绿原酸不同位置不同程度乙酰化物的制备及其生物活性研究.pdf

内蒙古大学倾I.学位论文学校代码：10126分类号：_学号：31408130编号:_论文题目绿原酸不同位置不同程度乙酰化物的 制备及其生物活性研究学 院：生命科学学院专 业：生物工程研究方向：天然药物与功能食品 万方数据内蒙古大学硕士学位论文原创性声明本人声明；所呈交的学位论文是本人在导师的指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。除本文已经注明引用的内容外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得内蒙古大型及其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论 文中作了明确的说明并表示谢意。在学期间研究成果使用承诺书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：内蒙 古大学有权将学位论文的全部内容或部分保留并向国家有关机构、部门送交学 位论文的复印件和磁盘，允许编入有关数据库进行检索，也可以采用影印、缩 印或其他复制手段保存、汇编学位论文。为保护学院和导师的知识产权，作者 在学期间取得的研究成果属于内蒙古大学。作者今后使用涉及在学期间主要研 究内容或研究成果，须征得内蒙古大学就读期间导师的同意；若用于发表论文，版权单位必须署名为内蒙古大学方可投稿或公开发表。万方数据内蒙古大学硕士学位论文绿原酸不同位置不同程度乙酰化物的制备及其生物活性研究摘要天然产物的开发与利用一直占据着药物发展史的重要地位。天 然产物在临床用药中仍占有很大比例。许多天然产物本身具有良好 的生物活性，但是因为其结构的特殊性难以在生物体内发挥其重要 的生物活性作用，因此需要通过化学修饰的手段，对一些天然药物 产物的结构加以修饰改造使其能够发挥更大的作用。绿原酸是一类在自然界中广泛分布的天然产物，它是植物的次 生代谢产物，生物活性广泛。目前对于绿原酸的研究主要集中于植 物化学分离提取与药理活性方面。本论文选取绿原酸（50-咖啡酰奎宁酸）和绿原酸的戊酮缩合 物为原料，将原料在醋酸酎/口比咤体系中进行全乙酰化，再利用酸、碱、酶水解制备出了 1 乙酰绿原酸，1,3-二乙酰绿原酸，1,3,4.三乙 酰绿原酸以及1,3,43-四乙酰绿原酸。三种水解条件下，酚羟基的乙 酰基均先于奎宁酸部分的醇羟基上的乙酰基被水解；酸、碱对C-3,C-4位上的乙酰基水解进程接近，实验过程中得到1,3-二乙酰绿原酸 与1,4二乙酰绿原酸；位的乙酰基最稳定。用酸、碱、酶三种水 解条件均制备出了 1,3,4，三乙酰绿原酸。其中，酶法水解对酚羟基 上的乙酰基有高度选择性，反应速率快，产物单一，后处理简单，所以酶法制备1,3,4,-三乙酰绿原酸是最理想的选择。生物活性实验 结果表明，部分-0H被乙酰化的绿原酸衍生物仍具有绿原酸分子本 I万方数据内蒙古大学硕士学位论文身清除DPPH自由基的能力，而五乙酰化绿原酸则不具备此能力。1,3,4.三乙酰化绿原酸与1,3,43-四乙酰化绿原酸对被叔丁基过氧化 氢损伤的HepG2细胞具有保护作用。1,7-(3-戊酮卜绿原酸缩酮与1,7-(3-戊酮3,4,3：4,-四乙酰绿原酸缩酮可有效地抑制HepG2细胞的增殖。以上研究结果表明对绿原酸及其衍生物不同位置上的羟基进行不同 程度的乙酰化修饰可制备具有不同活性的衍生物。关键词：天然产物；绿原酸；乙酰化；衍生物；生物活性II万方数据内蒙古大学硕士学位论文SYNTHESIS AND BIOACTIVITY INVESTIGATION OF CHLOROGENIC ACID DERIVATIVES WITHDIFFERENT ACETYLATION DEGREES ATDIFFERENT POSITIONSABSTRACTDev elo pment a nd utiliza tio n o f na tura l pro d uc ts h a s been o c c upy ing a n impo rta nt po sitio n in th e h isto ry o f d rug d isc o v ery.A la rg e pro po rtio n o f presently used c linic a l d rug s a re na tura l pro d uc ts a nd th eir d eriv a tiv es.Ma ny na tura l pro d uc ts th emselv es h a v e g o o d in v itro bio lo g ic a l a c tiv ities.Ho wev er,th e spec ia l na ture o f th e struc tures o f so me na tura l pro d uc ts h a mpered th em to d ispla y bio a c tiv ities in v iv o.Th erefo re,it is impo rta nt to mo d ify th e c h emic a l struc tures o f th ese na tura l pro d uc ts by c h emic a l o r bio lo g ic a l mea ns in o rd er to impro v e th eir in v iv o bio a c tiv ity.Ch lo ro g enic a c id,a pla nt sec o nd a ry meta bo lite,is wid ely d istributed in na ture.It h a s numero us ex c ellent bio a c tiv ities,suc h a s free ra d ic a l sc a v eng ing,a ntisepsis a nd a nti-infla mma tio n,a nti-v ira l,a nti-d ia betes,h y po lipid emic,a nd h epa to pro tec tiv e.Up till no w,mo st resea rc h es o n c h lo ro g enic a c id h a v e been fo c used o n th e iso la tio n,purific a tio n a nd ph a rma c o lo g ic a l inv estig a tio n o f th is c o mpo und fro m pla nts.Th e present resea rc h wa s c a rried o ut to use c h lo ro g enic a c id(5-0-c a ffeo y lquinic a c id)o r its penta keta l d eriv a tiv e a s sta rting ma teria ls to prepa re th eir a c ety la ted d eriv a tiv es a nd to inv estig a te th e bio a c tiv ities o f th e prepa red d eriv a tiv es.Pera c ety la ted d eriv a tiv es were o bta ined by trea tment o f th e sta rting ma teria ls with a c etic a nh y d rid e/py rid ine.Hy d ro ly zing pera c ety la ted c h lo ro g enic a c id with HC1,Na 2c O3 o r lipa sein 万方数据内蒙古大学硕上学位论文to o bta in 1-a c ety l c h lo ro g enic a c id,1,3-d ia c ety l c h lo ro g enic a c id,1,3,4-tria c ety l c h lo ro g enic a c id a nd 1,3,4,3-tetra a c ety l c h lo ro g enic a c id.In th ese th ree h y d ro ly sis c o nd itio ns,Und er th ese c o nd itio ns,th e a c ety l g ro ups in th e ph eno lic h y d ro x y l were mo re ea sy to be h y d ro ly zed th a n th o se in th e a lc o h o lic h y d ro x y l o f quinic a c id pa rt;Th e a c ety l g ro ups a t po sitio n 3 a nd 4 were simila rly sensitiv e to th e h y d ro ly sis c o nd itio n using HC1 o r Na 2c o3,c o mpo und s 1,3-d ia c ety l c h lo ro g enic a c id a nd 1,4-d ia c ety l c h lo ro g enic a c id being fo und in th e ex perimenta l pro c ess;Th e a c ety l g ro up a t C-l wa s th e mo st sta ble.Co mpo und 1,3,4-tria c ety l c h lo ro g enic a c id wa s o bta ined in a ll th e th ree h y d ro ly sis c o nd itio ns with HC1,Na 2c O3 o r lipa se.Lipa se wa s th e mo st selec tiv e in h y d ro ly sis o f th e a c ety l g ro ups a t th e ph eno lic h y d ro x y s.In a d d itio n,th e enzy me h y d ro ly sis wa s fa st to o bta in a sing le pro d uc t,wh ic h ma d e th e po st purific a tio n pro c ess simple,so lipa se h y d ro ly sis o f pera c ety la ted c h lo ro g enic a c id wa s a id ea l meth o d to prepa re 1,3,4-tria c ety l c h lo ro g enic a c id.Th e bio a ssa y results sh o wed th a t th e pa rtia l a c ety la ted c h lo ro g enic a c id d eriv a tiv es ma inta ined th e a bility to sc a v eng e DPPH free ra d ic a l wh ile fiilly a c ety la ted c h lo ro g enic a c id a nd fully a c ety la ted keta l d eriv a tiv es d id no t h a v e th is a bility.Ac ety la ted c h lo ro g enic a c id d eriv a tiv es sh o wed pro tec tio n o f o x id a tiv e d a ma g ed o n HepG2 c ells.Th e l,7-(3-penta no ne)-3,4,3,4-tetra a c ety l c h lo ro g enic a c id keta l sh o wed po tent inh ibito ry a c tiv ity o n th e pro lifera tio n o f HepG2 c ells.So a c ety la tio n o f c h lo ro g enic a c id o r its keta l d eriv a tiv es a t d ifferent po sitio ns in d ifferent d eg rees c o uld result in c h emic a l c o mpo und s o f d ifferent bio a c tiv ities.Keywords:na tura l pro d uc ts;c h lo ro g enic a c id;a c ety la tio n;sy nth esis;bio lo g ic a l a c tiv ityIV万方数据内蒙古大学硕士学位论文目录第一章综述二.11.1 绿原酸简介.11.2 绿原酸国内外的研究进展.11.2.1 绿原酸的发现和命名、化学结构和理化性质.11.2.2 绿原酸的分布.2123绿原酸的合成.31.23.1 绿原酸的可能生物合成途径.31.23.2 绿原酸的化学合成研究进展.41.3绿原酸 的生物活性.5131抗氧化作用.5132抑制突变和抗肿瘤作用.5133对透明质酸酶与葡萄糖磷酸位移酶的抑制作用.6L3.4抗菌、抗病毒等作用.613.5其它生物活性.61.4绿原酸的应用前景.7L5本课题研究意义.8第二章五乙酰化绿原酸的合成及部分水解产物的制备.92.1 设计合成路线.92.1 实验试剂与实验设备.102.1.1 实验试剂.102.1.2 实验设备.112.2 实验方法.112.2.1 1,3,4,3；率五乙酰绿原酸的合成（见合成路线1）.112.2.2 1,3,4-三乙酰绿原酸的制备（见合成路线2）.12万方数据内蒙古大学硕士学位论文2.2.3 1-乙酰绿原酸的合成（见合成路线3）.132.2.3.1 正交实验确定酸水解条件.132.23.2 1-乙酰绿原酸的制备与纯化.142.2.4 1,3二乙酰绿原酸的制备（见合成路线4）.16225 1,3,43四乙酰绿原酸的制备（见合成路线5）.172.3 酶催化水解实验.182.3.1 酶催化水解制备1,3,4-三乙酰绿原酸.182.4 结果分析与讨论.20第三章绿原酸缩粥类乙酰化物的制备.223.1 实验原料的来源及鉴定.223.2 1,7-（3-戊朗）-3,4,3：4：四乙酰绿原酸缩酮的合成.233.3 结果分析与讨论.24第四章绿原酸衍生物活性的测定.254.1 抗氧活性的测定.264.1.1 DPPH法测定抗氧化活性的实验原理.264.1.2 实验试剂与实验设备.274.1.3 实验方法.274.1.4 实验结果与分析.284.3小结.29第五章细胞毒性及抗氧化实验.305.1 细胞培养.305.1.1 实验试剂及实验设备.305.1.2 培养基的配制.305.1.3 复苏细胞及培养.31VI万方数据内蒙古大学硕士学位论文5.2 MTT法检测绿原酸及其乙酰化物对HepG2的细胞毒性.315.2.1 实验原理.315.2.2 实验试剂与实验设备.二.315.2.3 实验方法.325.2.4 实验结果与分析.325.3 绿原酸及其乙酰化物对HepG2细胞内ROS水平的影响.335.3.1 实验试剂与实验设备.335.3.2 实验方法.335.3.3 实验结果与分析.345.4 小结.34第六章总结.35参考文献.36附图.39致谢.45VII万方数据内蒙古大学硕士学位论文第一章综述1.1 绿原酸简介绿原酸(Ch lo rig enic a c id)别名咖啡糅酸，是植物细胞有氧呼吸过程中经 过HMP途径(磷酸戊糖途径)的中间代谢物合成的一种苯丙素类化合物，是 酚类化合物的典型代表。科学家Hulme口于20世纪50年代从苹果中分离提取 出了绿原酸，随着人们对绿原酸生物活性的深入研究，人们给以绿原酸更高的 关注。大量研究结果表明：绿原酸具有多种生物活性，例如抗菌、抗病毒、保 肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂以及抗氧1化等。除了以上的药理作用，绿 原酸还是非常重要的工业原料，常常作为高级化妆品的添加剂、植物生长激素 以及食品添加剂来使用。图1.1绿原酸化学结构Figure.1.1 T he chemical structure of chlorogenic acid1.2 绿原酸国内外的研究进展121绿原酸的发现和命名、化学结构和理化性质1897年Ca mpbell和Osbo me在向日葵籽中共同发现了一种名为：h eli-a nth o ta nnic a c id的物质，该物质是引起向日葵籽蛋白变黑的根本原因。Go rter等 人于1909年确认该化合物为绿原酸。1947年，Nelso n和Rud kin两位科学家初 次确定了绿原酸的化学结构，即奎尼酸与咖啡酸缩合而成的一种酯。绿原酸，淡黄色的固体，化学名5-0-咖啡酰奎尼酸(5-O-c a ffeo y lquinic a c id),分子式G6Hl8。9,相对分子质量354.30,熔点208C,25时在水中的 溶解度为4%。绿原酸可溶于乙醇、丙酮，微溶于乙酸乙酯，在氯仿、乙醛、苯 等亲脂性的有机溶剂中溶解度较差。万方数据内蒙古大学硕士学位论文122绿原酸的分布绿原酸广泛分布于植物中，无论是在高等的双子叶植物还是低等的藤类植 物中均含有该物质，特别是在葵花籽仁、粕、可可豆、咖啡豆、沙棘果以及金 银花、杜仲等传统中药中绿原酸的含量较高。绿原酸是金银花有效成分之一，人们常以金银花中绿原酸含量的高低来评价其质量的优劣，药典中规定绿原酸 含量低于1.5%的金银花定为不合格。同时，金银花从花蕾到开放过程中绿原 酸的含量呈逐渐下降的趋势。在日常生活中，人们可以通过食用粮食、蔬菜、水果、茶等或多或少地摄取绿原酸及其类似物质。天然存在的绿原酸类成分也 有很多种，其中包括：绿原酸，新绿原酸，异绿原酸，隐绿原酸，绿原酸甲酯，绿原酸乙酯，莱蓟素，32香豆奎宁酸等山。表1.1天然存在绿原酸的成分T able.1.1 Naturally occurring chlorogenic acid analogues acid序号名称RIR2R3R4来源1绿原酸(5vafffeoylquinic acid)HH咖啡酰H来源广泛2绿原酸甲酯(methyl chlorogenate)咖啡酰HHCH,杜仲3绿原酸乙 0H(ethyl chlorogenate)咖啡酰HHCH3cH2西南忍冬4除绿原酸(4-caffeoylquinic acid)H咖啡酰HH莱蓟5新绿原酸(3-caffeoylquinic acid)咖啡酰HHH菜蓟6异绿原酸 A(4,5-dicaffeoylquinic acid)H咖啡酰咖啡酰H金银花：桅子7异绿原酸 B(3,4-dicaffeoylquinic acid)咖啡酰咖啡酰HH金银花8异绿原酸 C(3,5-dicaffeoylquinic acid)咖啡酰H咖啡酰H金银花9莱蓟素(1,4-dicaffeoylquinic acid)咖啡酰HH咖啡酰林荫千里光103-香豆酰奎尼酸(3-cumaroylquinic acid)香豆酰HHH枳模万方数据内蒙古大学硕士学位论文123绿原酸的合成1.2.3.1绿原酸的可能生物合成途径据报道，目前公认的可能由生物合成绿原酸的途径有三条，如图1.2所示。其中途径 A 可能是作为在 HQT(h y d ro x y c inna mo y l Co A quina te h y d ro x y c inna mo y l tra nsfera se)活性较低的细胞器内合成绿原酸的途径。关于途径B,由于在拟南 芥细胞中 HCT(h y d ro x y c inna mo y l Co A sh ikima te/quina te h y d ro x y c in-na mo y l tra nsf era se)和C3H(p-c o uma ra te 3，-h y d ro x-la se)活性都很高的情况下，并没有发现绿原 酸，说明途径B可能不是植物合成绿原酸的主要途径”目前大量的研究表明 途径C,即通过HQT合成绿原酸的途径可能是生物合成的主要途径2均。Rh o d es和Ulbric h等的研究小组分别从多种高等植物中分离获得了 HQT,并对其催化特性进行了研究，发现其可以将香豆酰-Co A(Tc o uma ro y l-Co A)和咖啡酰-Co A(c o fifeo y l-Co A)分别与奎尼酸化合，最终形成香豆酰-奎尼酸(pc o uma ro y l quinic a c id)和绿原酸。因此，证实了 HQT在植物界的广泛分布并 与酚类化合物在高等植物中的普遍存在之间具有紧密的联系。2004年，Nig g eweg等四在番茄和烟草中扩增得到了 HQT的全长c DNA,并将其导入到大肠杆菌中表达，表达的产物具有将香豆酰-Co A与奎尼酸合成香 豆酰-奎尼酸、将咖啡酰-Co A与奎尼酸合成绿原酸的功能。此外，他们又利用 转基因与RNAi技术分别将HQT基因高表达或将其表达沉默，研究结果表明高 表达HQT基因的烟草叶片绿原酸的含量比对照组相高出了 60%以上，而表达沉 默后的烟草叶中的绿原酸含量下降了 40%50%,在番茄实验中也得到了类似 的结果。此研究结果证明了 HQT基因的表达量与番茄、烟草等植物中绿原酸的 含量高低有直接关系。2010年，Peng等，开展了一系列针对金银花药材来源植物忍冬中HQT基 因与绿原酸之间的关系的研究工作。克隆得到了忍冬HQT基因的全长c DNA 序列，这是关于忍冬中HQT全长c DNA序列的首次报道，在大肠杆菌中对其进 行表达，并进行了功能鉴定，得到了与上述类似的结论,因此，足够多证据显 示通过HQT合成绿原酸可能是生物合成的主要途径。3万方数据内蒙古大学硕士学位论文123.2绿原酸的化学合成研究进展由于绿原酸的重要研究价值，研究人员对其化学的全合成过程进行了许多 尝试，但是由于绿原酸分子中的多个羟基和拨基及酯键的存在，使绿原酸的化 学合成具有极高的难度。最早的有关绿原酸的化学合成方法报道是在半个世纪 以前，但因未保护易水解基团，产率不到5%1998年J.C.Ro h lo ff报道了用丙酮与 2,2.甲氧基丙烷(DMP)的混合物可将奎宁酸转化为微量的AOH(8%),其结 构如图1.3叽图1.3 AOH分子结构Figure,1.3 T he molecular structure of AOH万方数据内蒙古大学硕士学位论文化合物AOH是1,7和4,5位被保护，只有3-位为游离羟基的奎宁酸二缩身 中间体。2001年，Selko w报道了先将奎宁酸用三甲基氯硅烷（MesSiCD转化 为五硅烷化奎宁酸，再在三甲硅烷基三氟甲鳗酸酯（TMSOTf）的低温催化下 和丙酮-DMP混合物反应得到高收率的AOHo化合物AOH再与乙酰咖啡酰氯 反应后去保护得到收率较好的绿原酸网。2008年，Ca nd ic e Meno zzi Sma rrito等 通过奎宁酸马龙酸酯与阿魏醛进Kno ev ena g el缩合反应，合成了 5-0-阿魏酰奎 宁酸，即3：0.甲基化绿原酸【四。.13绿原酸的生物活性13.1 抗氧化作用大量的国内外研究结果表明：绿原酸是一种有效的抗氧化剂，其抗氧化能 力优于常用抗氧化剂丁基轻基茵香酸（BHA）和生育酚，与丁基羟基甲苯（BHT）抗氧化能力相当3。同时，自由基和氧化应激被认为是引起衰老的原 因之一），活性氧是引起胰岛素抵抗的重要触发因素，所以抗氧化剂还可能用 于防治II型-糖尿病以外其它和胰岛素抵抗有关的疾病，如一些癌症和肥胖等RI,绿原酸及其类似物清除自由基的能力强于咖啡酸、抗坏血酸和生育酚，可有效 清除DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基等，因此，绿原酸被认为是 最具潜力的抗氧化剂。132抑制突变和抗肿痛作用绿原酸抑制突变能力较强，可以有效的抑制黄曲霉素B引发的突变，降低 Y-射线引起的骨髓红细胞突变；除此之外，绿原酸可以达到防癌、抗癌的效果，因其能够有效地降低致癌物在肝脏中的运输。绿原酸对肿瘤肝细胞有一定的抑制作用。实验结果表明：当绿原酸以及其 水解产物咖啡酸和奎尼酸同时作用于老鼠腹水肿瘤肝细胞AH109 A时，绿原酸 对该细胞入侵与增生时表现出了强力的抑制作用（在恶性肿瘤细胞的形成和扩 散中，肿瘤肝细胞的入侵、无限增生与转移是最关键的步骤），在浓度为 106mo i/L时，三种物质对AH109 A的抑制率分别为68%、36%、31%I23L万方数据内蒙古大学硕士学位论文1.3.3对 透明质酸酶与葡萄糖磷酸位移酶的抑制作用乙酰氨基葡萄糖和糠醛酸构成的透明质酸（HA）是一种常见于动物体内的 粘多糖，具有治愈创伤、润滑关节和调节血管壁的通透性等作用。而透明质酸 酹（HAa se）是一种能够水解透明质酸的酶，透明质酸分解后血管壁的通透性 变差，伤口愈合慢。而绿原酸有有效地抑制透明质酸酶（HAa se）的活性，从 而抑制透明质酸的分解。此外，绿原酸被证明是大鼠肝脏微粒体中葡萄糖磷 酸位移酶（Glc-&tra nsba se）的第一个天然特异性抑制剂，因此具有降低II型 糖尿病的肝糖排泄过快的药理作用口也1.3.4杭 菌、抗病毒等作用绿原酸对金黄葡萄球菌、溶血性链球菌、痢疾球菌、肺炎球菌、伤寒杆菌 等致病菌有显著的抑制和杀灭作用。在分析其作用机制时，一部分学者认为主 要是绿原酸金黄色葡萄球菌、枯草杆菌的生长与非竞争性抑制细菌体内的芳基 胺乙肽转移酶（NAT）有关於2叫动物在被细菌感染后，不仅是细菌本身的危 害，细菌所释放的毒素对机体的损伤可能更大。人们常常期待一个药物能同时 对抗细菌及内毒素。据叶星沈等人报道，绿原酸可有效地抑制肠黏膜微血管内 皮细胞内皮素（ET-1）的分泌和一氧化氮（NO）的比值升高，可以保护内毒素 作用下的肠黏膜微血管内皮细胞口纥此外，绿原酸还可以抑制葡萄球菌外毒素 引起的细胞因子和趋化因子的生成【划。绿原酸还具有抗病毒、增高白血球，缩短血凝和出血时间等作用。德国 Free大学E.Eic h教授在研究有些植物次生代谢物作为抗逆转录病毒剂机制时，认为绿原酸是有希望成为抗艾滋病毒（HIV）的先导化合物131135其它生物活性绿原酸可以作用于血清蛋白氨基酸链上的赖氨酸残基和色氨酸残基，并能 够引起蛋白质的进一步聚合，从而改变蛋白质的一些性质，如蛋白质的溶解性、亲水疏水性及等电点的变化13为娄红祥等将金银花水溶性部分成分经乙酰化后 万方数据内蒙古大学硕士学位论文分离得到四乙酰化绿原酸物，经药理实验证明，其对CC14损伤的小鼠肝有明显 的保护作用，这为阐明金银花具有保肝利胆的功效提供了理论依据印）。1.4 绿原酸的应用前景随着绿原酸的生物活性被人们重视程度的提升，其应用也越来越广泛，对 它的开发利用已经深入到食品、保健品、医药和日用化工等多个领域，具有良 好的应用前景。Hira za wa等人网将绿原酸用于鱼片的保鲜，发现其效果要优于茶叶提取物 和a-生育酸。绿原酸还可以有效防止果汁以及一些食品的腐败变质。Wilska等 人闽研究发现，绿原酸可以极大提高草莓等果汁稳定性。日本将从葵花籽粕中 提取的绿原酸成功开发成水溶性天然抗氧化剂。由金银花、杜仲、银杏叶等植 物资源开发出各种生物源性药物，对治疗动脉粥样硬化等疾病有显著疗效。Fa c ino等阈人研究发现，以绿原酸为代表的天然多酚物质，可以保护自由基、活性氧等伤害胶原蛋白，并可以有效防止紫外线对人体皮肤产生的伤害。现已 有多项添加绿原酸后用于抗脉酶化妆品、皮肤防晒霜和防止紫外线和染发剂对 头发损伤洗发水的欧洲专利。日本应用绿原酸及其衍生物抗氧化的特性已经研 制出了抗衰老护肤产品。绿原酸作为一种重要的生物活性物质，已经引起国内外学者的广泛关注。目前，绿原酸主要从天然植物中提取，国外（美、日、德等）大多是从咖啡豆 中提取，而我国一直是从金银花、杜仲等传统中药中提取。我国拥有丰富的富含绿原酸的植物资源，但对绿原酸的生物合成机制、药 理作用、提取、纯化、开发利用技术等方面的研究还不够深入。国内所需的绿 原酸纯品需从国外进口，而且价格十分昂贵BL因此，我们应该把握住我们的 优势，合理利用丰富的植物资源，加快工艺开发。7万方数据内蒙古大学硕士学位论文1.5 本课题研究意义绿原酸（5-0-咖啡酰-奎宁酸）分子中存在多个0H,其本身具有诸多良好 的生物活性。但是由于其很难通过细胞膜，不容窝被吸收，所以生物利用度很 低。而乙酰化是一种已经广泛应用于对多酚类化合物进行修饰的重要手段，乙 酰化作用不仅可以提高多酚类化合物的氧化稳定性，而且可以提高其亲脂能力，增加其与脂质细胞膜的亲和性。因此我们通过设想对绿原酸进行乙酰化的方法 进行修饰，增加其穿过磷脂双分子层的能力，来提高绿原酸的生物利用度。本 论文以绿原酸为原料，设计合成两种类型的乙酰化衍生物，其目的主要是将绿 原酸分子上羟基进行乙酰化及部分乙酰化，制备出不同的绿原酸乙酰化衍生物，并对其生物活性进行研究。8万方数据内蒙古大学硕士学位论文第二章五乙酰化绿原酸的合成及部分水解产物的制备2.1设计合成路线图L 4目标化合物设计合成路线Figure.1.4 T he biosynthetic pathway of chlorogenic acid首先将绿原酸在醋酸酎与毗咤体系中作催化乙酰化，合成出1,3,4,3/，-五乙 酰绿原酸。再通过酸、碱、酶三种水解手段对1,3,4,3；4，-五乙酰绿原酸进行不同 程度的水解，从而制备出1-乙酰绿原酸，1,3-二乙酰绿原酸，1,3,4三乙酰绿原 酸，1,3,43-四乙酰绿原酸四种绿原酸乙酰化物。9万方数据内蒙古大学硕士学位论文困2.1不同程度不同位置乙酰化绿原酸分子结构Figure.2.1 T he molecular structure of chlorogenic acidCompoundR.RjR4氐R42-coch3-H-H-H-H3-coch3-COCH3-H-H-H4-coch3-COCH3-coch3-H-H5-coch3-coch3-COCH3-COCH3-H6-coch3-COCH3-COCH3-coch3-COCH32.1 实验试剂与实验设备2.1.1 实验试剂表2.1实验试剂T able.2.1 Reagents名称级别生产厂家绿原酸试剂级SIGMA-AL ORICH四氢吠喃（T HF）分析纯国药集团化学试剂有限公司甲醇分析纯西陇化工股份有限公司醋酸酊分析纯国药集团化学试剂有限公司唯咤分析纯天津市化学试剂三厂浓盐酸分析纯国药集团化学试剂有限公司天津市风船碳酸钠分析纯化学试剂科技有限公司无水碳酸氢钠分析纯天津市盛奥化学试剂有限公司冰醋酸分析纯天津市红岩化学试剂厂核磁用笊代试剂色谱纯北大大北科技开发公司10万方数据内蒙古大学硕士学位论文2.1.2 实验设备表2.2实验仪器与设备T able.2.2 Instruments and Equipments名称规格和型号生产厂家HPL C-MS1290 Infity Series安捷伦科技,新加坡（国际）液相色谱柱ZORBAX SB-C18安捷伦科技,新加坡（国际）核磁共振仪Bruker Avance IIIspectrometer磁力搅拌器CL-200巩义市予华仪器责任有限公司电子天平T B-25丹佛仪器（北京）有限公司旋转蒸发仪SB-1200上海爱朗仪器有限公司循环式真空水泵SHB-m郑州长城科工贸有限公司ODS试剂级加拿大绿百草科技超声清洗器JP-020深圳洁盟清洗设备有限公司2.2 实验方法2.2.1 1,3,43,4：五乙酰绿原酸的合成（见合成路线1）合成路线1 1,3,4,3,4-五乙酰绿原酸的合成 Scheme 1 T he synthesis of 1,3,4,3,4-Pentaacetyl chlorogenic acid称取绿原酸（Co mpo und 1）2 g于装有磁力搅拌子的100 ml单口瓶中，再 向单口瓶中加入12 ml醋酸肝和12 ml毗咤，室温下（20）过夜搅拌反应，之 后TLC检测反应进程。待反应结束后，向反应液中加入30 ml冰水淬灭，用 2mo l/LHC1调反应液pH=2,此时反应液产生大量白色沉淀，之后用抽滤漏斗抽 滤得到白色沉淀，干燥，称重得白色粉末3.18 g。经HPLC-MS,NMR确认目 标化合物为白色粉末状1,3,43,4：五乙酰绿原酸（Co mpo und 6）,产率99.8%。11万方数据内蒙古大学硕士学位论文ESI-m=563 NMR(CDC13)：5 2.02(m,4H,H-2 a nd H-6),2.12(s,3H,COCH3),2.19(s,3H,COCH3),2.38(s,6H,2 x COCH3),2.80(s,3H,COCH3),6.3 1(d,人 16 Hz 1H,H-8),7.25(d,J=7.0 Hz,1H,H-5),7.35(d d,人2.5 7.0 Hz,1H,H-6),7.45(d d,J=2.5 Hz 1H,H-2),7.61(d,户 15.5 Hz,1H,H-7).”CNMR(CDCh)8 20.60 a nd 20.64 a nd 20.72 a nd 20.9 5 a nd 21.03(-5x COCH3),29.9(C-2),36.84(C-6),66.76(C-5),67.74(C-3),71.53(C-4),78.50(C-l),118.35(C-81),122.9 5(C-2r),124.01(C-5f),126.63(C-6r),132.9 5(C-l1),142.51(03)143.80(C4),143.9 8(C-71),16 5.39(C-9 -COO),167.9 4 a nd 168.71 a nd 169.82 a nd 169.9 2 a nd 170.13(-COCH3),173.63(C-7).2.2.2 1,3,4-三乙酰绿原酸的制备（见合成路线2）合成路线2 1,3,4三乙酰绿原酸的合成Scheme 2 T he synthesis of 1,3,4-triacetyl chlorogenic acid称取制备好的1,3,434-五乙酰绿原酸200 mg于50 ml装有磁力搅拌子的 单口瓶中，使其溶于2 ml甲醇与6 ml THF的混合溶剂中。之后将2ml溶有 200 mg Na 2c Ch的水溶液加入单口瓶中，TLC跟踪监控，室温(20)搅拌反 应lh 40 min,用抽滤漏斗滤除去反应生成的盐，滤液用冰醋酸调节pH=3,旋 转蒸发除去有机溶剂，经ODS柱层析分离纯化，洗脱液比例(MeOH:H2O=3:7)纯化得到目标产物，淡黄色固体20mg,产率14.7%。经HPLC-MS,NMR确 定结构为1,3,4-三乙酰绿原酸(Co mpo und。,ESI-m=479 H NMR(MeOD):8 2.02(m,4H,H-2 a nd H-6),2.12(s,3H,COCH3),2.19(s,3H,COCH3),2.38(s,3H COCH3),6.31(d,16 Hz 1H,H-8),7.25(d d,J=7.0 Hz,1H,H-5)7.35(d,2.5Hz,1H,H-2),7.45(d d,J=2.5,7.0 Hz,1H,H-6),7.61(d,J=15.5 Hz,1H,H-7)NMR(MeOD)5 19.29 a nd 19.57