T_CITS 0012-2023 牛乳基婴幼儿配方乳粉及牛乳中A1和A2β-酪蛋白的测定 液.pdf

ICS67.100.99CCS X16团体标准T/CITS 00122023牛乳基婴幼儿配方乳粉及牛乳中 A1 和 A2-酪蛋白的测定 液相色谱-串联质谱法Determination of Al and A2-casein in bovine infant formula and milkLC-MS/MS method2023-07-06 发布2023-08-01 实施中国检验检测学会发布T/CITS 00122022前言前言本文件按照GB/T 1.12020 标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国检验检测学会提出并归口。本文件起草单位：雀巢食品安全研究院、中国海关科学技术研究中心、青岛海关技术中心、上海海关动植物与食品检验检疫技术中心。本文件主要起草人：鲍蕾、冯鑫、张鸿伟、吕佳、汪龙飞、张晓梅、王金花、韩深、古淑青、梁成珠。T/CITS 00122022牛乳基婴幼儿配方乳粉及牛乳中 A1 和 A2-酪蛋白的测定液相色谱-串联质谱法1范围本规程规定了牛乳基婴幼儿配方乳粉和牛乳中 A1-酪蛋白(Al-Casein)、A2-酪蛋白(A2-Casin)的测定方法。本规程适用于牛乳基的婴幼儿配方乳粉和液态乳中 A1-酪蛋白、A2-酪蛋白含量的测定。不适用于发酵乳制品和含水解或酶解酪蛋白产品。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。3 术语和定义下列术语和定义适用于本文本。3.1A1-酪蛋白是-酪蛋白的一种变异体，其一级氨基酸序列中第67号位氨基酸为组氨酸。3.2A2-酪蛋白是-酪蛋白的一种变异体，其一级氨基酸序列中第67号位氨基酸为脯氨酸。4 方法原理试样中的牛-酪蛋白经尿素提取，二硫苏糖醇还原，碘乙酰胺烷基化，经胰蛋白酶酶解为肽段，经液相色谱-三重四级杆质谱测定，同位素内标法定量。5 试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T6682 规定的一级水。5.1 试剂5.1.1 碳酸氢钠(NaHCO3)。5.1.2 碳酸氢铵(NH4HCO3)。5.1.3 二硫苏糖醇(C4H10O2S2，DTT)。5.1.4 碘代乙酰胺(ICH2CONH2，IAA)。T/CITS 001220225.1.5 尿素。5.1.6 乙酸(CH3COOH)。5.1.7 甲酸(HCOOH):色谱纯。5.1.8 乙腈(CH3CN):色谱纯。5.1.9 碱性胰蛋白酶:活力大于 10000 BAEE 每毫克蛋白质。5.1.10 牛-酪蛋白标准品：纯度须准确标定，或经国家认证的标准物质。须依照附录 A 方法对牛-酪蛋白标准品中 A1-酪蛋白及 A2-酪蛋白含量进行测定。5.1.11 牛 A1-酪蛋白特异肽标准品(序列:IHPFAQTQSLVYPFPGPIHNSLPQNIPPLTQTPVVVPPFLQPEVMGVSK)，纯度不低于 90%。5.1.12 牛 A1-酪蛋白同位素标记特异肽标准品(序列:IHPFAQTQS(L*)VYPFPGPIHNS(L*)PQNIPP(L*)TQTPVVVPPF(L*)QPEVMGVSK)，纯度不低于 90%。5.1.13 牛 A2-酪蛋白特异肽标准品（序列:IHPFAQTQSLVYPFPGPIPNSLPQNIPPLTQTPVVVPPFLQPEVMGVSK)，纯度不低于 90%。5.1.14 牛 A2-酪蛋白同位素标记特异肽标准品(序列:IHPFAQTQS(L*)VYPFPGPIPNS(L*)PQNIPP(L*)TQTPVVVPPF(L*)QPEVMGV SK)，纯度不低于 90%。注：L*为同位素标记的亮氨酸(Leu-OH-13C6,15N7)。5.2 试剂配制5.2.1 碳酸氢钠溶液(100mmol/L)：称取 4.20g 碳酸氢钠，用水溶解后定容至 500mL。5.2.2 碳酸氢铵溶液(50mmol/L)：称取 3.95 g 碳酸氢铵，用水溶解后定容至 1L。5.2.3 碳酸氢铵溶液(500mmol/L)：称取 39.5 g 碳酸氢铵，用水溶解后定容至 1L。5.2.4 二硫苏糖醇溶液(500mmol/L)：称取 0.771g 二硫苏糖醇，用 50mmol/l 的碳酸氢铵溶液溶解后定容至 10mL。(烷基化实验时使用)5.2.5 碘代乙酰胺溶液(500mmol/L)：称取 0.925g 碘代乙酰胺，用 500mmol/L 的碳酸氢铵溶液溶解后定容至 10mL。(烷基化实验时使用)5.2.6 乙酸溶液(1%，V/V)：移取 0.1mL 乙酸，用水稀释并定容至 10mL。5.2.7 碱性胰蛋白酶溶液(1mg/mL)：称取 10mg 碱性胰蛋白酶，用 1%乙酸溶液溶解后定容至 10mL。5.2.8 甲酸水溶液(0.1%，V/V)：吸取 1mL 甲酸，用水稀释并定容至 1000mL。5.2.9 甲酸乙腈溶液(0.1%，V/V)：吸取 1mL 甲酸，用乙腈稀释并定容至 1000 mL。5.2.10 尿素(6mol/L)：称取 180g 尿素，加水溶解定容至 500mL。5.3 标准溶液配制5.3.1 牛-酪蛋白储备液(2 mg/mL)：准确称取牛-酪蛋白标准品 20 mg(精确至 0.01mg)牛A1-酪蛋白特异肽标准品，用水溶解后定容至 10mL。将溶液转移到塑料瓶中，置于-20冰箱内，可保存使用 6 个月。分装保存，避免反复冻融。5.3.2 牛 A1-酪蛋白特异肽标准储备溶液(500g/mL)：准确称取 5.00 mg(精确至 0.01mg)牛A1-酪蛋白特异肽标准品，用水溶解后定容至 10mL。将溶液转移到塑料瓶中，置于-20冰箱内，可保存使用 6 个月。分装保存，避免反复冻融。本储备液用于色谱及质谱条件建立。5.3.3 牛 A1-酪蛋白同位素标记特异肽标准储备溶液(500g/mL)：准确称取 5.00mg(精确至0.01mg)A1-酪蛋白同位素标记特异肽标准品，用水溶解后定容至 10mL。将溶液转移到塑料瓶中，于-20冰箱内，可保存使用 6 个月。分装保存，避免反复冻融。T/CITS 001220225.3.4 牛 A2-酪蛋白特异肽标准储备溶液(500g/mL)：准确称取 5.00mg(精确至 0.01mg)牛A2-酪蛋白特异肽标准品，用水溶解后定容至 10mL。将溶液转移到塑料瓶中，置于-20冰箱内，可保存使用 6 个月。分装保存，避免反复冻融。本储备液用于色谱及质谱条件建立。5.3.5 牛 A2-酪蛋白同位素标记特异肽标准储备溶液(500g/mL)：准确称取 5.00mg(精确至0.01mg)牛 A2-酪蛋白同位素标记特异肽标准品，用水溶解后定容至 10mL。将溶液转移到塑料瓶中，置于-20冰箱内，可保存 6 个月。分装保存，避免反复冻融。5.3.6 同位素标记特异肽混合中间溶液(50g/mL)：准确吸取 1mL 的牛 A1-酪蛋白同位素标记特异肽标准储备溶液，1mL 的牛 A2-酪蛋白同位素标记特异肽标准储备溶液，用水稀释并定容至 10mL。置于-20冰箱内，可保存使用 1 个月。分装保存，避免反复冻融。5.3.7 标准工作液的配制：分别吸取 0L、10 L、25 L、50 L、250 L、500 L、1 mL-酪蛋白储备液，用水定容至1 mL，配成浓度为0 mg/mL、0.02 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL 的-酪蛋白工作液，将-酪蛋白标准工作液各浓度乘以附录A 中求得的 A1-酪蛋白及 A2-酪蛋白占比，得到两种-酪蛋白的标准工作液浓度。临用前配制。6设备和材料6.1 高效液相色谱串联质谱仪：电喷雾离子源。6.2 天平:感量 0.01 g，0.01 mg。6.3 涡旋混合器。6.4 超声波振荡器。6.5 恒温水浴摇床。6.6 微孔滤膜:0.22m。7分析步骤7.1 试样制备7.1.1 液态奶:称取 1g(精确至 0.01g)试样，用 6mol/L 尿素定容至 25mL。7.1.2 乳粉:称取 1g(精确至 0.01g)试样，用 6mol/L 尿素定容至 100mL，超声溶解。7.2 试样烷基化与酶解吸取 100L 试样溶液，加入 50L 同位素标记特异肽混合中间溶液，780L 碳酸氢钠溶液和 10L 二硫苏糖醇溶液，涡旋混匀，70 恒温反应 30min。取出冷却至室温，加入 30L碘代乙酰胺溶液，涡旋混匀，暗处静置 30min 后加入 20L 碱性胰蛋白酶溶液，涡旋混匀，于 370.5恒温酶解 6h 后冷却至室温，取出加入 10L 甲酸混匀，室温静置 30 min，过 0.22m 滤膜于进样瓶中，供高效液相色谱-串联质谱仪检测。7.3 标准样品烷基化与酶解吸取 5.3.7 中各浓度标准工作液 100 L。分别为加入 50L 同位素标记特异肽混合中间溶液，100 L 的尿素溶液，680L 碳酸氢钠溶液和 10L 二硫苏糖醇溶液,涡旋混匀，70 恒温反应 30min。取出冷却至室温，加入 30L 碘代乙酰胺溶液，涡旋混匀，暗处静置 30min后加入 20L 碱性胰蛋白酶溶液，涡旋混匀，于 370.5恒温酶解 6h 后冷却至室温，加入10L 甲酸混匀，室温静置 30 min，过 0.22 m 滤膜于进样瓶中，供高效液相色谱-串联质谱仪检测。T/CITS 001220227.4 仪器参考条件7.4.1 液相色谱参考条件7.4.1.1 色谱柱：硅烷基 C18 柱，柱长 100 mm，内径 2.1 mm，粒径 1.7 m，孔径 30 nm(300)或等效者。7.4.1.2 流动相：流动相 A：0.1%甲酸水溶液；流动相 B：0.1%甲酸乙腈溶液。7.4.1.3 梯度洗脱：参考洗脱梯度参见表 1。7.4.1.4 流速：0.3 mL/min。7.4.1.5 柱温：40。7.4.1.6 进样体积：10L。表表1梯度洗脱程序梯度洗脱程序时间/min流动相 A/%流动相 B/%09551.09555.060405.501007.001007.595510.09557.4.2 质谱参考条件7.4.2.1离子源：电喷雾离子源（ESI+）。7.4.2.2 检测方式：多反应监测（MRM）。7.4.2.3 扫描方式：正离子模式扫描。7.4.2.4 鞘气温度：350。7.4.2.5 鞘气流速：12 L/min。7.4.2.6 喷嘴电压：200 V。7.4.2.7 雾化器压力：45 psi。7.4.2.8 毛细管电压：3500 V。7.4.2.9 干燥器温度：175。7.4.2.10 干燥器流速：11 L/min7.4.2.11 定性离子对、定量离子对及碰撞能量见表2表表2主要质谱参考条件主要质谱参考条件化合物母离子(m/z)子离子碎裂电压碰撞能量M+4H4+(m/z)VeV牛 A1-酪蛋白特异性肽段1340.8714.8*160301428.516030牛 A2-酪蛋白特1330.8714.8*16030T/CITS 00122022异性肽段1428.516030牛 A1-酪蛋白同位素特异性肽段1347.8718.4*16030牛 A2-酪蛋白同位素特异性肽段1337.8718.4*16030注：*为定量离子；不同质谱仪器，质谱参数条件可能存在差异，测定前应将质谱条件优化到最佳。7.5 试样溶液的测定7.5.1标准曲线的制作将7.3中已烷基化与酶解的标准系列工作液注入仪器中，测定相应肽段的峰面积。以A1-酪蛋白及A2-酪蛋白各特异性肽段与各自对应的同位素内标的峰面积比值为纵坐标，以A1-酪蛋白及A2-酪蛋白标准系列工作液浓度为横坐标，分别绘制A1-酪蛋白及A2-酪蛋白的标准曲线。A1-酪蛋白及A2-酪蛋白特异性肽段及对应同位素特异性肽段的多反应监测(MRM)色谱图参见附录B。7.5.2定性确证将待测样液依次进样。待测样液中目标化合物的色谱峰保留时间与标准工作液保留时间相比较，变化范围在2.5%之内。待测试样中目标化合物的两个子离子应出现，对同一化合物，试样中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当的标准工作液相比，其允许偏差不超过表3的规定范围，则可判断样品中存在对应的目标物。表表3定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度 k/(%)k5020k5010kk10允许最大偏差/(%)202530507.5.3定量检测将待测样液依次进样，得到试样中目标肽段与各内标肽段的峰面积比值，根据标准曲线得到测定中A1-酪蛋白及A2-酪蛋白的浓度。待测样液中液的待测物响应值应在标准曲线线性范围内，若含量超出线性范围，需将样品重新稀释后测定。8分析结果的表述=10.(1)式中:X-试样中牛 A1 或 A2-酪蛋白的含量，单位为克每百克(g/100g)；c-试样溶液中牛 A1-酪蛋白及 A2-酪蛋白的浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL)；V-试样的定容体积，单位为毫升(mL)；n-试样的稀释倍数；m-试样的质量，单位为克(g)；以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。T/CITS 001220229精密度在重复性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值，不得超过算术平均值的 15%。10灵敏度当称样量 1 g 时，本方法测定液态乳中牛 A1-酪蛋的定量限为 0.01g/100g，牛 A2-酪蛋的定量限为 0.025 g/100 g。当称样量 1 g 时，本方法测定婴幼儿配方乳粉中牛 A1-酪蛋的定量限为 0.04g/100g，牛 A2-酪蛋的定量限为 0.1 g/100g。T/CITS 00122022附录 A（资料性附录）牛-酪蛋白标准品中 A1、A2 含量的测定方法A.1 试剂A.1.1 乙腈：色谱纯。A.1.2 三氟乙酸：色谱纯。A.1.3 盐酸胍：分析纯。A.1.4 二硫苏糖醇：分析纯。A.1.5 二水合柠檬酸三钠：分析纯。A.1.6 三羟甲基氨基甲烷（Tris）：分析纯。A.1.7 盐酸：分析纯。A.1.8 氯化钠：分析纯。A.1.9Tris-HCl 缓冲液：称取 1.211 g 三羟甲基氨基甲烷，用 8mL 水溶解后用盐酸调节 pH至 8.5 后，转移至 10 mL 容量瓶中，用水定容至刻度。也可直接采用商业化试剂。A.1.10TBS溶液：称取0.9 g氯化钠，用10 mL水溶解后转移至100 mL容量瓶中；将Tris-HCl缓冲液全量全量转移至该容量瓶中，用水定容至刻度。也可直接采用商业化试剂。A.1.11 牛-酪蛋白标准品。A.1.12 牛 A1-酪蛋白储备液(400g/mL)：取适量纯化牛 A1-酪蛋白，加入 50 L TBS 溶液(pH=8.5)，溶解混匀。于-20保存。可保存使用 6 个月。A.1.13 牛 A2-酪蛋白储备液(400 g/mL)：取适量纯化牛 A2-酪蛋白，加入 50 LTBS 溶液(pH=8.5)，溶解混匀。于-20保存。可保存使用 6 个月。A.1.14 缓冲试剂：分别称取盐酸胍 5.732g，二硫苏糖醇 0.309g，二水合柠檬酸三钠 0.147g于 10mL 容量瓶中，用水定容，混匀。A.1.15 流动相 A：量取 1 mL 三氟乙酸，用水定容至 1L。A.1.16 流动相 B：量取 1 mL 三氟乙酸，用 80%乙腈-水溶液定容至 1L。A.2 标准溶液配制A.2.1-酪蛋白标准储液（100mg/mL）：准确称取 100 mg-酪蛋白标准品（精确至 0.1mg）,用缓冲试剂定容至 1mL。A.2.2-酪蛋白中间液（1 mg/mL）：量取-酪蛋白标准储液 10 L,用缓冲试剂定容至 1mL。A.2.3-酪蛋白测定液（20g/mL）：量取-酪蛋白中间液 10 L,用缓冲试剂定容至 1mL。A.2.4A1-酪蛋白中间液（20g/mL）：取牛 A1-酪蛋白储备液 50 L，用缓冲试剂定容至 1mL。A.2.5A1-酪蛋白工作液（10g/mL）：取牛 A1-酪蛋白中间液 250 L，加入 250 L 缓冲试剂。A.2.6A2-酪蛋白中间液（20g/mL）：取牛 A1-酪蛋白储备液 50 L，用缓冲试剂定容至 1mL。A.2.7A2-酪蛋白工作液（10g/mL）：取牛 A2-酪蛋白中间液 250 L，加入 250 L 缓冲试剂。A.3 仪器和设备T/CITS 00122022A.3.1 高效液相色谱仪：高灵敏紫外检测器。A.3.2 涡旋混合器。A.4 参考色谱条件A.4.1 色谱柱：Discover BIO Wide PoreC18-5(250 mm4.6 mm，5m)或等效色谱柱。A.4.2 柱温：50A.4.3 检测波长：215 nm。A.4.4 流速：0.8 mL/min。A.4.5 进样量：50LA.4.6 梯度洗脱，参考洗脱条件见表 A.1表表 A.1 参考洗脱条件参考洗脱条件时间/min流动相 A/%流动相 B/%0356573565175050285545356238369010609010703565A.5 分析步骤及结果表达A.5.1 标准曲线分别将 A1-酪蛋白中间液、A1-酪蛋白工作液、A2-酪蛋白中间液及 A2-酪蛋白工作液注入高效液相色谱。以 A1及 A2-酪蛋白浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。A.5.2 定性及定量分析将-酪蛋白测定液注入高效液相色谱中。根据标准品的保留时间，与待测-酪蛋白测定液中组分的保留时间进行定性，色谱图参见图 A.1。将测定得到的各组分峰面积，根据标准工作液得到-酪蛋白测定液中 A1、A2 的浓度，即得到 20g/mL-酪蛋白测定液中，A1 及 A2-酪蛋白的浓度。A.5.3 牛-酪蛋白标准品中 A1、A2 的质量百分数的表达T/CITS 00122022=20 100%式中：Xi牛-酪蛋白标准品中 A1、A2 的质量百分数，单位为克每百克(g/100g)；Ci根据标准曲线求得的-酪蛋白测定液中 A1、A2 的浓度；20的-酪蛋白测定液中-酪蛋白的浓度。图 A.1 A1、A2-酪蛋白中色谱图T/CITS 00122022附录B（资料性附录）标准溶液色谱图A1、A2-酪蛋白特异性肽段及同位素特异性肽段特征离子的提取离子流图见图B.1图 B.1A1、A2-酪蛋白特异性肽段及同位素特异性肽段特征离子的提取离子流图（酪蛋白浓度为 2 mg/ml）