T_GDPMAA 0012-2023 高通量基因测序项目分类.docx

ICS 01.040.11C 30T/GDPMAA广东 省精准 医学 应用学 会团体 标准T/GDPMAA 00122023高通量基因测序项目分类The Classification Criteria of High Through-put Gene Sequencing Projects（发布稿）（本稿完成时间：2023-6-7）2023-7-22 发布2023-7-22 实施广东省精准医学应用学会 发布T/GDPMAA 00122023广东省精准医学应用学会（GDPMAA）是广东省组织开展精准医学学术交流、国际交流、人才培养、 出版刊物、科技创新、产学研相结合等活动的省级社会团体。制定广东省精准医学应用学会标准（以下简称：粤精准医标准），满足企业需要，推动企业标准化工作，是广东省精准医学应用学会的工作内容之一。中国境内的团体和个人，均可提出制、修订粤精准医标准的建议并参与有关工作。粤精准医标准按广东省精准医学应用学会团体标准管理办法(试行)进行制定和管理。粤精准医标准草案经向社会公开征求意见，并得到参加审定会议的75%以上的专家、成员的投票赞 同，方可作为粤精准医标准予以发布。考虑到本标准中的某些条款可能涉及专利权，广东省精准医学应用学会不负责对任何该类专利权的 鉴别。在本标准实施过程中，如发现需要修改或补充之处，请将意见和有关资料寄给广东省精准医学应用 学会，以便修订时参考。该标准为广东省精准医学应用学会制定，其版权为广东省精准医学应用学会所有。除了用于国家法律或 事先得到广东省精准医学应用学会文字上的许可外，不许以任何形式再复制该标准。广东省精准医学应用学会地址：广东省广州市越秀区天河路 45-21 号邮政编码：510075 电话：[phone] 传真：[phone]网址：电子信箱：pmT/GDPMAA 00122023目次前言II引言III1 范围12 规范性引用文件13 术语和定义14 缩略词35 高通量基因测序项目的综述36 高通量基因测序项目分类46.1 核酸提取项目及其分类46.2 样本采集项目及其分类56.3 测序项目及其分类57 高通量基因测序检测项目的技术分类77.1 样本准备77.2 测序文库构建77.3 测序87.4 数据分析97.5 结果报告和咨询97.6 质量控制108 高通量基因测序在肿瘤领域的应用分类108.1 DNA 测序108.2 RNA 测序139 高通量基因测序在遗传领域中的应用分类139.1 组织 DNA 测序139.2 单细胞 DNA 测序159.3 细胞外游离 DNA 测序1610 高通量基因测序在感染与微生物领域的应用分类1710.1 病原宏基因组下一代测序1710.2 病原靶向下一代测序1911 高通量基因测序在临床其它领域的应用1911.1 药物基因组学的临床检测1911.2 移植配型2011.3 白血病的诊断20参 考 文 献21IT/GDPMAA 00122023前言本标准按GB/T 1.1-2020给出的规则起草。本标准由广东省精准医学应用学会提出并归口。本标准起草单位：中山大学孙逸仙纪念医院、中山大学附属第一医院、中山大学附属第三医院、南方医科大学珠江医院、南方医科大学南方医院、广东省人民医院、广州医科大学附属第一医院、广州医科大学附属第二医院、暨南大学附属第一医院、广东省中医院、广东省公共卫生研究院、因美纳（中国） 科学器材有限公司、北京泛生子基因科技有限公司、北京贝瑞和康生物技术有限公司、深圳华大基因股份有限公司、广州达安基因股份有限公司。本标准主要起草人：欧阳能太、廖健伟、杨剑锋、章钧、周宏伟、柯尊富、侯铁英、郑磊、刘世霆、黄宪章、刘艳辉、 陆元志、蔡贞、林勇平、熊丽、张凤玲、赵智贤、蒋析文、陈定强、莫立乾、李淑华、段朝晖、周强、 姜萍萍、钟晶、曾凡薇、栗东芳、殷晓燕、李沛志、梁蕊、罗镇明、马山、梁志坤、周建文、石永杰、 何群、张婉君。本标准是首次制订。IIT/GDPMAA 00122023引言随着精准医学的发展，作为精准医学领域核心技术的高通量基因测序（又称二代测序、下一代测序、NGS）技术近些年来逐渐兴起，已越来越广泛地应用于临床实践，特别是在肿瘤个体化治疗、遗传性疾 病、感染性疾病和药物基因组学等多个领域已取得了长足的进步。高通量基因测序的平台、技术、产品，也得到了长足发展，呈纷繁复杂之势。但对于高通量测序的 项目分类，目前还没有统一标准。高通量基因测序项目分类的缺失，不利于政府监管部门对这一新技术进行的分类监管，不利于推进 技术规范应用；不利对于高通量检测进行分类的成本核算，不利于定价机制的合理形成；不利于研发企 业部署产品研发线路，研发新技术、新产品。因此，为了推进、规范和促进高通量基因测序技术应用，我们亟需规范对高通量基因测序检测项目 在临床应用上的分类，并明确有关类别，从而推动相关技术的价格形成机制研究，明确相关项目的定价 逻辑和定价参考标准，为行业内的应用方、研发方等提供清晰的指引，助力提升医疗保障水平。IIIT/GDPMAA 00122023高通量基因测序项目分类1 范围本标准规定了高通量基因测序检测项目在临床应用中的分类原则和分类类别。本标准适用于规范高通量基因测序检测在临床应用中的分类，指导有关高通量基因测序检测在临床 应用中的研发、定价和推广。本标准适用于临床医学领域中涉及高通量基因测序项目研发和应用的医疗卫生机构、第三方检测机 构、技术研发企业等。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 29859-2013 生物信息学术语GB/T 34798-2017 核酸数据库序列格式规范GB/T 35890-2018 高通量测序数据序列格式规范GB/T 30989-2014 高通量基因测序技术规程T/GDPMAA 0004-2020 基于孕妇外周血浆游离DNA高通量测序无创产前筛查胎儿基因组病技术标准3 术语和定义3.1高通量测序（High-throughput sequencing）也称为下一代测序技术(next-generation sequencing, NGS)，指通过大规模平行测序等技术对包括人类外显子或者全基因组序列等进行测序，同时产生数千条至数百万条测序片段，然后通过生物信息处理与标准参考基因组序列比对等，得到序列变异、融合、拷贝数变异(copy number variants, CNV) 等信息。3.2全基因组测序（Whole genome sequencing, WGS）对人类基因组的全序列进行测序，包含基因外显子区域与非编码区域。3.3外显子组测序（Whole exome sequencing, WES）指针对人类基因组全部蛋白质编码区域（外显子组）的基因集进行高通量测序。目前，全外显子测序已应用于单基因遗传病疾病、复杂罕见病、肿瘤用药指导等。3.4靶 向 测 序 （Targeted sequencing / Target region sequencing）指针对某一类疾病（或表型）已知的致病基因及关联基因或已知的驱动基因或抑癌基因或已知的致病性病原微生物基因或耐药基因对应的序列进行高通量测序检测。靶向测序包含除全基因组测序外的其他目标区域测序。1T/GDPMAA 001220233.5实体瘤靶向测序（Targeted sequencing of solid tumor）3.5.1 肿瘤大 panel 测序（Large solid tumor gene panel）指实体瘤相关的驱动基因或抑癌基因，重要信号通路基因对应的序列进行高通量测序检测，该检测同时需要满足肿瘤突变负荷（Tumor mutation burden, TMB）检测要求：检测范围包含 300 个以上基因且检测 panel 编码区域大于等于 1.0Mb。3.5.2 中 panel 测 序 (Medium solid tumor gene panel)指检测范围在 100-300 个实体瘤相关的驱动基因或抑癌基因，重要信号通路基因对应的序列进行高通量测序检测。3.5.3 小 panel 测 序 (Small solid tumor gene panel)指检测范围在100 个实体瘤相关的驱动基因或抑癌基因对应的序列进行高通量测序检测。3.5.4 肿瘤循环 DNA 测序 (Circulating tumor DNA sequencing)通过高通量测序技术针对血液中游离的肿瘤 DNA 片段进行测序，获取肿瘤的相关基因组信息。ctDNA 测序技术可以应用于肿瘤的早期诊断，肿瘤精准用药指导，耐药机制评估以及预后评估和复发监测。3.6无创产前筛查（Non-invasive prenatal testing, NIPT）针对胎儿 21、18、13 三体综合征，通过母血浆中胎儿游离 DNA 片段进行高通量测序检测。3.7基因组拷贝数变异测序 (Copy number variation sequencing，CNV-Seq)基于高通量测序的低深度全基因组测序，针对不同样本来源（如羊水、绒毛、脐带血、流产组织、外周血等）进行染色体拷贝数变异检测。3.8胚胎植入前非整倍体检测（Preimplantation genetic testing for aneuploidies, PGT-A）指在接受辅助生殖技术治疗的患者中，对胚胎滋养层细胞进行活检获取细胞利用高通量测序技术针 对胚胎细胞进行染色体非整倍体检测，选择性植入正常胚胎，避免因异常胚胎造成的反复种植失败、反 复流产、出生缺陷等。3.9胚胎植入前染色体结构异常检测（Preimplantation genetic testing for structural chromosomalrearrangements, PGT-SR）指在接受辅助生殖技术治疗的患者中，对胚胎滋养层细胞进行活检获取细胞利用高通量测序技术针 对胚胎细胞进行染色体结构异常进行检测。针对夫妻双方之一为染色体结构异常携带者。3.10植入前单基因遗传病检测（Preimplantation genetic testing for monogenic disorders，PGT-M）指在胚胎移植前，对胚胎滋养层细胞进行活检获取细胞，利用高通量测序技术针对胚胎细胞进行单 基因遗传疾病的基因变异进行检测，降低单基因病出生缺陷风险。3.11宏基因组高通量测序（Metagenomic nextgeneration sequencing, mNGS）指通过对临床样本中微生物和宿主核酸的测序分析，无偏倚地检测多种病原微生物。3.12测序深度（Sequencing depth）指在一次测序实验中对特定基因组区域或整个基因组的测序覆盖度。通常以倍为单位来表示，如 100表示该基因组区域或整个基因组的碱基被测序 100 次。2T/GDPMAA 001220233.12.1 平均测序深度（Mean depth）指针对所检测区域测序所得的碱基总数除以该区域的长度。3.12.2 有效平均测序深度指去重后的平均测序深度。3.13体细胞变异（Somatic variant）指肿瘤细胞中发生的基因组变异，是后天发生的，而不是遗传所得。3.14胚系变异（Germline variant）指存在于生殖细胞中的基因组变异，这种变异会遗传给后代。与体细胞变异不同，胚系变异发生在 胚胎发育过程中，或者在父母的生殖细胞中。4 缩略词cfDNA游离脱氧核糖核酸(Cell free deoxyribonucleic acid)ctDNA肿瘤循环脱氧核糖核酸（Circulating tumor deoxyribonucleic acid)CNV拷贝数变异（Copy number variation）cPAS联合探针锚定聚合（Combinatorial probe-anchor synthesis） CV变异系数（Coefficient of variation）MSI微卫星不稳定性（Micro-satellite instability） NGS下一代测序（Next generation sequencing） PCR聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction) QC质量控制（Quality control）SBS边合成边测序（Sequence by synthesis） TMB肿瘤突变负荷（Tumor mutation burden） WES外显子组测序（Whole exome sequencing） WGS全基因组测序（Whole genome sequencing）mNGS靶向宏基因组测序（Metagenomic next generation sequencing） tNGS靶向下一代测序（Target next generation sequencing）5 高通量基因测序项目的综述自从人类基因组计划完成，以下一代基因测序（next generation sequencing, NGS）或二代测序、高通量基因测序为代表的新型技术不断涌现，基于基因解码的精准医学在短期内得到了蓬勃发展。NGS 项目可从临床应用、技术原理及样本类型等方面进行分类（图 1）。其中，NGS 项目的临床应用主要包括以下几方面：（1） 肿瘤：1.目的为靶向用药的检测，项目有实体瘤的几个基因、几十个基因到几百个基因的 panel，变异类型包括单碱基变异、小插入/缺失、大片段缺失/重复、拷贝数变异等，几百个基因的大panel 还要求能报告肿瘤突变负荷（tumor mutation burden, TMB），测序深度通常设置为 1000左右。另外，在组织不可及时也可以采用外周血检测 ctDNA，需要提升测序深度至 5000左右；2.目的为肿瘤预后与诊断的检测，这方面比较复杂，通常采用中到大的 panel；3.目的为治疗后复发监测的检测， 主要是 ctDNA-MRD 检测，需要超高测序深度，如几万至十万乘。（2） 遗传与代谢：1.儿童遗传或代谢疾病的基因诊断，主要是胚系的基因检测，目前较常用的项目有中小 panel 基因、医学全外显子组（约 4 千多基因）和全外显子组（2 万多基因）检测，测序深度通常为 100左右；2.无创产前筛查（noninvasive prenatal testing，NIPT），通过母亲外周血检测胎儿染色3T/GDPMAA 00122023体非整倍体，主要是 21-三体、18-三体和 13-三体，是通过对全基因组层面超低深度测序而计算获得；3. 产前全外显子组检测，与儿童遗传全外相同，但因胎儿表型很难提取而致解读困难，适用范围需严格控制；4.生殖领域胚胎植入前的遗传基因筛查与诊断。（3） 病原微生物：临床最主要的应用项目是宏基因组测序和病原微生物靶向测序，包括 DNA 和RNA 病原微生物，可不需要培养，直接从样本中提取核酸进行测序鉴定，在临床应用具有很大的优势。但由于很多样本中含有大量的人类基因组和定植菌，在结果解读时经验很重要。（4） 其它领域：包括药物基因组学、白血病和移植配型等领域也已开始应用 NGS 技术进行更加全面的基因谱检测以指导临床诊疗。图 1 高通量基因测序项目分类原理示意图6 高通量基因测序项目分类高通量基因测序项目的各环节中，因应样本的差异、检测目标的差异，实际上在核酸提取、样本收 集、生信及病理分析等步骤中存在较大差异，鉴于此，本标准将核酸提取、样本收集等环节单独作为高 通量基因测序的大类项目先行划分，再对测序环节及分析环节进行项目分类归纳。6.1 核酸提取项目及其分类按照待提取核酸类型的不同，其提取工艺、技术、成本等将存在差异，建议分类如下：4T/GDPMAA 00122023表 1 核酸提取项目分类表类型提取工艺备注DNADNA 的提取制备-RNARNA 的提取制备逆转录的步骤以及对 RNA 酶的预防其它特殊类型核酸宏基因组、表观修饰的 DNA 或 RNA、tRNA、或通过指定技术手段获得的基因组片段（如三维基因组等）提取工艺的复杂程度须依据具体检测对象而定对于核酸提取项目的收费标准，建议按上述项目差异进行分类区分，依据对应的核酸提取工艺的成 本核算情况进行计算。6.2 样本采集项目及其分类按照待处理的样本类型，其采集工艺、技术、成本等将存在差异，建议分类如下：表 2 样本采集项目分类表类型来源采集及处理方式胚系细胞外周血白细胞、口腔上皮细胞等抽血、口腔取样、毛发采集等组织细胞特定组织，包括正常组织和病变组织手术、抽血等游离核酸外周血中的细胞外游离核酸抽血或取腔隙体液+靶向富集宏基因组目标组织中的微生物菌群-对于样本采集项目的收费标准，建议按上述项目差异进行分类区分，依据对应的样本采集及处理工 艺的成本核算情况进行计算。6.3 测序项目及其分类鉴于测序过程中，其检测范围与建库工艺相关联，其数据量、测序深度与测序通量对应的芯片规格 相关联，同时其分析难度与具体分析要求相关联，因此我们建议，按测序的范围差异、数据量差异、数 据分析要求差异等范畴进行分类。对于测序环节的项目收费标准，建议按上述项目差异进行分类区分，X1/X2/Y/Z 代表不同分类要求的收费单价，依据对应的测序参数、工艺、分析需求等的成本核算情况进行计算。其中，全基因组测序 范围最广，位点最多，宜按次为基准进行价格核算，靶向测序宜以位点进行价格核算；同时，根据数据 量和测序深度的差异，宜按测序通量为基准进行价格核算；另外，人工数据分析方面包括质控、数据处 理、病理分析等环节，宜在对应人力资源成本基础上按工时核算。项目分类结果详见以下表格。5T/GDPMAA 00122023表 3 高通量基因测序项目分类表项目名称应用领域具体项目按测序范围差异（建库工艺差异）按数据量/测序深度差异（通量差异）按数据分析要求差异（ 含质控、序列数据处理、样本病理评估）全基因组低数据量二代测序染色体非整倍体、拷贝数变异NIPT、PGT-A、NIPTplus 、筛查、拷贝数变异检测、病原微生物宏基因检CNV-Seq、病原微生物宏基因组检测全基因组测序（ 按 X1/ 次 收费）测，进行病原微生物鉴定全基因组高数据量二代测序遗传性疾病全基因组检测、病变组织全基因诊疗明确相关特定基因、特定位点分析、罕见全基因组测序（ 按 X1/ 次 收费）组检测变异、 复杂变异、染色体结构变异、突变谱等分析靶向小 panel 低数据量二代测序目标组织的特异性基因检测， 须包含相关专业的临床生信分析用药检测、单基因/ 多基因遗传位点检测、基因包 检 测 、PGT-SR 、PGT-M靶 向 测 序 小panel （ 100 基因，按 X2/位点收费）靶向小 panel 高数据量二代测序细 胞 外 游 离DNA 的临床诊疗相关基因检测，须包含相关用药检测（ 微创、无创取样）靶 向 测 序 小panel （ 300 基因WES 等，按X2/位点收费)床生信分析6T/GDPMAA 001220237 高通量基因测序检测项目的技术分类高通量测序实验过程主要包括样本准备、测序文库构建、上机测序和数据分析四个步骤。针对需要解决的临床问题和测序目的，在送检样本类型、样本处理、文库构建方式、测序平台选择和参数要求、 以及数据分析等步骤均有不同的需求。7.1 样本准备本部分实验的目的是从各种类型的送检样本中提取高质量和足够量的核酸以确保后续测序步骤的有效进行。7.1.1 样本类型NGS 的临床应用领域广泛，根据需解决的临床问题，可测定各种类型样本，包括固定/新鲜组织、血液、尿液等各种体液、肺泡灌洗液、分泌物、脱落细胞等。7.1.2 样本预处理根据具体的测序目的，有些类型的样本有特殊的采样或送检要求，或在进行核酸提取步骤前需经过 适当的预处理步骤。如在进行肿瘤游离 DNA 高通量测序时，由于血浆中 ctDNA 含量极低，为减少有核血细胞分解释放细胞基因组 DNA 带来的干扰，建议使用专用的血浆游离 DNA 样本采集管；进行肿瘤组织高通量测序时，在处理样本前应先进行 HE 染色评估肿瘤细胞的含量，确保其中肿瘤细胞比例 20%；如为石蜡组织切片，还需进行彻底脱蜡后再进行常规提取；在进行 mNGS 病原体高通量测序， 对于胸腹水、引流液、或新鲜组织等高人源样本还应考虑去宿主以提高某些微生物检测的灵敏度；对于细胞壁较厚的病原体如分枝杆菌或真菌，需要用特殊的破壁方法。7.1.3 核酸提取核酸提取方式主要分为溶液型抽提、柱式抽提和磁珠纯化法三类，实验室应充分评估各提取方式或 试剂的性能，根据不同样本类型和测序目的选择不同的方式或试剂进行提取。例如，DNA 和 RNA 在理化性质上存在差异，通常采用不同的试剂盒分别提取 DNA 或 RNA；对于样本质量差，存在降解的样本（如 FFPE 样本）还需要选用商业试剂盒进行修复。7.1.4 核酸质量评估提取后应对核酸质量进行验证，验证指标至少包括核酸完整性和得率。7.2 测序文库构建文库构建是将待测 DNA 分子连上特定的检测接头序列的过程，测序引物、分子标签及扩增引物等序列均以接头序列的形式固定在待测分子的 5和 3两端，制备好的高通量测序文库包括连有相应接头的一系列 DNA 片段。选择合适的文库构建方法可以避免上机样本出现较大偏倚，从而尽可能地减少测序误差。以 DNA 建库为例，建库流程一般包括核酸片段化、接头连接、分选纯化、文库扩增等环节。根据不同的测序目的，建库方式又可分为随机测序建库和目标区域测序建库。建库方式选择主要依据临 床预期用途，具体见后续应用分类章节。7.2.1 核酸片段化核酸提取后需要对核酸进行片段化，以满足不同建库方式及不同测序策略需求。常用的片段化方法 主要有机械打断法（超声打断、雾化等）和酶切法。7.2.2 全基因组测序文库构建全基因组测序（Whole Genome Sequencing，WGS）是指对生物体整个基因组序列进行测序，可7T/GDPMAA 00122023获得完整的基因组信息。全基因组测序采用随机建库策略，根据文库制备过程中是否需要进行 PCR 扩增富集，可分为含有 PCR 扩增和 PCR-free 两种文库制备方案。应用场景：全基因组测序结果包含完整的基因信息，在鉴定单核苷酸变异、拷贝数变异、插入/缺失变等变异类型具有优势。7.2.3 目标区域测序文库构建目标区域测序（Target Region Sequencing，TRS）是通过探针杂交捕获法或多重 PCR 方法将目标区域 DNA 富集后进行高通量测序的方法。该方法能够获得目标区域的遗传信息，可提高基因组中特定区域的检测效率，显著降低检测成本。7.2.3.1 探针杂交捕获在全基因组文库基础上，基于碱基互补配对原理，设计合成核酸探针，对目标区域进行杂交富集后进行测序。根据目标区域的大小范围分为全外显子测序文库、几十到上千个基因外显子区域测序文库、 突变热点区域测序文库。应用场景：适合目标区域范围较大的测序策略，如：外显子组测序，大 panel 检测等。7.2.3.2 扩增子建库设计多重 PCR 引物进行扩增富集目标区域并进行测序的技术。通常适用于检测几十到几千个位点， 或几十 kb 以下的区域，成本较低。应用场景：适合目标区域范围较小的测序策略，如 BRCA1/2 基因检测，几十个基因的突变热点检测等。7.2.4 RNA 测序文库构建相较于DNA 文库构建，RNA 提取完成后首先需要通过随机引物和逆转录酶作用下逆转录成cDNA，再进行下一步的文库构建。RNA 文库构建根据检测范围也分为转录组测序文库和目标区域测序文库。7.2.5 文库质量评估在高通量测序过程中，文库质量直接影响测序数据的准确性和完整性。完成文库构建后应对构建的 文库进行质量评估。主要的文库质控指标为文库片段大小和文库浓度评估，除此之外，还应包括文库转 化率、文库复杂度、均一性、准确性等。7.3 测序7.3.1 测序方法目前主流的高通量测序技术包括可逆末端终止子测序技术、联合探针锚定聚合测序技术，以及离子 半导体法测序技术。测序方法的选择主要取决于需解决的临床问题，结合测序通量、测序准确性、测度 读长、测序周期、测序成本等综合考虑。7.3.2 测序数据质量评价指标测序数据的质量会影响下游数据分析，由于目前的高通量测序技术均有一定的错误率，因此在进行 分析前需要对测序数据进行质量评价，并进行适当地过滤和筛选以提高数据质量。7.3.2.1 碱基质量值：是衡量测序质量的重要指标，用于评估下机序列数的准确度，常以 Q20 和 Q30 表示。7.3.2.2 序列碱基分布和 GC 含量：序列 GC 含量可以协助判断测序过程是否存在明显的序列偏向性。人类基因组 GC 含量为 40左右，如果测序原始数据 GC 含量出现较大偏离提示基因组中某些特定区域反复测序的几率高于平均水平，提示测序文库污染，或其他偏倚的存在。7.3.2.3 序列重复水平：正常文库内序列的多样性水平很高，大多数的序列应该只出现一次。如果多 次重复出现，提示存在一定程度的富集偏倚或测序文库污染。8T/GDPMAA 001220237.4 数据分析生物信息分析是是对测序得到的原始序列进行数据分析和处理并得到分析结果的过程，对于 NGS 检测结果的准确性有决定性意义。目前尚没有标准化的生物信息学分析流程，实验室需根据预期检测目 的，选择适合的软件、算法和生物数据库，根据检测方法特点及预期用途设立必要的质量控制标准，建 立本实验室生物信息学分析流程，并进行性能验证。每个步骤都必须仔细评估数据处理的准确性和完整 性，确保达到预期性能。7.4.1 数据分析流程一般包括原始测序数据预处理和质量控制、序列比对及变异识别、变异注释或物种鉴定、结果判定 及报告几个关键步骤。7.4.1.1 原始测序数据质量评估和数据预处理高通量测序产生的图像信息一般由相应测序平台提供的软件转化为原始序列数据，原始数据需要进行质量评估（主要指标参见 7.3.2），并进行标签识别、接头及低质量序列过滤、去除冗余重复序列等预处理。7.4.1.2 序列比对及变异识别序列比对指通过生物信息学分析软件将测得序列与参考基因组进行比对，得到每一条序列在参考基因组上的位置信息，并完成排序。在去除重复序列（多重扩增子测序数据除外），进行必要的质控评估（如比对率、平均测序深度与测序深度均一性）后，可通过生物信息学分析对 SNV、Indel 等变异进行识别。实验室应有必要的数据质控并根据实验室建立的标准进行数据过滤，以减少假阳性和假阴性结 果。变异识别的灵敏度取决于测序数据和参考数据的质量及所采用的算法。7.4.1.3 变异注释比对分析后识别的变异数据需通过各种变异信息数据库对检出变异从不同层面进行注释，完成后续分析和解读，通过注释信息获得变异位点的临床意义，锁定可能的致病变异来指导临床诊断和治疗。 变异注释信息包括变异类型、变异位点与疾病关联注释、变异危害性预测等。注释信息应该按照标准命名法对检出变异进行统一命名注释列出，对变异的分类和注释也应遵循相关专业的指南或行业标准。7.4.2 硬件及软件配置7.4.2.1 硬件需求高通量测序检测产生数据规模庞大，信息分析计算高度复杂，实验室需配备高性能处理速度的计算 机服务器确保完成批量样本的并行分析，并且需要根据实验室样本规模、数据存储要求、存储时间等保 留有足够空间储存患者信息和序列数据。7.4.2.2 软件需求生物信息分析各个流程均有多种算法，需要多种软件，目前尚无标准化的统一生物信息分析流程。 实验室需根据需要选择不同的开源软件、商业付费软件、自建软件等或构成软件组合用于各步骤分析。7.4.2.3 数据库高通量测序的生物信息学分析的各个分析环节均需要借助相应的生物信息学数据库和分析工具。实 验室需使用标准化数据对使用数据库的精确性和准确性进行评估，并持续跟踪数据库的更新，确保数据 的准确性和可重复性。除利用公共数据库和商业数据库，实验室还有必要根据检测需求建立实验室内部 数据库，如肿瘤体细胞变异检测数据库、宏基因组测序实验室的背景数据库、病原体解读数据库等。7.4.3 人员要求生物信息学分析团队成员需具备生物信息学专业知识，熟悉各种数据分析软件的使用方法及功能， 还应同时具有医学、分子生物学、临床实验室基本知识，并且视不同临床应用场景，包括具有遗传学、 肿瘤学、临床微生物学或药理学相关专业知识团队成员。生物信息学分析团队应接受持续培训，能够及时更新知识，熟悉相关领域最新进展。7.5 结果报告和咨询高通量测序结果报告和解释也是保证检测质量的重要环节。报告中除应具备一般实验室报告的要素， 还应包括特定信息，包括检测方法、关键质控信息、测序结果的报告和解释、进一步检测建议等。实验室应根据各项专业指南的变异分级标准建立变异类型报告的标准和原则，报告中变异位点需符9T/GDPMAA 00122023合国际参考命名委员会制定标准，对检出变异根据临床意义进行分类描述，如引用参考文献进行结果解释，需要在报告单中注明参考文献来源。报告签发需要检测人、审核人、结果解读人员共同签字。必要情况下，针对遗传性肿瘤、肿瘤个体化用药、遗传变异等还需提供报告咨询服务和进一步检测的建议。7.6 质量控制高通量测序实验步骤繁多，流程复杂，影响因素多，实验过程处理不当极容易导致检测结果异常。 为了确保整个实验工作流程的分析准确性，实验室应建立全面的质量控制体系。7.6.1 全流程质量控制对于不同临床应用目的和不同类型样本，测序平台和生物信息分析流程的检测能力存在差异。在 应用到临床检测之前，必须首先完成从样本前处理到生物信息学分析整个检测系统全流程分析性能确认， 至少应包括检测准确度、精密度、分析特异性、及临床性能确认等。临床性能确认通过患者人群研究得到，应包括临床敏感性，特异性，阳性预测值与阴性预测值。7.6.2 室内质控7.6.2.1 NGS 质量控制要点高通量测序实验全流程包括实验标本的预处理、核酸提取及其片段化、建库、扩增、靶序列富集、 混样、测序前准备及测序，测序后的数据分析、对比、注释和结果报告等生物信息学分析流程。实验室应针对测序检测全流程的各个步骤建立质量控制指标及参数，其中关键质控点为：核酸样本的质量评估； 文库构建的质量控制；测序数据的质量评价。实验室应建立检测全流程各步骤的质量控制指标及参数， 测序流程各环节质量控制：见 7.1.4；7.2.5；7.3.2。7.6.2.2 室内质量控制高通量测序日常检测中应设置弱阳性、阴性和无模板对照等质控品，与临床样本同批进行检测，以 监测检测质量及当批临床样本检测的有效性。理想的弱阳性质控品应接近检测下限，实验室可根据检测 项目和检测平台制定相应的可接受的质控标准，这是对实验室测定的即时性评价，在室内质量控制与改 进中不可或缺。一旦出现失控，应分析失控原因，并采取相应的纠正和预防措施。7.6.2.3 室间质量评价开展高通量测序的实验室应定期参加室间质量评价（EQA）或能力验证(PT)，也可以采取实验室间 比对以检测和评估检测结果的准确性和可比性，并保存室间质量评价或实验室室间比对记录，对不合格 的结果应进行原因分析，并采取质量改进措施。8 高通量基因测序在肿瘤领域的应用分类8.1 DNA 测序8.1.1 正常细胞 DNA 测序遗传性肿瘤检测针对的