DB37_T 4595—2023地表水浮游蓝藻监测技术规范.docx

ICS13.060.01CCSZ 2237 山东省地方标准DB37/T 45952023地表水浮游蓝藻监测技术规范Technical specifications for monitoring planktonic cyanobacteria in surface water2023 - 04 - 16 发布2023 - 05 - 16 实施山东省市场监督管理局发 布目次前言II1 范围12 规范性引用文件13 术语和定义14 样品采集14.1 采样设备14.2 采样点位布设24.3 采样频次与时间24.4 采样方法24.5 样品标识25 样品处理与保存35.1 样品处理35.2 样品保存36 蓝藻种属鉴定及密度分析36.1 基本流程36.2 实验室仪器设备36.3 实验室预处理36.4 显微镜校准36.5 玻片标本制备36.6 蓝藻种属鉴定及优势属（种）确定46.7 蓝藻密度分析47 质量保证和质量控制67.1 样品采集质量保证与质量控制67.2 实验室质量保证与质量控制7附录 A（资料性） 蓝藻样品采样表8附录 B（规范性） 蓝藻鉴定及计数流程图9附录 C（资料性） 蓝藻鉴定记录表10附录 D（资料性） 藻种鉴定书目11附录 E（资料性） 藻种鉴定书目中未包括的蓝藻种形态特征及图谱12E.1 伪鱼腥藻属（Pseudanabaena Komrek 1992）12E.2 拟柱孢藻属 (Cylindrospermopsis Ktz 1843）12参考文献14前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由山东省生态环境厅提出并组织实施。 本文件由山东省环保标准化技术委员会归口。 地表水浮游蓝藻监测技术规范1 范围本文件规定了地表水浮游蓝藻监测的术语和定义、样品采集、样品处理与保存、蓝藻种属鉴定及密度分析、质量保证和质量控制等技术要求。 本文件适用于河流、湖泊、水库等水体中浮游蓝藻的监测。 2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 14581 水质 湖泊和水库采样技术指导HJ/T 91 地表水和污水监测技术规范 HJ 493 水质 样品的保存和管理技术规定 3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。 3.1浮游藻类 phytoplankton在水中营浮游生活的藻类，包括蓝藻门、绿藻门、硅藻门、金藻门、黄藻门、甲藻门、隐藻门和裸藻门等。 来源：SL 7332016，3.1，有修改 3.2浮游蓝藻 planktonic cyanobacteria在水中营浮游生活的蓝藻门藻类，含有叶绿素、能够进行光合作用、呈革兰氏阴性。 来源：中国淡水藻类系统、分类及生态，第二章，有修改 3.3蓝藻密度 cyanobacterial density单位体积中蓝藻门藻类的数量，单位为cells/L。 来源：SL 7332016，3.3，有修改 3.4优势蓝藻属（种） dominant genus (species) of cyanobacteria在浮游藻类群落中数量占比大于15 %的蓝藻属（种）。来源：SL 7332016，3.2，有修改 4 样品采集4.1 采样设备4.1.1 闭管式采样器：应符合 GB/T 14581 的要求。 4.1.2 杆式采样器：将闭管式采样器放置于可伸展的 1.5 m2 m 的长杆末端。 4.1.3 具刻度棕色磨口玻璃瓶：1 L。 4.1.4 溶解氧仪：HJ 506。 4.1.5 pH 计：HJ 1147。 4.1.6 浊度仪：HJ 1075。 4.1.7 温度计：GB/T 13195。 4.1.8 塞氏盘：20 cm，黑白色相间，配重锤及带刻度的绳索等。 4.1.9 定位系统。 4.1.10 照相机。 4.2 采样点位布设4.2.1 采样点位的设置与确定按照 GB/T 14581 和 HJ/T 91 的相关规定执行，与水质监测一致。 4.2.2 采样点位应能代表整个水体，能反映调查水域蓝藻的实际情况。 4.2.3 应保持采样点位的长期一致。 4.2.4 当蓝藻沿岸边积聚形成浮渣时，应在浮渣积聚处设置采样点。 4.3 采样频次与时间4.3.1 采样频次应与水质监测同步。 4.3.2 常规监测的采样频次按照 GB/T 14581 和 HJ/T 91 的相关规定执行。也可根据监测目的确定：每月采样 1 次；每季度采样 1 次；丰水期、平水期和枯水期各采样 1 次。 4.3.3 当水体蓝藻密度大于 200 万 cells/L 时，应增加采样监测频次。 4.3.4 同一点位的采样应在相同时段进行，并记录采样时间。 4.4 采样方法4.4.1 船只采样适用于河流、湖泊和水库水体较深区域。应用闭管式采样器进行采样。 4.4.2 岸线采样适用于河流、湖泊和水库沿岸带。应用杆式采样器进行采样。 4.4.3 桥梁采样适用于有桥梁的监测断面。采样时应将绳子一端系在闭管式采样器上，另一端安全而牢靠地系在桥上固定的位置。 4.4.4 应使用闭管式采样器或杆式采样器采集水样。 4.4.5 采样体积应不少于 1 L。 4.4.6 样品常规监测的采集深度应符合 HJ/T 91 的要求，与水质监测一致；发现明显水华（肉眼可见浮渣）时，在表层下 0.5 m 处采集水样。 4.4.7 所采集的样品应不含浮渣。 4.4.8 藻类样品采集应安排在其他样品采集之前，避免生物类群在采样前受到扰动，并及时在现场进行固定，固定及保存方法见第 5 章。 4.4.9 样品采集过程中的安全保护应符合 GB/T 14581 的要求。 4.5 样品标识4.5.1 采样瓶外侧应标识采样点信息、采样时间以及采样人姓名。 4.5.2 采样表应记录采样时间、点位名称、采样工具等（见附录 A）。 4.5.3 样品标识应符合 HJ 493 的要求。 5 样品处理与保存5.1 样品处理5.1.1 使用鲁哥试剂固定藻类样品，其制备方法为：60 g 碘化钾（分析纯）加入 1 L 去离子水中，再加入 40 g 碘（分析纯），充分搅拌使其溶解，静置 24 h 以上。配制好的鲁哥试剂应储存于棕色磨口玻璃瓶避光保存。 5.1.2 每升样品中应加入约 15 mL 鲁哥试剂对藻类进行固定。对于发生蓝藻水华的水样，每升水样中酌情再增加 3 mL5 mL 鲁哥试剂。 5.2 样品保存5.2.1 样品应 4 冷藏、避光保存，且在 24 h 内密闭运输至实验室。 5.2.2 鲁哥试剂固定后的样品低温（4 左右）避光保存不得超过 12 个月，储存超过 10 周的样品应定期检查鲁哥试剂的损耗情况，若样品颜色变浅，则应向样品中适当补充少量鲁哥试剂，直到样品的颜色恢复为黄褐色。 6 蓝藻种属鉴定及密度分析6.1 基本流程蓝藻样品的种属鉴定及密度分析按照附录B所示流程进行。 6.2 实验室仪器设备6.2.1 虹吸管：2 mm3 mm。 6.2.2 玻璃量杯：50 mL。 6.2.3 螺口玻璃试管：10 mL。 6.2.4 微量移液管：100 L。 6.2.5 塑料滴管：3 mL。 6.2.6 光学显微镜：物镜 4、10、40、100，目镜 10或 15。 6.2.7 血球计数板：1/400 mm2，容量 0.1 mm3。 6.2.8 计数框：20 mm20 mm，容量 0.1 mL。 6.2.9 超声波细胞破碎仪：功率 250 W，工作频率 20 kHz25 kHz，破碎容量：0.5 mL150 mL。 6.3 实验室预处理样品沉淀和浓缩的具体方法为：藻类样品在采样瓶中静置沉淀24 h后，用虹吸管于水面下5 mm处抽取上清液，直至藻类沉淀物体积约40 mL。将藻类沉淀物转入玻璃量杯中，用少许上清液冲洗采样瓶2次 3次，将冲洗水一并转入玻璃量杯中。玻璃量杯中的藻类沉淀物沉淀24 h后，用塑料滴管吸取上清液， 保留约10 mL藻类沉淀物转移到螺口玻璃试管中，静置定容后用于种属鉴定及密度分析。 6.4 显微镜校准显微镜的校准方法参见GB/T 2985。 6.5 玻片标本制备将藻类样品充分摇匀后，用塑料滴管（或微量移液管）取样品置血球计数板或计数框内，盖上盖玻片，制成玻片标本，计数室或者计数框内不得有气泡。 6.6 蓝藻种属鉴定及优势属（种）确定6.6.1 参考相关藻种形态学书目在光学显微镜下对玻片标本中的蓝藻进行种属鉴定。 6.6.2 优势个体或群体应鉴定到种，其他个体或群体至少鉴定到属。 6.6.3 在鉴定记录表中记录蓝藻种名、数量，并且记录其他藻类的数量（附录 C）。鉴定藻类数量应至少为 200 个。 6.6.4 藻类鉴定书目见附录 D。书目中未包含的湖泊伪鱼腥藻及拉氏拟柱孢藻见附录 E。 6.6.5 蓝藻属（种）所占比例： P = 𝐴蓝𝐴总(1) 式中：P 蓝藻某属（种）所占比例； A蓝鉴定过程中蓝藻某属（种）细胞数量； A总鉴定过程中藻细胞总数量。 6.6.6 当 P15 %时，该蓝藻属（种）属于优势蓝藻属（种）。 6.7 蓝藻密度分析6.7.1 基本要求6.7.1.1 采用光学显微镜对玻片标本进行总藻及蓝藻密度分析。 6.7.1.2 当某些蓝藻（例如微囊藻属）以群体形式存在时，若群体大小相对均匀，可通过确定群体的平均细胞数再进行计数；若群体大小不均匀，应对蓝藻群体进行解团（如超声解团）后再进行计数。 6.7.1.3 对丝状蓝藻进行计数前，应计算其藻丝和藻细胞平均长度。 6.7.1.4 大于 200 m 的藻种（如颤藻）应在低放大倍数（物镜 10）下计数，小于 200 m 的藻种（如铜绿微囊藻）应在较高放大倍数（物镜 40）下计数。 6.7.1.5 每个样品应重复计数 2 次3 次，每两次结果的绝对偏差不得大于 15 %，否则应继续取样计数。 6.7.2 血球计数板计数法6.7.2.1 将玻片标本放置于载物台上，静置 3 min5 min 后，对左上、左下、右上、右下和中心五个中格进行计数（见图 1）。在计数过程中，应不断调整焦距，保证藻细胞无遗漏。 图1 血球计数板计数法6.7.2.2 当藻体一半以上处于计数视野内则计数；当藻体少于一半在计数视野内，计上不计下，计左不计右。 6.7.2.3 每个中格藻数量应在 35 范围内；如不在此范围，应对水样进行适当的浓缩或稀释以保证计数的准确性。 6.7.2.4 把计数所得结果按下式换算成总藻密度： 𝑁总 = 5𝐴总𝑉𝑘 104(2) 式中：N总每升水中藻细胞总数量，cells/L； A总五个中格中藻细胞总数量； V 1 L水样经浓缩后的样品定容体积，mL； k 计数过程中稀释倍数；若浓缩n倍，则k=1/n。 6.7.3 计数框计数法6.7.3.1 将玻片标本放置于载物台上，静置 3 min5 min 后，依照目镜行格法，间隔选取四个“半行”（见图 2）进行计数。在计数过程中，应不断调整焦距，保证藻细胞无遗漏。 6.7.3.2 当藻体一半以上处于计数视野内则计数；当藻体少于一半在计数视野内，计上不计下，计左不计右。 6.7.3.3 一个“半行格”内的藻数量应在 75250 范围内；如不在此范围，应对水样进行适当的浓缩或稀释以保证计数的准确性。 图2 计数框半行格计数法第二行左侧半行计数框计数第四行右侧半行计数框计数第七行左侧半行计数框计数第九行右侧半行计数框计数6.7.3.4 把计数所得结果按下式换算成总藻密度： 𝑁总 = 50𝐴总𝑉𝑘(3) 式中：N总每升水中藻细胞总数量，cells/L； A总四个“半行格”中藻细胞总数量； V 1 L水样经浓缩后的样品定容体积，mL； k 计数过程中稀释倍数；若浓缩n倍，则k=1/n。 6.7.4 蓝藻密度分析利用蓝藻属（种）占比及总藻密度按下式计算蓝藻属（种）密度： 𝑁蓝 = 𝑁总 𝑃(4) 式中：N蓝每升水中蓝藻某属（种）细胞数量，cells/L； N总每升水中藻细胞总数量，cells/L； P 蓝藻某属（种）所占比例。 7 质量保证和质量控制7.1 样品采集质量保证与质量控制7.1.1 采样过程7.1.1.1 采样设备应处于良好的运行状态，日常应进行常规检查、维护和校准。 7.1.1.2 应保证所有采样设备的清洁。 7.1.1.3 对于泥沙较多的点位，在进行样品固定前应静置沉淀 3 min5 min 去除泥沙。 7.1.2 运输过程7.1.2.1 运输过程中应保证样品无破损、无污染。 7.1.2.2 运输过程应严格按照 5.2.1 的要求执行。 7.1.2.3 运输前后应保证标签的完整性，若有损坏应及时进行替换。 7.2 实验室质量保证与质量控制7.2.1 样品的交接与记录7.2.1.1 样品交接时，接收人员应检查样品状态并进行记录。 7.2.1.2 样品应有唯一性标识及检测过程中的状态标识。 7.2.2 蓝藻种属鉴定、密度分析实验室应在以下几方面加强内部质量控制： a) 实验室定期随机抽取样品，由另一名实验室检测人员或资深藻类鉴定专家进行重复鉴定，两次鉴定结果的百分比差异应小于等于 50 %。百分比差异计算按下式： PctDiff(%) = 1 𝑚𝑖𝑛(𝑎, 𝑏) 100%(5) 式中：a 原检测人员记录的种（或属）蓝藻数量占蓝藻总数量的比例； b 重复检测人员记录的同一种（或属）蓝藻数量占蓝藻总数量的比例。 c) 对新种、新记录种和已有种属的新形态应保存对应的图片信息，并附上详细文字描述，包括鉴定依据及种属特征描述； d) 实验室应当保存并更新相关的分类学文献。 7.2.3 数据记录及保存7.2.3.1 记录检测过程中所取得的相应数据，包括检测人、检测时间、样品信息、原始数据，描述从原始数据到最终结果的计算过程、数据转换步骤，并进行归档保存。 7.2.3.2 可进行蓝藻拍照的实验室，应对新种、优势蓝藻种、同一蓝藻的不同形态及不同角度进行拍照存底，并归档保存。 7.2.4 留样实验室分析剩余的藻类样品至少保留3个月，有条件的实验室可在4 冷藏条件下保留1年。 b) 新种、新记录种及已有种属的新形态必须留出典型、完好的样品； AA 附 录 A（资料性） 蓝藻样品采样表在采集藻类样品时，填写表A.1。 表A.1 蓝藻样品采样表河（湖、库）名称 采样时间 点位名称 点位坐标 固定剂 固定剂加入量 样品量 采样工具 透明度/m 水深/m 水温/ 溶解氧/(mg/L) 浊度/NTU pH值 采样人 记录人 备注 记录风向、是否可见浮渣、泥沙情况、现场干扰（如来往船只引起水力扰动）等信息 数据分析资料归档BB 附 录 B（规范性）蓝藻鉴定及计数流程图蓝藻鉴定及计数按照图B.1所示流程进行。 浮游藻类样品固定静置24h虹吸法抽掉上清液冲洗23次约40 mL沉淀物剩余静置24h吸管吸去上清液冲洗23次约10 mL沉淀物剩余显微镜校准藻类形态学鉴定藻类计数个数记录蓝藻非蓝藻门类总藻、蓝藻个数蓝藻属（种）个数定容藻类样品待测至少鉴定到属 图B.1 蓝藻鉴定及计数流程图 CC 附 录 C（资料性） 蓝藻鉴定记录表在进行蓝藻种属鉴定时，填写表C.1。 表C.1 蓝藻鉴定记录表分析日期 分析人 属 种 样品（需记录采样时间、采样点位等） 样品 1 样品 2 样品 3 微囊藻属 铜绿微囊藻 惠氏微囊藻 水华微囊藻 其他 颤藻属 巨颤藻 阿氏颤藻 两栖颤藻 其他 平裂藻属 银灰平裂藻 优美平裂藻 微小平裂藻 其他 伪鱼腥藻属 湖泊伪鱼腥藻 其他 其他门类 总数量 备注 可画“正”字来记录对应藻种的数量。 对于图谱未有或无法确定的蓝藻种，应做好图片保存。 DD 附 录 D（资料性） 藻种鉴定书目D.1 胡鸿钧. 水华蓝藻生物学M. 北京: 科学出版社, 2011. D.2 胡鸿钧, 魏印心. 中国淡水藻类系统、分类及生态M. 北京: 科学出版社, 2006. D.3 胡鸿钧, 李尧英, 魏印心等. 中国淡水藻类M. 上海: 科学技术出版社, 1980. EE 附 录 E（资料性）藻种鉴定书目中未包括的蓝藻种形态特征及图谱藻种鉴定书目中未包含的湖泊伪鱼腥藻及拉氏拟柱孢藻见图E.1和图E.2。 E.1 伪鱼腥藻属（Pseudanabaena Komrek 1992）E.1.1 形态特征E.1.1.1 细胞常为两端钝圆的圆柱状，长大于宽，顶端具或不具气囊。 E.1.1.2 藻体呈丝状；藻丝单生或聚合呈很细的、胶状的垫，直线略呈波状或弯曲；无分枝，宽 0.8 m3 m；由圆柱形细胞组成，细胞横壁处常略收缢，幼丝体横壁不清晰，无硬的鞘，有时具薄的、无色的鞘，藻丝末端不渐细，顶端细胞有时为圆柱形，有时运动（颤动）。 E.1.2 常见种形态特征及镜检图E.1.2.1 伪鱼腥藻属常见种为湖泊伪鱼腥藻（Pseudanabaena limnetica）。 E.1.2.2 毛状体单生，直的或弯曲的，没有胶鞘，1.2 m2.0 m 宽，相邻细胞间横壁明显，无缢缩或略缢缩；细胞呈圆柱状，边缘呈圆形，长 4.5 m7.0 m，不存在气泡。 E.1.2.3 湖泊伪鱼腥藻具体形态特征见图 E.1。 图E.1 湖泊伪鱼腥藻镜检图E.2 拟柱孢藻属 (Cylindrospermopsis Ktz 1843）E.2.1 形态特征E.2.1.1 拟柱孢藻藻丝末端具异形胞，呈尖细状或钝圆状，具伪空泡。 E.2.1.2 厚壁孢子出现在藻丝一端或两端，距异形胞 1 个3 个营养细胞。 E.2.2 常见种形态特征及镜检图E.2.2.1 拟柱孢藻属常见种为拉氏拟柱孢藻（Cylindrospermopsis raciborskii）。 E.2.2.2 单根丝体，伪空泡多，藻丝笔直不弯曲，蓝绿色，相邻的细胞壁没有缢缩。藻丝长度变化极大，范围为 17 m1 220 m。没有异形胞的藻体其两端细胞的末端稍尖或钝圆。营养细胞呈圆柱形， 长 3.3 m14.0 m，宽 2.3 m4.3 m。异形胞顶生，位于藻丝一端或两端，偶有间生，呈长圆形或卵圆形，长 3.5 m4.5 m，宽 2.3 m2.8 m。 E.2.2.3 拉氏拟柱孢藻具体形态特征见图 E.2。 图E.2 拉氏拟柱孢藻镜检图 参 考 文 献1 GB/T 2985 生物显微镜 2 GB/T 13195 水质 水温的测定 温度计或颠倒温度计测定法3 HJ 506 水质 溶解氧的测定 电化学探头法 4 HJ 1075 水质 浊度的测定 浊度计法5 HJ 1147 水质 pH值的测定 电极法