外周血染色体标本制作.pptx

外周血染色体标本制作外周血染色体标本制作1/32一、染色体标本制备原理在细胞遗传学研究中，为了使细胞质透明，离解胞在细胞遗传学研究中，为了使细胞质透明，离解胞间层，使组织软化，且使染色体彼此铺展开而又能清楚地间层，使组织软化，且使染色体彼此铺展开而又能清楚地显示缢痕，往往需要对正在分裂或已经收获细胞作一系列显示缢痕，往往需要对正在分裂或已经收获细胞作一系列预处理。有时，在对细胞进行固定时候，为了使固定剂快预处理。有时，在对细胞进行固定时候，为了使固定剂快速渗透到组织中，方便于研究染色体特殊结构，也需要作速渗透到组织中，方便于研究染色体特殊结构，也需要作预处理；其目标是使细胞核外条件及染色体本身状态更适预处理；其目标是使细胞核外条件及染色体本身状态更适于分析和研究需要。在细胞培养（培养基中加有于分析和研究需要。在细胞培养（培养基中加有PHAPHA）后）后7272小时，合成小时，合成DNADNA细胞占总数细胞占总数4545，有丝分裂速率相当于，有丝分裂速率相当于每小时每小时1%1%，被激活淋巴细胞占总数，被激活淋巴细胞占总数90%90%，是收获分裂期，是收获分裂期细胞、制备染色体标本最正确时期。从收获到制片需经过细胞、制备染色体标本最正确时期。从收获到制片需经过加纺锤体抑制剂、低渗处理、固定、滴片等几个主要步骤，加纺锤体抑制剂、低渗处理、固定、滴片等几个主要步骤，现将各步骤原理、所用试剂及相关注意事项详述以下。现将各步骤原理、所用试剂及相关注意事项详述以下。外周血染色体标本制作2/321纺锤体抑制剂1.11.1基本原理和机制基本原理和机制使染色体散开并清楚地展现次缢痕，凭借原理是改变细胞使染色体散开并清楚地展现次缢痕，凭借原理是改变细胞质粘度。因为在细胞分裂时，伴随纺锤体形成，染色体紧质粘度。因为在细胞分裂时，伴随纺锤体形成，染色体紧靠在一起，极难进行分析。纺锤体形成取决于细胞质和纺靠在一起，极难进行分析。纺锤体形成取决于细胞质和纺锤体成份粘度之间平衡。所以，改变细胞质粘度就能破坏锤体成份粘度之间平衡。所以，改变细胞质粘度就能破坏纺锤体，使染色体依然呈游离状态，或者更确切地说，染纺锤体，使染色体依然呈游离状态，或者更确切地说，染色体不再粘附至细胞内任何结协力上。所以在随即制作标色体不再粘附至细胞内任何结协力上。所以在随即制作标本时一旦受到压力，染色体就很易铺展开来。同时，因为本时一旦受到压力，染色体就很易铺展开来。同时，因为染色体不一样区段上水合作用能力不一，当细胞质粘度发染色体不一样区段上水合作用能力不一，当细胞质粘度发生改变时，就会使缢痕区显示得更为清楚。生改变时，就会使缢痕区显示得更为清楚。外周血染色体标本制作3/321纺锤体抑制剂细胞分裂中纺锤体是由微管组成。微管管壁由细胞分裂中纺锤体是由微管组成。微管管壁由1313条条原丝纵向平行排列组成，主要成份为微管蛋白，而微管蛋原丝纵向平行排列组成，主要成份为微管蛋白，而微管蛋白分白分 微管蛋白和微管蛋白和 微管蛋白两种。微管蛋白两种。微管蛋白和微管蛋白和 微管蛋白微管蛋白组成异二聚体组成微管亚单位，若干个异二聚体相接连成组成异二聚体组成微管亚单位，若干个异二聚体相接连成原丝。原丝。微管蛋白与微管蛋白与 微管蛋白在化学结构上极为相同，二微管蛋白在化学结构上极为相同，二者者42%42%序列相同。其中序列相同。其中 微管蛋白肽链中第微管蛋白肽链中第201201位为半胱氨位为半胱氨酸，为秋水仙素结合部位。假如结合部位被其结合，微管酸，为秋水仙素结合部位。假如结合部位被其结合，微管不但不能继续聚合，而且会引发原有微管解聚。不但不能继续聚合，而且会引发原有微管解聚。外周血染色体标本制作4/321纺锤体抑制剂故秋水仙素含有干扰微管装配，破坏纺锤体形成和故秋水仙素含有干扰微管装配，破坏纺锤体形成和终止细胞分裂作用。以秋水仙素为代表纺锤体抑制剂能引终止细胞分裂作用。以秋水仙素为代表纺锤体抑制剂能引发有丝分裂过程中纺锤丝断裂或抑制纺锤体形成，但不影发有丝分裂过程中纺锤丝断裂或抑制纺锤体形成，但不影响染色体复制和着丝粒分裂使正在分裂细胞停留在中期，响染色体复制和着丝粒分裂使正在分裂细胞停留在中期，以取得大量分裂相供分析之用。秋水仙素积累分裂中期作以取得大量分裂相供分析之用。秋水仙素积累分裂中期作用，几乎对全部植物器官和许多动物器官都是十分有效。用，几乎对全部植物器官和许多动物器官都是十分有效。外周血染色体标本制作5/321纺锤体抑制剂1.21.2主要纺锤体抑制剂及其作用特点主要纺锤体抑制剂及其作用特点 秋水仙素秋水仙素秋水仙素（秋水仙素（colchicinecolchicine）是一个生物碱，因最初从百合科植）是一个生物碱，因最初从百合科植物秋水仙（物秋水仙（ColchicumautumnaleColchicumautumnale）中提取出来，故名。）中提取出来，故名。分子式分子式C22H25O6NC22H25O6N。纯秋水仙素呈黄色针状结晶，熔点。纯秋水仙素呈黄色针状结晶，熔点157157。易溶于水、乙醇和氯仿，难溶于热水、乙醚等。易溶于水、乙醇和氯仿，难溶于热水、乙醚等。味苦，有毒。秋水仙素能抑制有丝分裂，破坏纺锤体，使味苦，有毒。秋水仙素能抑制有丝分裂，破坏纺锤体，使染色体停滞在分裂中期。这种由秋水仙素引发不正常分裂，染色体停滞在分裂中期。这种由秋水仙素引发不正常分裂，称为秋水仙素有丝分裂（称为秋水仙素有丝分裂（C-mitosisC-mitosis）。在这么有丝分裂中，）。在这么有丝分裂中，染色体即使纵裂，但细胞不分裂，不能形成两个子细胞，染色体即使纵裂，但细胞不分裂，不能形成两个子细胞，因而使染色体加倍。因而使染色体加倍。外周血染色体标本制作6/321纺锤体抑制剂秋水仙素作用与其浓度和作用时间相关，在高浓度时秋水仙素作用与其浓度和作用时间相关，在高浓度时能够延缓着丝点分裂，低浓度时则抑制细胞纺锤体形成。能够延缓着丝点分裂，低浓度时则抑制细胞纺锤体形成。在秋水仙素作用下，染色单体缩短，着色变深以致外形在秋水仙素作用下，染色单体缩短，着色变深以致外形清楚。但不一样染色体缩短程度不一，长染色体比短染色清楚。但不一样染色体缩短程度不一，长染色体比短染色体浓缩得更显著些。从能搜集到足够中期细胞考虑，秋水体浓缩得更显著些。从能搜集到足够中期细胞考虑，秋水仙素处理时间宜长些，所用浓度宜高些；但从能得到较为仙素处理时间宜长些，所用浓度宜高些；但从能得到较为细长染色体考虑，处理时间宜短，所用浓度宜低。因而秋细长染色体考虑，处理时间宜短，所用浓度宜低。因而秋水仙素处理方法应同时兼顾这二个方面。假如处理时间太水仙素处理方法应同时兼顾这二个方面。假如处理时间太短则标本中分裂细胞就少；与此相反，假如处理时间太长短则标本中分裂细胞就少；与此相反，假如处理时间太长分裂细胞虽多，但染色体缩得太短，以致形态含糊，就难分裂细胞虽多，但染色体缩得太短，以致形态含糊，就难以取得优良显带标本。以取得优良显带标本。外周血染色体标本制作7/321纺锤体抑制剂与其它预处理化学物相比较秋水仙素另一个优点是，在广与其它预处理化学物相比较秋水仙素另一个优点是，在广泛温度范围内都是有活性。在热带地域夏季，那怕气温高泛温度范围内都是有活性。在热带地域夏季，那怕气温高达达43.343.3，对秋水仙素活性也无显著影响，有些人将秋水，对秋水仙素活性也无显著影响，有些人将秋水仙素加入保留在仙素加入保留在8989组织中，发觉中期细胞数目比保留组织中，发觉中期细胞数目比保留在室温但未加秋水仙素组织要多得多，而且染色体结构也在室温但未加秋水仙素组织要多得多，而且染色体结构也很清楚。很清楚。乙酰甲基秋水仙碱是人工合成秋水仙素衍生物。它功效跟乙酰甲基秋水仙碱是人工合成秋水仙素衍生物。它功效跟秋水仙素一样但对细胞毒害作用只有秋水仙素秋水仙素一样但对细胞毒害作用只有秋水仙素1 13030一一1 14040。4610-64610-6浓度即可得到所希望效应。浓度即可得到所希望效应。除了秋水仙素以外，另一些化学物也可作为纺锤体抑制剂。除了秋水仙素以外，另一些化学物也可作为纺锤体抑制剂。如三氯乙醛水合物、六六六、硫酸长春花碱等，它们在人如三氯乙醛水合物、六六六、硫酸长春花碱等，它们在人体细胞均可产生良好效果。体细胞均可产生良好效果。外周血染色体标本制作8/321纺锤体抑制剂1.31.3处理过程处理过程培养终止前在培养基中加入浓度为培养终止前在培养基中加入浓度为20g/ml20g/ml秋水仙素秋水仙素0.050.1ml0.050.1ml（1ml1ml注射器滴垂直注射器滴垂直3-53-5滴）使其最终浓度为滴）使其最终浓度为0.40.8g/ml0.40.8g/ml，置，置5%CO25%CO2、37C0.5C37C0.5C培养箱中处理培养箱中处理24h24h。外周血染色体标本制作9/321纺锤体抑制剂 1.41.4注意事项注意事项应该注意是经秋水仙素处理后细胞虽可用各种不一应该注意是经秋水仙素处理后细胞虽可用各种不一样固定液样固定液(金属固定液或非金属固定液金属固定液或非金属固定液)给予固定，但一定给予固定，但一定要在固定之前把秋水仙素从组织或细胞上冲洗掉，不然沉要在固定之前把秋水仙素从组织或细胞上冲洗掉，不然沉积在细胞表面秋水仙素不但会影响染色体形态，而且还会积在细胞表面秋水仙素不但会影响染色体形态，而且还会妨碍固定液穿透性。为此，在低渗处理后，应尽早地加紧妨碍固定液穿透性。为此，在低渗处理后，应尽早地加紧速穿透液，如甲醇速穿透液，如甲醇冰醋酸固定液。要不然在固定时候，冰醋酸固定液。要不然在固定时候，细胞核仍可能进入代谢期。细胞核仍可能进入代谢期。外周血染色体标本制作10/322低渗溶液经过秋水仙素处理后，细胞内染色体比较适合于观经过秋水仙素处理后，细胞内染色体比较适合于观察了，但还是不能满足要求。因为人类细胞染色体数目多，察了，但还是不能满足要求。因为人类细胞染色体数目多，形状小，最大染色体约形状小，最大染色体约7878微米，加之主要观察与分析均微米，加之主要观察与分析均在油镜下进行，这就要求标本中染色体彼此散开，而且尽在油镜下进行，这就要求标本中染色体彼此散开，而且尽可能处于同一平面上。这些都有赖于低渗处理。可能处于同一平面上。这些都有赖于低渗处理。外周血染色体标本制作11/322低渗溶液2.12.1基本原理和机制基本原理和机制 19651965徐道觉发觉未作低渗处理时，伴随染色体一些徐道觉发觉未作低渗处理时，伴随染色体一些零乱物质类似于核糖核蛋白体颗粒，显然是有丝分裂中核零乱物质类似于核糖核蛋白体颗粒，显然是有丝分裂中核仁瓦解时残余物。而低渗处理后，这些物质就消失了。可仁瓦解时残余物。而低渗处理后，这些物质就消失了。可见，低渗处理不只是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺见，低渗处理不只是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，而且还可使粘附于染色体核仁物质散开，这么就能看展，而且还可使粘附于染色体核仁物质散开，这么就能看清楚每一个扭曲染色体。现在知道，覆盖在染色体上核仁清楚每一个扭曲染色体。现在知道，覆盖在染色体上核仁物质大大地妨碍着染色体分散。物质大大地妨碍着染色体分散。外周血染色体标本制作12/322低渗溶液2.22.2主要低渗液主要低渗液 低渗溶液是指渗透压和离子强度均低溶液。能够是水、低低渗溶液是指渗透压和离子强度均低溶液。能够是水、低渗柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾渗柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾(0.65mol(0.65molL)L)、氯化钾、氯化钾(0.075mol(0.075molL)L)、稀释平衡盐溶液或培养基。处理时间普、稀释平衡盐溶液或培养基。处理时间普通为通为840840分钟，处理时温度为分钟，处理时温度为23372337。在早期一些研究中，大多用柠檬酸钠或柠檬酸钾作为低渗在早期一些研究中，大多用柠檬酸钠或柠檬酸钾作为低渗液。也有些学者主张用稀释人血清，认为这么可使染色体液。也有些学者主张用稀释人血清，认为这么可使染色体形态特征更为清楚。自形态特征更为清楚。自19651965年后，人们改用年后，人们改用KClKCl为低渗掖。为低渗掖。其优点是染色体轮廓清楚，可染色性增强，染色时间短。其优点是染色体轮廓清楚，可染色性增强，染色时间短。在相差显微镜下观察在相差显微镜下观察KClKCl低渗处理标本效果比其它低渗低渗处理标本效果比其它低渗液更加好些，也适合于显微分光光度分析，当用显带染色液更加好些，也适合于显微分光光度分析，当用显带染色时能充分显示带型特点。时能充分显示带型特点。KClKCl浓度以浓度以0.075mol0.075molL L为宜，但为宜，但不一样组织所需处理时间未必相同。不一样组织所需处理时间未必相同。外周血染色体标本制作13/322低渗溶液2.32.3低渗处理过程低渗处理过程秋水仙素处理秋水仙素处理2-42-4小时后，小心地从温箱取出培养瓶，小时后，小心地从温箱取出培养瓶，用滴管将培养液转移到用滴管将培养液转移到10ml10ml离心管并置离心机内离心，转离心管并置离心机内离心，转速为速为1500rpm1500rpm，离心，离心10min10min。离心后用滴管吸弃上清液，。离心后用滴管吸弃上清液，培养物沉积在管底。然后加入培养物沉积在管底。然后加入3737温育低渗液温育低渗液8 8毫升，用滴毫升，用滴管吹打成单个细胞悬液，置管吹打成单个细胞悬液，置37C37C水浴处理水浴处理20-30min20-30min，使，使红细胞破碎，白细胞膨胀。红细胞破碎，白细胞膨胀。外周血染色体标本制作14/322低渗溶液2.42.4影响低渗效果原因影响低渗效果原因 影响低渗处理效果是以下三个原因：低渗溶液化学影响低渗处理效果是以下三个原因：低渗溶液化学组成、低渗强度和处理时间。处理时间太短则染色体铺展组成、低渗强度和处理时间。处理时间太短则染色体铺展不好，处理时间过长会引发细胞破裂甚至因为染色体胀得不好，处理时间过长会引发细胞破裂甚至因为染色体胀得太大而致形态结构含糊。所以，在实际操作中，对某一个太大而致形态结构含糊。所以，在实际操作中，对某一个组织终究应选取哪一个低渗溶液，需事先进行预试验。组织终究应选取哪一个低渗溶液，需事先进行预试验。外周血染色体标本制作15/323固定固定是组织、细胞或其成份选择性地固定于某一特固定是组织、细胞或其成份选择性地固定于某一特定阶段过程。其目标是杀死细胞但又要防止所研究成份受定阶段过程。其目标是杀死细胞但又要防止所研究成份受到破坏。到破坏。不一样物种对固定剂反应是不一，哺乳类动物染色不一样物种对固定剂反应是不一，哺乳类动物染色体固定尤其需要特定方法，这是因为每种生物细胞质成份体固定尤其需要特定方法，这是因为每种生物细胞质成份彼此各异缘故。生物类型本身复杂性及多细胞生物中细胞彼此各异缘故。生物类型本身复杂性及多细胞生物中细胞内改变较大，以致极难在细胞水平上分析固定效应。内改变较大，以致极难在细胞水平上分析固定效应。外周血染色体标本制作16/323固定3.13.1基本原理与机制基本原理与机制用于固定化学物对细胞都含有杀死作用，这类化学物可分用于固定化学物对细胞都含有杀死作用，这类化学物可分成二大类：一类能使染色体固缩，或使核酸和蛋白质纤丝成二大类：一类能使染色体固缩，或使核酸和蛋白质纤丝相脱离，另一类则可维持染色体结构完整性。相脱离，另一类则可维持染色体结构完整性。为使染色体结构不受破坏，提升染色体可见性及嗜碱性，为使染色体结构不受破坏，提升染色体可见性及嗜碱性，就需要使染色质物质沉淀。在活体条件下，细胞内不一样就需要使染色质物质沉淀。在活体条件下，细胞内不一样成份之间相差并不足以使它们成为一个显著单位。可是伴成份之间相差并不足以使它们成为一个显著单位。可是伴随蛋白质凝结和沉淀，染色体折射系数将发生很大改变从随蛋白质凝结和沉淀，染色体折射系数将发生很大改变从而使它们在细胞内成为显著小体。正因为如此，迄今所用而使它们在细胞内成为显著小体。正因为如此，迄今所用固定剂都含有交链蛋白质特征，都能使染色质沉淀。尽管固定剂都含有交链蛋白质特征，都能使染色质沉淀。尽管惯用染色体固定剂往往是数种化学物混合物，但其中最少惯用染色体固定剂往往是数种化学物混合物，但其中最少有一个化学物必须具备这一特征。有一个化学物必须具备这一特征。外周血染色体标本制作17/323固定固定剂另一主要特征是能快速地穿透组织或细胞，固定剂另一主要特征是能快速地穿透组织或细胞，并在并在瞬间内杀死它们，这么方能使正在分裂细胞马上阻瞬间内杀死它们，这么方能使正在分裂细胞马上阻留在各自时相上。瞬间杀死是很主要，不然核分裂仍可继留在各自时相上。瞬间杀死是很主要，不然核分裂仍可继续下去并抵达所谓续下去并抵达所谓“休止相休止相”或或“代谢相代谢相”，那就无从研，那就无从研究染色体了。究染色体了。外周血染色体标本制作18/323固定可是，伴随细胞死亡而出现另一些改变可是，伴随细胞死亡而出现另一些改变(尤其是蛋尤其是蛋白质自溶作用白质自溶作用)，往往会破坏染色体原来结构。在正常情，往往会破坏染色体原来结构。在正常情况下，细胞内酶参加蛋白质合成，而当细胞死亡时，因为况下，细胞内酶参加蛋白质合成，而当细胞死亡时，因为介质变为酸性，这些酶便在相反方向起作用，即使复合蛋介质变为酸性，这些酶便在相反方向起作用，即使复合蛋白质裂解为简单氨基酸。因为多肽是染色体主要成份之一，白质裂解为简单氨基酸。因为多肽是染色体主要成份之一，所以这种变性效应最终将引发染色体结构破坏。所以，作所以这种变性效应最终将引发染色体结构破坏。所以，作为一个固定剂也应能预防蛋白质自溶作用。另外，在细胞为一个固定剂也应能预防蛋白质自溶作用。另外，在细胞致死同时，细菌活动致使细胞内成份分解。所以一个好固致死同时，细菌活动致使细胞内成份分解。所以一个好固定剂应该既能起到防腐作用，又能阻止细菌分解作用。定剂应该既能起到防腐作用，又能阻止细菌分解作用。外周血染色体标本制作19/323固定最终，理想固定剂还应能有利于到达优良染色效果，即能最终，理想固定剂还应能有利于到达优良染色效果，即能增强染色体嗜碱性。比如，甲醛虽含有优良固定剂其它全增强染色体嗜碱性。比如，甲醛虽含有优良固定剂其它全部特征，但却会降低染色体嗜碱性，所以不能单独用作染部特征，但却会降低染色体嗜碱性，所以不能单独用作染色体固定剂。色体固定剂。显而易见，没有哪一个化学物能同时具备以上这些条件，显而易见，没有哪一个化学物能同时具备以上这些条件，因而通常是将数种能够共存液体混合起来，使之成为染色因而通常是将数种能够共存液体混合起来，使之成为染色体研究中真正有效固定剂。尽管如此，那怕是最正确固定体研究中真正有效固定剂。尽管如此，那怕是最正确固定剂仍难免有不足之处。首先，细胞被杀死后发生基本改变剂仍难免有不足之处。首先，细胞被杀死后发生基本改变极难给予防止；其次，可能会抽提出一些弥散成份；最终极难给予防止；其次，可能会抽提出一些弥散成份；最终即使操作十分慎重，仍难以保持酶活性不变；另外，一些即使操作十分慎重，仍难以保持酶活性不变；另外，一些化学物还会造成细胞皱缩。化学物还会造成细胞皱缩。外周血染色体标本制作20/323固定细胞膨胀和染色体皱缩是决定固定剂质量两个主要细胞膨胀和染色体皱缩是决定固定剂质量两个主要原因。以往曾认为渗透压是促使细胞内结构膨胀或破坏决原因。以往曾认为渗透压是促使细胞内结构膨胀或破坏决定性因索，为此选取等渗液作为固定剂，其实这种看法是定性因索，为此选取等渗液作为固定剂，其实这种看法是不正确。事实证实，稀释醋酸含有不正确。事实证实，稀释醋酸含有2020个大气压，照常可使个大气压，照常可使细胞和组织膨胀，而只有细胞和组织膨胀，而只有2.52.5个大气压苦味酸却可使组织个大气压苦味酸却可使组织大大地收缩。这提醒一个固定剂效果怎样与渗透压关系很大大地收缩。这提醒一个固定剂效果怎样与渗透压关系很小。另首先，苦味酸使蛋白质沉淀作用很强而醋酸却没有小。另首先，苦味酸使蛋白质沉淀作用很强而醋酸却没有这一作用。可见，使蛋白质沉淀这一特征在造成染色体收这一作用。可见，使蛋白质沉淀这一特征在造成染色体收缩方面可能起主要作用。所以，在选取哪些化学物作为固缩方面可能起主要作用。所以，在选取哪些化学物作为固定剂时，需要权衡以上这些原因。定剂时，需要权衡以上这些原因。外周血染色体标本制作21/323固定用作固定剂化学物有非金属和金属两类。前者如乙醇，甲用作固定剂化学物有非金属和金属两类。前者如乙醇，甲醇、醋酸、甲醛、丙酸、苦味酸和氯仿等。后者如铬酸、醇、醋酸、甲醛、丙酸、苦味酸和氯仿等。后者如铬酸、锇酸、氯化铂、氯化汞、硝酸铀等。其中有几个化学物还锇酸、氯化铂、氯化汞、硝酸铀等。其中有几个化学物还可作为蒸气固定剂，也即在接触水或其它溶剂之前使可溶可作为蒸气固定剂，也即在接触水或其它溶剂之前使可溶性物质先转变为不溶性物质，这么就可在原位制作标本。性物质先转变为不溶性物质，这么就可在原位制作标本。在细胞化学研究上，大多数非金属固定剂在细胞化学研究上，大多数非金属固定剂(除甲醛外除甲醛外)比之比之于金属固定剂有一优点是，在固定之后无需在水中冲洗标于金属固定剂有一优点是，在固定之后无需在水中冲洗标本。本。外周血染色体标本制作22/323固定3.23.2固定液种类固定液种类 醋酸醋酸作为混合固定液一个成份，醋酸优点在于：（作为混合固定液一个成份，醋酸优点在于：（1 1）能够与）能够与已知任何一个固定剂同时使用，而且能够和任意百分比水、已知任何一个固定剂同时使用，而且能够和任意百分比水、乙醇或甲醇混合；（乙醇或甲醇混合；（2 2）浓度能够很低（）浓度能够很低（1%1%）也能够很高）也能够很高（99%99%）；（）；（3 3）含有很强穿透性能，比乙醇穿透性还高。）含有很强穿透性能，比乙醇穿透性还高。醋酸能使核酸沉淀使组蛋白溶解，但却不能固定细胞质蛋醋酸能使核酸沉淀使组蛋白溶解，但却不能固定细胞质蛋白。在染色体结构研究中，醋酸主要用途是阻止染色体收白。在染色体结构研究中，醋酸主要用途是阻止染色体收缩，使染色体结构免于被破坏。经醋酸固定物质还能抵销缩，使染色体结构免于被破坏。经醋酸固定物质还能抵销乙醇硬化作用。乙醇硬化作用。外周血染色体标本制作23/323固定醋酸是染色体一个理想固定剂，它可使染色体结构保持完醋酸是染色体一个理想固定剂，它可使染色体结构保持完整，且多半不致破坏核蛋白。这种固定剂一个缺点是会造整，且多半不致破坏核蛋白。这种固定剂一个缺点是会造成染色体片段过分膨胀，所以假如要研究染色体详细结构，成染色体片段过分膨胀，所以假如要研究染色体详细结构，必须把它与乙醇或类似化学物一道使用，后者能使组织收必须把它与乙醇或类似化学物一道使用，后者能使组织收缩和硬化。在研究减数分裂染色体时，假如目标是了解染缩和硬化。在研究减数分裂染色体时，假如目标是了解染色体行为，而不是其结构细节，用醋酸作为固定剂当然是色体行为，而不是其结构细节，用醋酸作为固定剂当然是十分恰当。在分析粗线期染色体时要求染色体细节清楚，十分恰当。在分析粗线期染色体时要求染色体细节清楚，醋酸也不愧是一个理想固定剂。醋酸也不愧是一个理想固定剂。另外，醋酸还是苯胺类染料一个优良溶剂。正因为含有这另外，醋酸还是苯胺类染料一个优良溶剂。正因为含有这一特征，它是染料和固定液混合物中必需一个成份，比如一特征，它是染料和固定液混合物中必需一个成份，比如醋酸醋酸洋红、醋酸洋红、醋酸奥辛和醋酸奥辛和醋酸间苯二酚蓝等。间苯二酚蓝等。外周血染色体标本制作24/323固定甲醇甲醇在植物染色体研究中极少应用，可是却广泛地用于动物染在植物染色体研究中极少应用，可是却广泛地用于动物染色体固定。甲醇是从木材分解蒸馏制得，是焦木酸一个成色体固定。甲醇是从木材分解蒸馏制得，是焦木酸一个成份。即使乙醇会使染色体收缩得很厉害，而甲醇却可使染份。即使乙醇会使染色体收缩得很厉害，而甲醇却可使染色体膨胀。在制备固定液时往往需要一个膨胀剂以赔偿另色体膨胀。在制备固定液时往往需要一个膨胀剂以赔偿另一些化学品收缩效应，所以甲醇这一特征是非常有用。它一些化学品收缩效应，所以甲醇这一特征是非常有用。它有效浓度为有效浓度为7070至至100100。它是一个无色有毒液体且能够。它是一个无色有毒液体且能够任何百分比与水混合。但不能与氧化剂一道，不然很快会任何百分比与水混合。但不能与氧化剂一道，不然很快会氧化成甲酸。氧化成甲酸。外周血染色体标本制作25/323固定乙醇乙醇广泛地用作染色体固定剂一个成份。它有效浓度与甲醇一广泛地用作染色体固定剂一个成份。它有效浓度与甲醇一样。乙醇有一个最主要优点是能快速地穿透人组织。它能样。乙醇有一个最主要优点是能快速地穿透人组织。它能够沉淀蛋白质，还含有脱水性可使蛋白质出现不可逆转够沉淀蛋白质，还含有脱水性可使蛋白质出现不可逆转变性，还能使组织硬化。变性，还能使组织硬化。作为一个还原剂，在有氧化剂存在时乙醇会很快被氧化为作为一个还原剂，在有氧化剂存在时乙醇会很快被氧化为乙酸。所以它不能与许多金属固定剂乙酸。所以它不能与许多金属固定剂(铬酸或四氯化锇铬酸或四氯化锇)相相混用。乙醇不能有效地固定染色质，标准上不能与醋酸、混用。乙醇不能有效地固定染色质，标准上不能与醋酸、甲醛或氯仿混合使用。可是冷乙醇固定法往往能保留一些甲醛或氯仿混合使用。可是冷乙醇固定法往往能保留一些酶，因为酶反应基团酶，因为酶反应基团般是不受它破坏。在对染色体酶进般是不受它破坏。在对染色体酶进行研究时，宜用行研究时，宜用8080冷乙醇固定冷乙醇固定1 1小时或更多时间；如用小时或更多时间；如用于单层培养物，往往以纯乙醇或于单层培养物，往往以纯乙醇或9595乙醇固定乙醇固定1-151-15分钟为分钟为宜。宜。外周血染色体标本制作26/323固定卡诺固定液。卡诺固定液。卡诺固定液由卡诺固定液由1 1份冰醋酸和份冰醋酸和3 3份甲醇或乙醇混合而成。这种份甲醇或乙醇混合而成。这种固定液适合用于全部动植物和人类染色体固定。固定时间固定液适合用于全部动植物和人类染色体固定。固定时间为为1515分钟到二十四小时，温度为室温或稍冷。必要时能够分钟到二十四小时，温度为室温或稍冷。必要时能够改变酸和醇百分比，比如改成改变酸和醇百分比，比如改成1:21:2或或1:41:4等。伴随醋酸百分等。伴随醋酸百分比增高，固定液膨胀效能加大，有利于染色体铺展；不过比增高，固定液膨胀效能加大，有利于染色体铺展；不过假如控制不妥则会造成细胞破碎，反而不利于分析。假如控制不妥则会造成细胞破碎，反而不利于分析。卡诺固定液一个缺点是经这种方式固定组织不能被许多碱卡诺固定液一个缺点是经这种方式固定组织不能被许多碱性染料水溶液染上色，除非用一些特殊媒染剂。这是因为性染料水溶液染上色，除非用一些特殊媒染剂。这是因为固定液中缺乏有利于染色体嗜碱性金属成份。固定液中缺乏有利于染色体嗜碱性金属成份。外周血染色体标本制作27/323固定3.33.3固定过程固定过程预固定：低渗预固定：低渗3030分钟后，在离心管中加入分钟后，在离心管中加入1 1滴管约滴管约2ml2ml卡诺卡诺固定液，并将其混和均匀，使之与细胞充分接触。继续水固定液，并将其混和均匀，使之与细胞充分接触。继续水浴浴5 5分钟左右。离心，分钟左右。离心，1500rpm1500rpm，10min10min，弃上清液。，弃上清液。再固定：在离心管中加入加入固定液再固定：在离心管中加入加入固定液6-86-8毫升，用吸管轻毫升，用吸管轻轻打散管底细胞，使之与细胞充分接触，再次离心，轻打散管底细胞，使之与细胞充分接触，再次离心，1500rpm1500rpm，10min10min，弃上清液。并重复上述操作一次。，弃上清液。并重复上述操作一次。外周血染色体标本制作28/324制片气干法气干法固定完成后就进入制片阶段。早期人们多采取挤压法，以固定完成后就进入制片阶段。早期人们多采取挤压法，以后则很快被气干法取代。现今这一技术在哺乳类和人类细后则很快被气干法取代。现今这一技术在哺乳类和人类细胞遗传学中得到了广泛应用，以致挤压法已几乎为人们所胞遗传学中得到了广泛应用，以致挤压法已几乎为人们所忘却。忘却。气干法主要用于那些轻易做成细胞悬液组织比如骨髓、外气干法主要用于那些轻易做成细胞悬液组织比如骨髓、外周血淋巴细胞，腹水和生殖上皮细胞。经过体外培养技术周血淋巴细胞，腹水和生殖上皮细胞。经过体外培养技术可使组织块生长成单层细胞，或者经酶解而变成细胞悬液。可使组织块生长成单层细胞，或者经酶解而变成细胞悬液。一旦制成细胞悬液就可进行预处理和固定，然后作气干法一旦制成细胞悬液就可进行预处理和固定，然后作气干法制片。制片。外周血染色体标本制作29/324制片制片过程制片过程已固定细胞悬液离心，倒去大部分上清液，使管底小量固已固定细胞悬液离心，倒去大部分上清液，使管底小量固定液中悬浮着大量细胞。清洁载玻片事先应置于冷二蒸水定液中悬浮着大量细胞。清洁载玻片事先应置于冷二蒸水或纯酒精中。用时以清洁镊子夹取载玻片置于垫板之上，或纯酒精中。用时以清洁镊子夹取载玻片置于垫板之上，载玻片与垫板应成一定角度（约载玻片与垫板应成一定角度（约10151015度）。用吸管吸收度）。用吸管吸收数滴细胞悬液滴在载玻片上。这么滴上细胞悬液可顺着湿数滴细胞悬液滴在载玻片上。这么滴上细胞悬液可顺着湿表面自上而下流散开来。滴片完成后将垫板连同载玻片放表面自上而下流散开来。滴片完成后将垫板连同载玻片放入入7575烤箱，烤片烤箱，烤片3 3小时，使固定液挥发。气干法制片比小时，使固定液挥发。气干法制片比挤压法省事，效果也很好。在一个载玻片上，大约挤压法省事，效果也很好。在一个载玻片上，大约2 23 3面面积就足以容纳积就足以容纳0.20.2毫升全血培养物中全部细胞。由此制得毫升全血培养物中全部细胞。由此制得标本细胞密度较高，适于观察与分析。标本细胞密度较高，适于观察与分析。外周血染色体标本制作30/325.结果分析外周血染色体标本制作31/32外周血染色体标本制作32/32