞增殖（图 4（a）；流式细胞实验结果表明，PDGFRA显著抑制癌细胞凋亡，提高细胞存活率（图 4（b）.进一步通过 Transwell 实验发现，PDGFRA 可显著增强癌细胞侵袭能力（图 4（c）.综上，PAGFRA 能促进癌细胞增殖和侵袭，抑制细胞凋亡.2.4PDGFRA 通过调控 p53 通路影响 OVCAR3 细胞增殖、凋亡和侵袭采用 Western blot 法检测 p-p53、p53 和 p21 蛋白水平，结果如图 5 所示.由图 5 可以看出，与 vector-NC 组相比，PDGFRA 组细胞的 p-p53、p21 蛋白表达水平显著下调.3讨论卵巢癌是临床上最常见的女性恶性肿瘤之一，由于早期不易诊断，大多数患者确诊时已发生远处转移，严重影响预后，威胁患者的生命健康9-10.据报道，早期诊断发现可以将卵巢癌患者的死亡率降低至10%30%11.近年来，分子调控在肿瘤研究中的作用逐渐被阐明，筛选肿瘤差异表达基因并探究其具体作用机制，可为卵巢癌患者早诊断、早治疗、降低死亡率提供新的切入点.PDGFRA 是酪氨酸激酶受体，通过与其相应的配体结合后活化，能够激活磷脂酰肌醇、cAMP 及多种蛋白质磷酸化途径，调控细胞的增殖和凋亡过程.PDGFRA 在多个肿瘤细胞生长和侵袭过程中发挥作用12，尤其与胃肠道间质瘤（gastrointestinal stromal tu-mors，GIST）的发生发展密切相关，常作为 GIST 诊断中的参考指标13.Na 等14研究发现，PDGFRA 可能是卵巢癌进展的关键因素，对卵巢癌的预后分层和治疗策略的制定具有潜在影响，但未对其在卵巢癌中的作用机制进行具体阐述.GEO 数据库是一个包含基因芯片和高通量测序数据的公共储存库，目前已公开的研究中所涉及的基因表达检测都可以通过该数据库进行查找，是研究疾病相关差异表达基因的有力工具.因此，本研究首先基于 GEO 数据库中卵巢癌相关基因芯片 GSE4122 和 GSE14407 分析验证 PDGFRA 在卵巢癌中存在表达差异，进一步应用 SangerBox 进行在线分析，发现 PDGFRA 对卵巢癌患者的预后不利，再通过细胞实验验证其在卵巢癌进展中发挥的作用.将 PDGFRA 过表达质粒转染至 OVCAR3 细胞，探讨其对卵巢癌细胞增殖、凋亡和侵袭的影响，发现PDGFRA 可显著提高卵巢癌细胞的增殖和侵袭，抑制卵巢癌细胞的凋亡.Fantauzzo 等15研究发现，p53 是 PI3K 参与PDGF-RA 信号传导的新型效应物.p53 是目前公认的抑癌基因，可以通过调控肿瘤细胞增殖相关基因的表达水平抑制肿瘤的发生发展，p53 的失活是肿瘤形成的重要原因16.p53 信号通路是抗肿瘤药物开发中最关键的途径之一，p21 作为 p53 信号通路中的关键靶基因，也可通过抑制细胞的增殖发挥抑癌基因的作用，而在某些癌症中，p21 表达失调，失去抑癌作用17.本研究将 PDGFRA 过表达质粒转染至 OVCAR3 细胞进行干预，结果发现，p-p53 和 p21 蛋白表达水平均显著下调.结果与上述研究一致，证实了 PDGFRA 通过介导 p53通路促进卵巢癌细胞的增殖和侵袭，抑制了卵巢癌细胞的凋亡.综上所述，影响卵巢癌患者预后的差异基因PDGFRA 可通过介导 p53 通路促进卵巢癌细胞的增殖和侵袭，抑制卵巢癌细胞的凋亡.这一结果为探索卵巢癌治疗方法提供了新的思路和方向.vector-NC 组PDGFRA 组p-p53p53p21GAPDH1.51.00.50p-p53p21p53相对蛋白表达水平PDGFRA 组vector-NC 组*图 5PDGFRA 过表达对 p53 信号通路相关因子蛋白水平的影响Fig.5Effect of PDGFRA overexpression on abundance ofp53 signaling pathway correlated factors蛋白注：*，P 0.01.39天 津 师 范 大 学 学 报（自 然 科 学 版）2023 年 5 月?（上接第 39 页）WANG D F.Ecological Risk Assessment of Soil Salinization in EbinurLake Wetland National Nature ReserveD.Urumqi：Xinjiang Universi-ty，2016（in Chinese）.23 XU C D，LIU Z J，ZHU X L，et al.Comprehensive assessment of soilsalinization risk in artificial oasis in arid areaJ.Water Resources andHydropower Engineering，2021，52（6）：151-161.24 张荣群，乔月霞，薛佳妮.银川平原土壤盐渍化与土地利用强度的空间关联分析J.地球信息科学学报，2015，17（5）：598-606.ZHANG R Q，QIAO Y X，XUE J N.Spatial relationship analysis be-tween the soil salinization and land use intensity in Yinchuan PlainJ.Journal of Geo-Information Science，2015，17（5）：598-606（in Chi-nese）.25 李月芬，汤洁，李艳梅.用主成分分析和灰色关联度分析评价草原土壤质量J.世界地质，2004，23（2）：169-174.LI Y F，TANG J，LI Y M.Evaluation on grassland soil quality with anal-ysis of principal 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