Mx 3000P荧光定量PCR仪中文操作说明-吉泰生物科技.pdf

Mx3000p定量PCR仪器操作说明Mx 3000P荧光定量PCR仪中文操作说明吉泰生物科技有限公司制 Mx3000p定量PCR仪器操作说明目录MX 3000P荧光定量PCR仪.1中文操作说明.1前言.1简介.1MX3000P仪器的使用.2仪器状态指示LED灯.2使用注意事项.2实验样品上样和取出.3多台MX3000P仪器安装：多台仪器的使用控制.6化学检测方法和试脸类型的选择.11QPCR和化学检测方法介绍.11Mx3000p系统试验类型概述.14MX3000P软件导航.16命令菜单.16文件菜单.17编辑菜单.30仪器操作菜单.31工具菜单.35选项菜单.36选项-光学配置.37选项-实时检测 分析 参数设 定.42选项-只读板检测分析参数设定.53选项一一般参数设定.54页面菜单.64视图菜单.65窗口菜单.66帮助菜单.67工具栏.68快捷键.72快速实验方法.74快速板设置方法.74循环程序设定快速方法.75运行实验快速方法.76定量PCR快速分析方法.77相对定量快速分析方法.78Real-Time等位基因辨别快速分析方法.80分子信标融解曲线快速分析方法.81定量板读取快速分析方法.82iMx3000p定量PCR仪器操作说明目录细节实验方法.84怎样设置一个新的实验.84板设置.85温度设置介绍.100怎么运行一个实验.116准备运行.116开始运行.116监控运行.117在运行过程中分析数据.119取消运行.119观察温度曲线状态.120观察原始数据.121观察扩增曲线.123如何运行一个读板实验.125开始运行.125运行监控.126终止定量程序的运行.127为读板实验设置读板属性.127观察读板实验中的原始数据.128观察读板原始数据图.129怎样分析数据.131分析数据.131Anal ysis Sel ec t io n/Set up.132指定数据分析设置.134MX3000P系统试验操作：定量PCR.143定量PCR试验类型.143定量PCR板的设定.143绝对定量PCR热循环参数的设定.147绝对定量PCR数据分析.149分析设置部分.149绝对定量PCR扩增曲线图.150绝对定量PCR板样本值.152绝对定量PCR的标准曲线.154定量PCR起始模板的量.158绝对定量PCR双色散点图.159绝对定量PCR的文本报告.162MX3000P系统试验操作：相对定量.165相对定量PCR试验类型.165相对定量实验的设定.169相对定量PCR热循环参数的设定.173相对定量PCR数据分析.175相对定量PCR扩增曲线图.1772Mx3000p定量PCR仪器操作说明目录相对定量融解曲线.179相对定量实验的样本值.180相对定量PCR的标准曲线.183比较结果的相对定量图.188相对定量试验样本的相对值.190相对定量试验的文本报告.192MX3000P实验：SYBR GREEN(做融解曲线).196SYBRGreen实验类型.196SYBR Green 板设置.197SYBR Green温度曲线设定.199SYBR Green 数据分析.200分析设置.200SYBR Gr een扩增曲线.202SYBR Gr een融解曲线.204SYBR Gr een样品板值.207SYBR Gr een标准曲线.209SYBR Gr een起始模板的量.213SYBR Gr een的文本报告.214MX3000P实验：等位基因分型/SNP分析.217等位基因分型/SNPS实时荧光定量实验类型.217等位基因分型/SNPs实时荧光定量设定.218等位基因分型/SNPS实时荧光定量热循环程序设定.220等位基因分型/SNPS实时荧光定量数据分析.222分析设定.222等位基因分型/SNPs实时荧光定量扩增曲线.223等位基因分型/SNPs实时荧光定量样品值.225等位基因分型/SNPs实时荧光定量散点分布图.227等位基因分型/SNPs实时荧光定量最终结果判定.231等位基因分型/SNPs实时荧光定量文本报告.233MX3000P实验:分子信标(MOLECULAR BEACON)融解曲线.236分子信标融解曲线实验类型.236分子信标融解曲线实验板设定.238分子信标融解曲线实验热循环程序设定.240分子信标融解曲线实验数据分析.241分析设定.241分子信标融解曲线实脸退火温度范围.243分子信标融解曲线实验融解曲线/温度.245MX3000P实验：只读板定量实验.246只读板定量实验.2463Mx3000p定量PCR仪器操作说明 目录只读板定量实验板设定.247只读板定量实验数据分析.250分析设定.250只读板定量实验-板样品值.251只读板定量实验标准曲线.253只读板定量实验起始模板定量.256只读板定量实验双色散点分布图.258只读板定量实验 荧光强度值.260只读板定量实验 最终结果判定.263只读板定量实验文本报告.265MX3000P实验：只读板等位基因分型实验类型.268只读板等位基因分型实验类型.268只读板等位基因分型实验-板设定.269只读板等位基因分型实验-数据分析.270分析设定.270只读板定量实验-板样品值.272只读板等位基因分型-双色散点分布图.274只读板/等位基因分型实验-荧光强度值.278只读板/等位基因分型实验-最终结果判定.281只读板等位基因分型实验 文本报告.283系统的维护及注意事项.286硬件信息.286更换部件.286更换保险丝.286卤鸨灯的更换.287仪器的清洁.287常见故障及排除.2884Mx3000p定量PCR仪器操作说明前言刖吕简介Mx3000pTM实时荧光定量PCR仪是一款性能优越的一体式定量PCR检测系 统。结构缜密的热循环系统、波长宽广的石英卤鸽灯发射光源、高灵敏的光电倍增 管检测器以及人性化的实时定量检测和分析软件构成了卓越的Mx3000pTM实时定 量系统。应用Mx3000pTM实时荧光定量PCR仪可以快速、方便、精准的对PCR过程 进行实时监控。作为一个开放的系统，Mx3000pTM可以使用多种检测方法，如SYBR Green荧光染料或荧光探针检测系统等，可以支持实时检测和信号只读板检测。Mx3000pTM检测和分析软件具有可方便操作的热模块板设置、热循环程序 设定和清晰明确的数据分析界面，并为不同的实验类型预设了不同的程序选项，从 而使得采集和分析数据流畅、便捷和明晰。Mx3000pTM实时荧光定量系统较其它实 时检测仪器具有以下优点：数据分析和读取具有多种形式，包括：扩增曲线、Scatter plots、样品数据显示（可以同时显示整个板上所有染料的数据）、荧光信号数据显 示、最终信号分析结果、融解曲线、退火范围以及各种数据的文本报告功能强大的数据分析程序，包括：最适基线设置，可以优化实验结 果减少手动调节操作分子信标的融解曲线分析，自动的溶解温度（Tm）计算可以将一个实验数据中，单独显示个别染料或个别反应孔数据在PCR运行过程中，可以实时的监控扩增曲线，并随时进行数据 分析所有结果都提供有原始数据定量PCR实验在PCR热循环过程中，通过检测荧光信号的增加，实时的监控和报告PCR产 物的聚集，在PCR扩增的指数扩增期收集数据，通过软件精确计算对样本的起始 模板量进行定量。另外，还可以动态的检测PCR反应的状态。荧光数据只读板实验只读板实验增加了实验数据收集的灵活性，即某个时刻的一组数据的荧光信号 值读取，直接分析结果。Mx3000p系统也可以用来读取和分析进行PCR热循环反 应前或在其它热循环仪器上进行扩增反应后样本的荧光信号值。1Mx3000p定量PCR仪器操作说明前言Mx3000p仪器的使用仪器状态指示LED灯在Mx3000p定量PCR仪器的前表面上有两个表面仪器状态的指示灯。下方的指示灯是电源指示，这个指示灯亮时，表明仪器电源连接好，并处于开 启状态。上方的指示灯是仪器状态指示灯，有三种显示模式：指示灯亮：Mx3000p仪器控制软件已正常工作，仪器准备就绪，可以开始运行 PCR程序。指示灯闪烁：仪器正处于一个PCR程序运行中，或正在进行自检，尚未准备 就绪，无法开始一个新的PCR程序。指示灯关闭：仪器电源未接通或Mx3000p仪器控制软件尚未运行，仪器无法 开始工作。使用注意事项安全提示符：电源开关指示符号 AA请注意请注意，表面很烫其它警告：将实验样品放入热模块或将薄壁管从热模块上取出时，请注意加热模块的温度 可能很高。切勿接触过滤镜的玻璃表面和石英卤鸨灯的表面。在机器运行过程中，请不要打开仪器盖子。当仪器前表面上的上方状态指示灯 闪烁时，表明仪器正在运行一个PCR程序，如果此时打开仪器盖子，仪器会终止 PCR程序运行，并在电脑界面上出现警告对话框。2Mx3000p定量PCR仪器操作说明前言实验样品上样和取出Mx3000p力热模块在放入实验样品或将其从热模块上取出时，请注意加热模块的温度可能很高。在放入实验样品前，请检查状态指示灯（仪器前表面上方指示灯），如指示灯为 明亮的绿色，则表明仪器已经准备就绪，可以开始运行。（如果状态指示灯不亮，表 明仪器的电源没有连接好，而当状态指示灯闪烁时，表明仪器正在预热，或正在运 行一个实验程序中，此时请不要打开仪器盖子。）打开位于仪器正前方的盖子，即将盖子按其轨道推入仪器顶部。向前方拉热盖把手，向上翻转热盖，就可以看到加热模块。热盖光闭时状态见 左下方示意图，热盖打开时状态见右下方示意图。注意：热盖上也有96孔的孔槽，为光路通道。外观上容易与加热模块混淆,所以在放入实验样品时，请确定热盖已打开，样品放在热模块上。当使用PCR薄壁单管或8联管、12联管时请使用适配框架当使用PCR薄壁单管或8联管、12联管时，请使用下图所示的适配框架，并 请注意按照图中所示的方向安装该配件。3Mx3000p定量PCR仪器操作说明前言使用适配框架可以调整每一个单独样品管和热盖之间的接触。使用96孔反应 板时则不需要安置适配框架。购买Mx3000p仪器是附带一个适配框架，可以单独 购买适配框架（Stratagene目录号#401421）。适配框架的安装：将适配框架放置于热模框的边界上，如位置正确则适配框架 上的六个位于适配框架底部凹槽恰好嵌入加热模块表面的缝隙中，这时适配框架可 以稳定的放置，而不会随意移动。实验样品的准备注意事项盖上实验反应管管盖在接触反应管的管盖时，请佩戴无粉手套。可以将管盖盖紧后，再将反应管放 入仪器中，而为了获得更好的实验结果，推荐将反应管稳固的放入热模块的96孔 工作架后，再盖上反应管盖子。垂直向下用力压紧盖子，并从侧面观察所有的盖子 都已压紧，表面平坦。也可以使用Corning自动仪器：Corning Storage Mat Applicator进行操作。样品管离心在实脸反应管放入Mx3000p仪器之前，请将加好样的反应管或96孔反应板进 行离心，以确保所有的液体都集中在管底，在管壁和管盖上没有反应液残留。8联反应管放入加热模块在使用8联反应管时，请将8联管纵向放入热模块（12x8热模块中，8孔的 纵列）,请勿将8联管横向放入12孔的横排。实验使用耗材适合Mx3000p仪器使用的实验反应管，可从Stratagene公司购买：96 孔 PCR 反应板：96-Wel l PCR pl at es,0.2ml,no n-skir t ed（目录号#410088)8 联反应管：8 x st r ip t ubes,0.2ml（目录号#401428)8 联透光管盖：8 x o pt ic al st r ip c aps（目录号#401425)PCR 反应管(无管盖)：Singl e PCR r eac t io n t ubes(w it ho ut c aps),0.2ml（目录号#410023)需要的其它仪器：离心机Stratagene 的 Tube-Strip PicoFuge,可用于 0.2ml 8 联反应管或 0.2ml PCR 反应单管的离心。产品目录号#400540（使用115-120V电压），#400542（使用230V 电压）96孔反应板操作架4Mx3000p定量PCR仪器操作说明前言Statagene提供96孔反应板操作架，产品目录号#410094覆膜仪Corning提供的Storage Mat Applicator可用于反应管加盖操作。目录号#30815Mx3000p定量PCR仪器操作说明前言多台MX3000P仪器安装：多台仪器的使用控制一台电脑可以控制一台Mx3000p仪器，也可以同时控制多台Mx3000p仪器。一台Mx3000p仪器和一台电脑的连接请参见安装指南(Installation Guide)或安装 及应用指南中仪器装配说明内容，多台Mx3000p仪器和一台电脑连接操作请参见 以下说明：多台仪器控制的硬件连接请使用Mx3000p定量软件的多台仪器控制模式，一台电脑可以同时控制最多6 台Mx3000p实时定量PCR仪器。1、确认电脑连接端口与Mx3000p仪器是否匹配。Mx3000p仪器通过 Statagene提供的串联数据线(Statagene配件编号#22316-00)与电脑相接。电脑上的所有串联端口都可以用于与Mx3000p仪器的直接连接，且不需要 安装额外设备。若仪器连接了 USB-to-串联端口适配器(Stratagene配件编 号#22490)后，则USB端口即可用于连接仪器。如需要连接更多的Mx3000p 仪器，即需要更多的连接端口，则需要带有相应数目USB-to-串联端口适配 器的 USB Hub。2、各台Mx3000p仪器分别连接电源。连接电源线前，确认位于 Mx3000p仪器后侧面的电源开关已关闭，然后将位于电源开关旁边的电源 线连接电源。建议仪器连接地线。3、各台Mx3000p仪器之间用串联数据线连接好，连接端口为位于仪 器后面的RS-232端口。4、将最后串联数据线的一端与电脑相连接,连接端口为电脑串联端口，如使用USB-to-串联端口适配器，则可以和电脑USB接口连接。5、打开串联系统。打开各台Mx3000p仪器的电源开关(位于仪器后侧 面)。开启电脑，进入Windows操作系统，双击Mx3000p软件图标，打开 Mx3000p应用软件。设置Mx3000p多台仪器控制软件系统用Mx3000p软件建立电脑和各台仪器之间的数据连痴 请点击软件的仪器操作(Instrument)菜单，在下拉菜单中点击多台仪器控制(Multiply Instrument Control)选项。Inst r ument To o l s Opt io ns Sec t io n View Windo w Hel pMul t ipl e Inst r ument Co nt r o l-Rename/Remo ve Inst r ument s.Qual if ic at io n Test.5el f-Test.Change Co nnec t ed Inst r ument.注意：不推荐在设置多台仪器控制程序或在调整软件参数时,运行PCR实验 操作程序。6Mx3000p定量PCR仪器操作说明前言点击多台仪器控制(Multiply Instrument Control)选项菜单中的添加仪器(Add Instruments)选项，弹出以下对话窗口。经过一系列咨询对话框后，对话 窗口中的列表中出现新监测到的仪器信息。二i击确认(identify)1157与此端口连接的Mx3000p仪器前侧面的状态指示 灯闪烁，则可以确认列表中的这台Mx3000p仪器与电脑连接就绪。在已连接的多台仪器控制系统中再添加一台Mx3000p仪器时，请点击相应的 添加(Add)按钮，出现添加串联仪器(Add Instrument-COM#)对话框，输入 仪器名称(Instrument name)并选择确定(0K)按钮。重复以上操作，与其它端口连接的Mx3000p仪器建立数据连接。当所有连接 的仪器均添加好，并设置好仪器名称。点击下一步(Next)按钮，向导对话框将指 导完成添加进程。在多台仪器控制模式下使用Mx3000p软件启动相应Mx3000p仪器：当电脑与多台仪器连接和识别后，即可以应用Mx3000p操作软件任意指定开启 每次实验所用到的仪器。7Mx3000p定量PCR仪器操作说明前言每次打开一个Mx3000p应用程序时，系统默认只有一台机器连接。程序运行时,软件窗口标题栏将显示与Mx3000p应用程序连接仪器的名称。W Mx3000P(Instrument 1)-Quantitative PCR-New Experiment.mxpFil e Edit Inst r ument To o l s Opt io ns Sec t io n View Windo w Hel p多台仪器的同时应用与同一台电脑连接的各台Mx3000p仪器，可以分别由一个Mx3000p应用程序 控制，打开多个Mx3000p应用程序即可同时运行多台已连接的Mx3000p仪器。每 打开一个新的Mx3000p应用程序，在多台仪器控制(Multiple Instrument Comtrol)对话框中选定相应的一台仪器。Multiple Instrument ControlSel ec t inst r umer iInst r ument 1(In Use0 Inst r ument 2Inst r ument 3St andal o neThe inst r ument name w il l appear in t he appl ic at io n c apt io n.在对话框中显示状态为使用中(In-Use)的仪器，不能被选中。这种情况通常 是由于该仪器已与另一个Mx3000p应用程序连接并受其控制，另外该仪器未接通 电源或者该仪器与电脑之间的连接数据线断开时，该仪器的状态也会显示为：使用 中(In-Use)。当仪器与Mx3000p应用程序连接后，应用程序窗口标题栏中，将显示该程序控 制的仪器的名称。当想要切换到另一个Mx3000p应用程序操作界面时，在Mx3000p 程序菜单栏的窗口(Window)菜单中选择相应的仪器，或者在电脑界面下方的任 务栏选择相应的应用程序窗口。Windo w Hel pTil e Pl o t sCasc ade Pl o t s3 1 Mx3000P(Inst r ument 2)-SYBR Gr een-New Exper iment.mxp2 Mx3000P(Inst r ument 1)-Quant it at ive PCR-New Exper iment.mxp多台仪器控制模式的管理Mx3000p应用程序菜单栏中的仪器操作(Instrument)菜单一多台仪器控制(Multiple Instrument Comtrol)选项中的命令，可分别用于在电脑上添加相应的 定量仪器，以及为已和Mx3000p控制程序连接的相应仪器更名或直接取消仪器和 程序的连接。Inst r ument To o l s Opt io ns Sec t io n View Windo w Hel pMul t ipl e Inst r ument Co nt r o l-Rename/Remo ve Inst r ument s.Qual if ic at io n Test.Sel f-Test.Change Co nnec t ed Inst r ument.8Mx3000p定量PCR仪器操作说明前言向电脑控制定量仪器组添加一台定量仪器向电脑控制仪器组添加一台定量仪器与新建多台仪器控制的操作步骤是相同 的：首先，建立新的定量仪器与电脑的硬件连接(见“多台仪器控制硬件连接”章 节内容)；然后，完成仪器与应用程序之间的数据连接，即在多台仪器控制(Multiple Instrument Comtrol)菜单选项中选择添加仪器(Add Instrument)后，根据提 示完成操作。(详细操作说明见“设置Mx3000p多台仪器控制软件系统”章节内容)。为多台控制仪器组中的相应仪器更名或将其从多台控制仪器组中移除为多台控制仪器组中的一台仪器更名或将仪器从多台控制仪器组中移除，选择 在多台仪器控制(Multiple Instrument Comtrol)菜单选项中的仪器更名/移除(Rename/Remove Instrument),根据提示完成操作。在一个或多个咨询对话框 后，会出现以下对话框：为了确认想要更名或移除的Mx3000p仪器，请点击与相应仪器名称对应的确 认(Identify)按钮，此时与此端口连接的仪器前侧的状态指示灯会闪烁。在确认想要更名或移除的Mx3000p仪器后，点击对应的仪器更名/移除(Rename/Remove)按钮。为Mx3000p仪器更名时，选择仪器更名(Rename)选项后，在文字框中输入 新的仪器名称，点击确定(0K)按钮，然后根据提示完成操作。9Mx3000p定量PCR仪器操作说明前言将Mx3000p仪器从多台控制仪器组中移除时，则选择移除(Remove)选项 并点击确定(OK)按钮，然后根据不同的情况下，程序给予的提示和建议完成操 作。如果想要移除的Mx3000p仪器与当前运行的Mx3000p仪器应用程序连接，则 将直接提示你选择另一台Mx3000p仪器与该程序连接。如果移除Mx30000p仪器的连接后，只剩一台仪器和电脑连接，则程序将提示：目前电脑将转换为单台仪器控制模式。如果试图移除与电脑连接的最后一台Mx3000p仪器，则程序将提示：出错信 息，不允许此操作，因为Mx3000p应用程序的仪器连接模式要求至少有一台 Mx3000p仪器与电脑连接。如果希望在不连接任何仪器的条件下运行Mx3000p应 用程序，则应重新打开一个独立运行(Standalone)模式的Mx3000p应用程*。转换与应用程序连接的Mx3000p仪器更改与当前运行的Mx3000p应用程序连接的仪器，请在多台仪器控制(Multiple Instrument Comtrol)菜单选项中选择更改仪器连接(Change Connected Instrument),出现以下对话框后，选择一个可用的(Available)仪器并点击确定(0K)按钮。那么新选择的Mx3000p仪器的名称将出现在当前应用程序的标题栏 中。ioMx3000p定量PCR仪器操作说明前言化学检测方法和试验类型的选择QPCR和化学检测方法介绍定量PCR介绍定量PCR方法是对生物学样本中mRNA水平（基因表达水平）和DNA水平（基因拷贝数）进行定量的重要技术。待检测的靶基因在生物学样本中的含量通常 很低，无法直接进行定量检测，因此需要通过PCR或其它实验方法对待检测的靶 基因进行扩增，然后再进行定量检测。但是对PCR扩增产物的终点分析法，往往 无法对样本的起始量进行精确的定量。这是因为在PCR扩增过程中，随着PCR体 系中的试剂逐渐被消耗而缺乏、PCR抑制物的逐渐积累，PCR扩增效率会有所不 同，而各样品在PCR进程中任何细微的差别都会随着扩增过程被放大。相反，应 用实时定量PCR（real-time PCR）进行定量分析时，在PCR指数扩增早期对PCR 扩增产物量进行分析，此时PCR扩增所需酶、dNTP等原料很充足，其它可能造成 差异的因子最少，因此能够对起始DNA或RNA水平进行相当精确的定量。另外实 时定量PCR方法还具有检测灵敏度高（可检测低至10个拷贝数的RNA分子）和 检测动态范围宽（在至少六个数量级保持很好的线性结果）的优点。Mx3000p定量PCR检测系统是在封闭管状态下，通过实时检测PCR过程中 产物积累的过程，从而对样本中的DNA或RNA进行精确定量。仪器可采用荧光标 记探针法，也可以采用SYBR Green I荧光染料法进行定量检测。用荧光标记探针进行定量检测为了精确的对PCR扩增产物进行定量，通常会采用荧光标记探针进行检测。目前常用的探针主要为TaqMan探针和分子信标（Molecular Beacon）两种，两种 类型的探针具有以下共同的结构特点：探针序列与需要扩增的靶基因上的一段序列 互补，探针两端分别标记了荧光基团和荧光淬灭基团，工作原理均为：在PCR扩 增前探针上的荧光淬灭基团对荧光基团的作用，使荧光基团的荧光信号被淬灭；PCR扩增后荧光淬灭基团和荧光基团分离（两种探针分离机制不同，详见后述），使得荧光基团发射荧光信号；那么在某一个PCR扩增循环时测得的反应体系中的 荧光信号强度与这一时刻特定的PCR扩增产物的量成一定比例关系。在应用TaqMan探针或分子信标的定量实验中，PCR扩增反应过程中收集的荧 光信号是探针上标记的荧光基团特异波长的发射光。检测荧光时，由于可以区分多 个荧光基团不同波长的荧光信号，则在不同序列的探针上标记不同的荧光基团，就 可用于多通道检测实验，即在同一个实验反应管中，用不同的探针对多个目标基因 进行定量检测。11Mx3000p定量PCR仪器操作说明前言分子信标（Molecular Beacon）探针分子信标是一种发夹结构的探针，在溶液中处于游离状态时，探针的两端分别 标记的荧光基团和荧光淬灭基团相互靠近，使得荧光信号被淬灭。而一旦分子信标 探针结合在靶序列上时，发夹结构被打开，荧光基团和荧光淬灭基团之间的距离扩 大，从而使荧光基团不再被淬灭而发出荧光信号。当DNA聚合酶延伸时，结合在 靶序列上的探针游离下来，重新恢复发夹结构。在PCR扩增循环中，分子信标在 游离状态（荧光信号被淬灭）和定量的结合在靶序列上（发出荧光信号）两种状态 中转换，通过对每一个循环中荧光信号的检测，就可以实时的监测靶序列在PCR 反应体系中的积累水平。Q+JMo l ec ul ar Beac o nTar getTaqMan探针TaqMan探针是线性化寡核甘酸链，探针完整时标记在探针两端的荧光基团和荧 光淬灭基团相互接近，荧光信号被淬灭；在扩增过程中，探针被水解从而使荧光基 团和荧光淬灭基团分离，发出荧光信号。TaqMan探针的序列与上下游引物之间的 靶基因序列互补，在PCR反应延伸阶段，探针结合在模板上，当DNA聚合酶在延 伸过程中，遇到结合在模板上的探针的阻碍，即利用Taq酶的5到3的外切酶活性 水解探针，从而使荧光基团和荧光淬灭基团游离于溶液中，使得荧光基团不再被淬 灭，发出荧光信号。通过对PCR扩增扩增过程中的每一个循环检测溶液中游离的 荧光基团信号的检测，就可以实时的监测靶序列在PCR反应体系中的积累水平。Fl uo r o pho r e Taq Man Quenc herPCR f r imer、Q pr o be，/PCR Pr imerf Ampl if ic at io n r esul t ing in pr o be c l eavagef r ee Fl uo r o ph o r ePo l yn-ver izat io n .,Resul tFr ee Fl uo r o ph c r e_/-*、PCR pr o duc t s+Cl ea?age pr o duc t s12Mx3000p定量PCR仪器操作说明前言利用SYBR Green I荧光染料进行定量检测当定量检测的要求并不需要非常的精确时，则可以应用双链DNA特异性结合 荧光染料，来监测PCR扩增过程中双链DNA扩增产物的积累水平。在QPCR检 测中，dsDNA特异性结合染料最为常用的即为：SYBR Green I荧光染料。SYBR Green I荧光染料对dsDNA的结合能力高于其对单链DNA或RNA结合 能力，且与dsDNA结合后，SYBR Green I荧光染料发出的荧光信号强度较游离状 态时增强大约1000倍，这些特性使得SYBR Green I成为一个灵敏反映在某一时 刻一个反应混合液中双链DNA精确含量的指示剂。PCR反应体系中的所有双链DNA,包括特异性PCR产物和非特异性dsDNA,均可以和SYBR Green I染料结合产生荧光信号，干扰QPCR定量结果。为了区分 荧光信号是否来源于特异性产物，利用SYBR Green I荧光染料进行QPCR检测时，往往要进行融解曲线(Dissociation Curve)的分析。dsDNA在温度逐渐升高的过 程中变性为单链DNA,在温度变化过程中荧光信号强度的变化曲线即是融解曲线。在特异性PCR产物的溶解温度上荧光信号减弱的数值即反映PCR反应体系中特异 性PCR产物占所有dsDNA的比例。利用这种非荧光探针的QPCR检测方法的主要优点在于使用方便、不需要根据 扩增产物的序列设计和合成特定的探针。SYBR Green I荧光波长为520nm,可采 用检测6-FAM荧光的滤镜。13Mx3000p定量PCR仪器操作说明前言Mx3000p系统试验类型概述实时定量检测和只读板检测的比较Mx3000p实时定量检测软件系统可以允许选择不同的试脸类型，提供适应不同 应用要求的设置和分析界面。可实时检测和报告在热循环过程中PCR产物的积累，也可以进行只读板检测（PCR终点检测法可以认为是一种只读板检测的试验类型）。实时检测需要对目标RNA或DNA进行精确的定量时，就应该采用实时检测的方法。在 实时定量检测中，对靶序列扩增产物积累量的监测是在PCR指数扩增期的早期，此时PCR反应体系中原料充足、反应抑制因素少，从而可以相当准确地反映PCR 反应体系中起始模板（目标RNA或DNA）的量。在定量PCR原理概述章节中详 细讨论了实时定量分析方法的这一优点。注意：定量PCR（Quantitative PCR）通常是指应用化学方法监测PCR 扩增产物的积累，并通过所得数据的分析对目标基因进行定量的一类试验方 法。而Mx3000p定量分析软件中，提及的定量PCR（Quantitative PCR）贝U专指利用荧光标记寡核甘酸探针，通过标准曲线对目标基因进行绝对定量 的方法。其它类型的定量试验根据其试验目的和方法不同，命名有所不同。Mx3000p定量检测系统包含以下定量试验类型：Xi PCR（Quantitative PCR）是应用荧光标记探针进行检 测，并根据做出的标准曲线对未知（Unknown）样品中靶基因进行精确定 量的方法。将已知浓度的靶基因的标准（Standard）样品进行浓度梯度稀 释，进行PCR扩增得到相应浓度靶基因的扩增曲线和Ct值，做出标准曲 线。然后未知（Unknown）样品根据其Ct值在标准曲线上得到相应的起 始模板浓度。这种定量方法也被称为绝对定量或标准曲线定量法。该方法也 用于引物和探针条件优化试脸，不用做标准曲线。相对定量（Comparative Quantitation）这种定量类型用于比 较待测样品（即未知样品，Unknowns）和对照样品（Calibrator）中靶基 因表达量的差别。比如定量检测药物或其它方式处理的样品（即未知样品，Unknowns）和未经过处理的样品（即对照样品，Calibrator）两者某基因 转录水平的差异。该方法可以方便的得到不同样品之间目标基因表达量的差 另h而无须测定每个样品中目标基因的绝对数量。荧光染料（融解曲线）定量法（SYBR Green（with Dissociation Curve）是应用SYBR Green I荧光染料进行检测，并根据做出的标准 曲线对未知（Unknown）样品中靶基因进行定量的方法。该方法也用于 SYBR Green I检测优化试验，不用做标准曲线。利用荧光染料进行定量试14Mx3000p定量PCR仪器操作说明前言验的热循环程序中的融解曲线步骤,用于鉴别特异性和非特异性PCR产物。等位基因检测/SNP分析定量检测(Allele Discrimination/SNPs Real-Time)是利用荧光标记探针确定DNA样品中等位基因组成。根据 等位基因序列设计相应的探针，两个探针分别标记上波长不同的荧光基团，其序列可仅有单个核甘酸的差别；然后根据等位基因特异性探针的Ct值确 定样本中该等位基因是否存在。分子信标融解曲线(Molecular Beacon Melting Curve)分 子 信标的融解曲线分析用于确定其溶解温度(Melting Temperature,Tm)和 PCR反应最适退火温度。融解曲线分析通常是分子信标分别和完全配对模 板和错配寡核甘酸模板进行检测，以确定产物特异性最好的试脸反应温度。只读板检测只读板检测适用于荧光信号值终点检测法，如在其它热循环PCR仪器上完成 的PCR反应板荧光信号的读取、热循环反应前后荧光信号值的采集或者一次性荧 光信号的采集。Mx3000p荧光定量PCR软件系统包含两种只读板检测类型：只读定量检测(Quantitative Plate Read)是应用荧光标记探针 进行检测，并根据做出的标准曲线推测未知(Unknown)样品中靶基因含 量的方法。将已知浓度的靶基因的标准(Standard)样品进行浓度梯度稀 释，进行PCR扩增后，根据最终荧光信号强度做出标准曲线。然后未知(Unknown)样品根据其荧光信号强度在标准曲线上得到相应的起始模板 浓度。只读板/等位基因鉴别(Plate Read/Allele Discrimination)是 利用读取终点荧光信号强度来进行等位基因分析或直接读取各种酶反应板 中样品的荧光信号强度。根据反应终点时荧光信号强度是否达到设定的标准 值，确定反应样本中特异性序列是否存在，信号高于标准值为阳性，反之为 阴性结果。15Mx3000p定量PCR仪器操作说明软件应用指导MX3000P软件导航命令菜单Mx3000p实时定量PCR系统软件的菜单命令用于操作文件、试验程序的设置 和使用软件的数据分析功能、开启与电脑连接的仪器以及打开帮助（Help）菜单。要了解以下列出的命令的相关功能，请点击相应的命令名称。File Menu（文件）Edit Menu（编辑）Instrument Menu（操作）fools Menu（工具）Options Menu（选项）Section Menu（页面）View Menu（视图）Window Menu（窗 口）Help Menu（帮助）16Mx3000p定量PCR仪器操作说明软件应用指导文件菜单文件菜单包含文件打开（Open）、关闭（Close）、保存（Save）和打印（Print）命令。菜单中还有数据输出，文件转换的命令，并列出了最近打开过的试验程序。新建（New）命令一新建一个新的定量PCR试验 程序执行文件（File）菜单中的新建（New）命令，或按下键盘的Ctrl+N键或直接 点击工具栏中新建按_0钮后，将出现新建试验类型选项（New Experiment Options）的对话框，用于选择想要新建的试脸类型。点击所选的试脸类型前方的 单选按钮后点击0k按钮。在点击0K按钮时，确认石英卤鸨灯已经打开（Turn lamp on for warm-up?）。在每个PCR试验程序运行前，石英卤鸨灯将预热20分钟后 开始工作。17Mx3000p定量PCR仪器操作说明软件应用指导点击0K按钮后，软件将显示为所选择的定量试验类型的反应板设置（Plate Setup）的操作页面。打开（New）命令一打开一个已有的 文件执行文件（File）菜单中的打开（Open）命令，或按下键盘的Ctrl+O键或直 接点击工具栏中打开文件 以 按钮后，将出现打开文件（Open）的对话框，在 相应目录中选择需要打开的文件。（在对话框菜单栏的查找范围（Look in）中选择相应的目录）。点击对话框右下方的打开（Open）按钮。关闭（Close）文件命令-关闭当前试验程序执行文件（File）菜单中的关闭（Close）命令，关闭当前试验程序，并不关闭 Mx3000p定量分析软件。如果程序经过修改，则在关闭前，弹出保存当前试验（Save Current Experiment）对话框。点击是（Yes）按钮，则保存对程序的修改后关闭 程序；如点击否（No）按钮，则直接关闭程序，不保存对程序的修改；如点击取消（Cancel）按钮，则返