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42 2023.8试验研究0 引言大肠杆菌（Escherichia coli）是人和动物肠道内的常在菌，也可引起人和牛、羊、猪及禽类的疾病，大肠杆菌病是畜牧养殖中最常见的疾病之一，严重影响我国收稿日期：2023-06-01作者简介：王冬经（1992-），女，云南宣威人，研究实习员，研究方向：高原动物传染病学。王冬经藏羊源致病性大肠杆菌的分离鉴定J现代畜牧科技，2023，99（8）：42-45doi：10.19369/ki.2095-9737.2023.08.010WANG DongjingIsolation and Identification of Pathogenic Escherichia Coli from Tibetan SheepJModern Animal Husbandry Science&Technology，2023，99（8）：42-45藏羊源致病性大肠杆菌的分离鉴定王冬经1，2（1.西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所，西藏 拉萨 850009；2.省部共建青稞和牦牛种质资源与遗传改良国家重点实验室，西藏 拉萨 850000）摘要：为确定拉萨市某羊场藏羊发生腹泻、便血、食欲不振、消瘦等症状的病因，采集新鲜血便，进行病原的分离培养，并进行生化鉴定、PCR鉴定和遗传进化分析。结果显示，从藏羊血便、稀粪中分离得到5株细菌，分离株在麦康凯培养基和伊红美蓝培养基上的菌落形态均与大肠杆菌一致，将分离株分别命名为XZ-1、XZ-2、XZ-3、XZ-4、XZ-5；分离菌可以分解葡萄糖、果糖、明胶、甘露醇、麦芽糖、山梨醇、乳糖、尿素酶，硫化氢试验呈阴性；PCR鉴定结果与预期相符，得到大小约为1 500 bp的目的条带；序列分析结果显示，5株分离株之间的同源性为98.7%100%，与大肠杆菌参考株的同源性为98.5%100%，分离株与肠炎沙门氏菌的同源性为96.7%96.9%，与枯草芽孢杆菌分离株的同源性为77.6%79.1%；分离株16S rRNA基因进化树显示，5株分离株与大肠杆菌处于同一支，而与肠炎沙门氏菌和枯草芽孢杆菌均处于不同分支。研究结果证实，引起藏羊便血、腹泻的病原为大肠杆菌，为该病的防控提供科学依据。关键词：藏羊；大肠杆菌；分离鉴定中图分类号：S858.26文献标识码：Adoi：10.19369/ki.2095-9737.2023.08.010Isolation and Identification of Pathogenic Escherichia Coli from Tibetan SheepWANG Dongjing1，2（1.Tibet Livestock Research Institute，Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Science，Lhasa Tibet 850009，China；2.State Key Laboratory of Highland Barley and Yak Germplasm Resources and Genetic Improvement，Lhasa Tibet 850009，China）Abstract：To determine the etiology of diarrhea，blood in stool，loss of appetite and wasting in Tibetan sheep on a sheep farm in Lhasa，fresh blood stool was collected，isolated and cultured for pathogens，and subjected to biochemical identification，PCR identification and genetic evolutionary analysisThe results showed that five strains of bacteria were isolated from blood stool and diluted feces of Tibetan sheep，and the colony morphology of the isolates on McConkey medium and Erythromax blue medium were consistent with E.coli，and the isolates were named XZ-1，XZ-2，XZ-3，XZ-4，XZ-5；the isolates could decompose glucose，fructose，gelatin，mannitol，maltose，sorbitol，lactose，urease，and hydrogen sulfide The PCR identification results were as expected，and the target bands of about 1 500 bp in size were obtained；the sequence analysis results showed that the homology among the five isolates was 98.7%100%，and the homology with the E.coli reference strain was 98.5%100%The homology of the isolates with Salmonella enterica was 96.7%96.9%，and the homology with Bacillus subtilis isolates was 77.6%79.1%The 16S rRNA gene evolutionary tree of the isolates showed that the five isolates were in the same branch with E.coli，while they were in different branches with Salmonella enterica and Bacillus subtilisThe results of the study confirmed that the pathogen causing blood in stool and diarrhea in Tibetan sheep is E.coli，which provides a scientific basis for the prevention and control of the diseaseKeywords：Tibetan sheep，Escherichia coli，isolation and identification432023.8试验研究牛、羊产业的健康发展。大肠杆菌可分为致病性大肠杆菌和非致病性大肠杆菌1，培养条件简单，在伊红美蓝培养基平板上形成带金属光泽的菌落，在麦康凯培养基平板上生长为粉红色菌落2，临床中可根据这一培养特性可初步诊断该病。大肠杆菌可感染多种动物和人，其中羊大肠杆菌病是由于羔羊或成年羊感染了致病性大肠杆菌而发生的一种急性、致死性的传染病，本病的传染性极强，特别是在哺乳时的羔羊易遭受大肠杆菌的侵袭，临床上可分为败血型和肠炎型2种，饲养管理不当、饲养环境不良、乳头不净或护理不当时常发此病3。大肠杆菌造成的羔羊腹泻十分普遍，大肠杆菌病发生后，若不采取针对性措施予以治疗，则可能造成大量羔羊死亡，给养殖场造成严重的经济损失，严重威胁养羊业的健康发展4。据资料显示，除了单一感染的情况外，大肠杆菌常常与羊产气荚膜梭菌、支原体、巴氏杆菌等混合感染，造成更加致命的危害5。由于羊养殖期间大量使用抗菌药物，造成羊源大肠杆菌耐药株不断增多，耐药机制日趋复杂，给羊疾病的防治带来严峻挑战6。藏羊又称为藏系羊或藏系绵羊，是由古羌人驯化的羌羊流传而来，形成历史悠久，目前主要分布于我国西藏、甘肃、四川、云南等高海拔地区，对高原恶劣的生态环境具有很强的适应能力，是中国三大粗毛绵羊品种之一，是青藏高原地区农牧民的主要生产和生活资料7，是青藏高原地区重要的家畜，对当地经济社会发展具有重要意义。冬春交替之际，藏羊常发生腹泻病，病羊出现腹泻、便血、食欲不振、消瘦等症状，疑似为羊大肠杆菌病，本研究旨在分离拉萨养殖场藏羊腹泻的病原菌，为该病的防治提供一定参考。1 材料与方法1.1 试验材料从拉萨市318公路沿线某养殖场无菌收集新鲜的藏羊血便或稀粪，低温保存，快速运送至实验室，进行病原菌的分离和培养。1.2 分离培养与染色镜检取少许藏羊粪便接种于LB（Luria-Bertani）培养基，摇菌，过夜。将过夜培养的菌液划线至伊红美蓝培养基和麦康凯固体培养基进行分离纯化，直至得到单克隆菌落。1.3 生化鉴定选取葡萄糖、果糖、明胶、甘露醇、麦芽糖、山梨醇、乳糖、尿素酶和硫化氢9种微量生化鉴定管进行分离株生化检测。操作过程严格遵照说明书进行。1.4 分子生物学鉴定分别取2 mL分离株菌液，提取其DNA，合成16S rRNA通用引物，进行PCR扩增，并将产物送至公司进行序列测定。通过NCBI进行序列比对分析，下载参考菌株序列，见表1，进行同源性分析、构建进化树。表1 16S rRNA参考菌株菌株种属菌株名称登陆号来源国家大肠杆菌7MK621226.1不详中国大肠杆菌54MK621257.1不详中国大肠杆菌174MH671474.1猪中国大肠杆菌A3CBS20-21（1）-E OL757525.1不详韩国大肠杆菌ECMN083306.1不详中国大肠杆菌EGI306MN704514.1不详中国大肠杆菌EGI311MN704518.1不详中国大肠杆菌IADCAMB11MH619508.1食品印度大肠杆菌ICMP 20884MG786395.1水新西兰大肠杆菌JCD08MH532537.1不详中国大肠杆菌JCD09MH532539.1不详中国大肠杆菌Mos.Rock dustMF496270.1不详埃及大肠杆菌Mu-5OP889004.1不详土耳其大肠杆菌VTM4R8KJ585689.1北美驼鹿美国大肠杆菌Y4-2MT192517.1不详中国肠炎沙门氏菌S85_0453MT621365.1家禽马来西亚枯草芽孢杆菌HSY21MT513998.1土壤中国2 结果2.1 分离培养从藏羊血便、稀粪中分离得到5株细菌，分离株在麦康凯培养基和伊红美蓝培养基上的菌落形态均与大肠杆菌一致，将分离株分别命名为XZ-1、XZ-2、XZ-3、XZ-4、XZ-5。2.2 生化鉴定对分离株进行生化特性检测，结果显示分离株均可分解葡萄糖、果糖、明胶、甘露醇、麦芽糖、山梨醇、乳糖、尿素酶，硫化氢试验呈阴性，生化检测结果与大肠杆菌的生化特性一致。2.3 16S rRNA PCR鉴定结果PCR鉴定结果与预期相符，得到大小约为1 500 bp的目的条带，见图1。M：Trans2K Plus DNA Ladder；1、2、3、4、5：依次代表分离株XZ-1、XZ-2、XZ-3、XZ-4、XZ-5图1 分离菌株16S rRNA基因PCR扩增结果2.4 序列分析序列分析结果，见表2。5株分离株之间的同源性为98.7%100%，与大肠杆菌参考株的同源性为1 500 bpbp5 0003 0002 0001 000750500250100M1 2 3 4 544 2023.8试验研究98.5%100%，其中XZ-1与大肠杆菌参考株的同源性为98.6%99.9%；XZ-2与大肠杆菌参考株的同源性为99.1%99.9%；XZ-3与大肠杆菌参考株的同源性为99.0%100%；XZ-4与大肠杆菌参考株的同源性为99.3%100%；XZ-5与大肠杆菌参考株的同源性为98.5%100%。分离株与肠炎沙门氏菌的同源性为96.7%96.9%，与枯草芽孢杆菌分离株的同源性为77.6%79.1%。分离株16S rRNA基因进化树，见图2。5株分离株与大肠杆菌处于同一支，而与肠炎沙门氏菌和枯草芽孢杆菌均处于不同分支。因此5株分离株均为大肠杆菌。图2 分离菌株与参考株16S rRNA基因进化树3 讨论大肠杆菌是人类肠道中的正常菌群之一，部分菌株携带致病基因，具有致病性，因此在我国卫生部公布的人间传染的病原微生物名录中将致病性大肠杆菌列为第3类病原微生物，属条件致病性微生物，是人类腹泻、肠炎、感染等疾病的致病菌之一，也称为致泻性大肠杆菌（DEC）8。大肠杆菌病是藏羊最常见的传染病之一，给西藏养羊业造成较大的经济损失。羊致病性大肠杆菌可引起羔羊腹泻和败血症，使羊出现消瘦、肉用价值降低，对畜主造成一定的经济损失9。近年大肠杆菌感染引起羊发病的相关报道较多，从20112022年间均有报道：2011年，薛俊龙10等从雁门关地区养羊企业和规模专业户采集180 头份病料，分离培养出72株大肠杆菌，分离株对氨苄西林的耐药率为50%。2014年，吴忆春11从1例病死洼地绵羊组织内分离到1 株致病性细菌，经分离培养、生化特性分析、血清分型等鉴定，结果表明该病原菌为羊致病性大肠杆菌，其血清型为078，16S rDNA基因测序结果表明，该菌与大肠杆菌同源性为100%。2019年，刘晨阳12从宁夏回族自治区和青海高原牧区无菌采集羊肺脏、肛门拭子、小肠等样品145份，进行病原菌的分离培养，结果从145份羊样品中共分离得到大肠杆菌131株，其中宁夏地区的样品分离率为91.0%、青海地区的样品分离率为88.9%。2020年，王显峰13等采集患羊鼻腔拭子150份，分离大肠杆菌45株，分离株血清型复杂，携带多种毒力基因，耐药性严重。2020年，李国基14成功从内蒙古乌兰浩特市周边羊场的56份腹泻绵羊粪便样品中分离出40株大肠杆菌，通过琼脂稀释法成功测定其对金霉素等5种抗菌药物的药物敏感性。2022年，张国华15从乳样中分离到1株革兰氏阴性菌，镜检结果、生化试验结果与大肠杆菌相符，分离株大肠杆菌，对多种抗生素产生不同程度的耐药，对小鼠具有较强的致病性。同年，王永亮1对吉林省部分地区16个不同动物源养殖场送检的246 份样本进行细菌的分离、鉴定，通过革兰染色，16S rDNA测序分析等方法共分离获得66株大肠杆菌，分离率为13.2121086420Nucleotide Substitutions（100）XZ-1Escherichia coli strain 7Escherichia coli strain Mu-5Escherichia coli strain VTM4R8Escherichia coli strain 54Escherichia coli strain ECEscherichia coli strain JCD08XZ-2Escherichia coli strain JCD09Escherichia coli strain ICMP20884Escherichia coli strain A3CBS20-21(1)-EEscherichia coli strain Y4-2Escherichia coli strain IADCAMB11XZ-4Escherichia coli strain Mos.Rock dustEscherichia coli strain EGI311Escherichia coli strain EGI306XZ-3Escherichia coli strain 174XZ-5Salmonella Enteritidis strain_S85_0453Bacillus subilis strain HSY21表2 分离菌株与参考株16S rRNA基因同源性表452023.8试验研究26.8%；对分离菌株进行药物敏感性检测，结果显示分离菌对四环素、氟苯尼考马波沙星四环素耐药率较高。2022年，冯杰16等采集宁夏地区的108份病料进行大肠埃希氏菌的分离鉴定，在108 份病料中共分离到58 株大肠埃希氏菌，分离率达53.7%；分离菌株中耐药株共34株（58.6%）。综上所述，从20112022年，我国羊大肠杆菌病发病频繁、造成影响严重，其中规模化养殖场、散养户均有发生，绵羊、山羊均有发生，从粪便、鼻拭子、乳样、组织中均有分离，且大多数分离株致病性较强，对多种药物存在耐药性，可见目前我国羊大肠杆菌病常发多发，药物治疗效果不佳，应引起重视。本研究从拉萨市某养殖场藏羊血便、稀粪中分离得到5株细菌，经过分离培养、染色观察、生化鉴定及分子生物学鉴定，最终确定该分离菌为致病性大肠杆菌，证明引起此次藏羊腹泻、便血的病原为致病性大肠杆菌。该病目前在拉萨地区藏羊群体中发生频繁，给养殖户造成了较大的经济损失，应引起重视，科学合理防控。4 防控建议大肠杆菌病对羊的健康安全危害相当大，且具有较强的传染性，发病率、致死率高，一旦出现就可能导致羊的养殖经济效益遭到重创，要重视并切实做好对羔羊大肠杆菌病的诊治工作，以保障羊养殖的经济效益17。羊大肠杆菌病发病呈急性，往往以预防为主，接种疫苗是动物疾病防治的重要措施，加强母羊和羔羊饲养管理是降低羊大肠杆菌病发病率的重要方面，若在病程早期对症治疗也能取得良好效果，可通过不断的环境消毒来有效杀灭病原体，但要交替使用各类消毒药品，避免长期使用单一种类的消毒药品而导致菌群产生耐受性 12。要进行科学的饲养管理，保证饲料、饮水的质量，科学配比饲料，可适当添加中草药、益生菌、酶制剂等，保持圈舍干净卫生，不堆积粪便和污水，保持通风和光照，做好监测排除，病死动物及时隔离和无害化处理，严格检疫，不盲目引进，做好免疫接种工作，提高群体免疫力，降低发病率18。5 结论本研究从藏羊血便、稀粪中分离得到5株细菌，分离株在麦康凯培养基和伊红美蓝培养基上的菌落形态均与大肠杆菌一致，将分离株分别命名为XZ-1、XZ-2、XZ-3、XZ-4、XZ-5；分离菌可以分解葡萄糖、果糖、明胶、甘露醇、麦芽糖、山梨醇、乳糖、尿素酶，硫化氢试验呈阴性；PCR鉴定结果与预期相符，得到大小约为1 500 bp的目的条带；序列分析结果显示，5株分离株之间的同源性为98.7%100%，与大肠杆菌参考株的同源性为98.5%100%，分离株与肠炎沙门氏菌的同源性为96.7%96.9%，与枯草芽孢杆菌分离株的同源性为77.6%79.1%；分离株16S rRNA基因进化树显示，5株分离株与大肠杆菌处于同一支，而与肠炎沙门氏菌和枯草芽孢杆菌均处于不同分支。研究结果证明引起藏羊腹泻、便血的病原为致病性大肠杆菌，为今后藏羊大肠杆菌病的防控提供参考依据。参考文献1王永亮吉林省部分地区动物源大肠杆菌耐药性及多重耐药株全基因组序列分析D长春：吉林农业大学，20222贾燕犊牛腹泻源大肠杆菌的耐药性与致病性的研究及毒力和耐药基因的分布调查D呼和浩特：内蒙古农业大学，20223庞方圆，满达，关菲，等一例羊败血性大肠杆菌病的诊断J现代农业，2021（6）：68-694龙海宁，农绍锋，吴静，等规模化羊场致羔羊腹泻大肠杆菌的毒力基因检测及致病性试验J中兽医学杂志，2021（12）：10-125张森，郭倩妤，汤德元，等某羊场暴发产气荚膜梭菌、支原体与大肠杆菌混合感染的诊断J中国兽医杂志，2020，56（4）：50-516刘正明，李金泉，黄德浩，等内蒙古地区羊源大肠杆菌耐药性研究J中国畜牧兽医，2017，44（3）：839-8467胡亮，孙伟，马月辉藏系绵羊群体遗传多样性及遗传结构分析J畜牧兽医学报，2019，50（6）：1 145-1 1538申丹丹致病性大肠杆菌O157：H7和O55：H7噬菌体的分离及动物实验评价D无锡：江南大学，20229陈家露，蔡重振，次旦，等西藏那曲市羊源大肠杆菌分离鉴定及耐药性研究J中国畜牧兽医，2019，46（12）：3 759-3 76710 薛俊龙，李宝钧，田林君，等雁门关地区羊致病性大肠杆菌的分离及生物特性分析J激光生物学报，2011，20（2）：250-25311 吴忆春羊源O78型大肠杆菌的分离及16S 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