遗传实验报告骨髓.doc

实验七 小鼠骨髓细胞染色体标本的制备和观察

生64 王攀 2006030026
同组实验人：池月 实验日期：2008年11月3日
一、 实验目的
1、解利用动物骨髓进行细胞染色体制片的一般方法，比较与其他制片方法的区别。
2、正确掌握细胞收集、低渗、滴片等技术手段，观察和了解小鼠染色体的数目及形态特征。

二、 实验原理
染色体的数目及形态特征在一个物种内是相对稳定的，染色体上的基因决定了一个物种生长发育的全部信息。因此通过染色体分析，可以了解某一物种最基本的遗传指标。进行染色体标本的制备一般取自细胞分裂旺盛的组织，如骨髓、淋巴细胞以及通过人工培养的悬浮液。动物的骨髓是重要的造血器官，它通过细胞分裂不断补充体内的需要，如将秋水仙素注射到动物的腹腔内，经肠系膜吸收并可转运到骨髓，结果使正在分裂的细胞不能形成纺锤体，使得染色体停在中期状态，经过处理和制片后就可以清楚地观察到染色体。这种制片方法虽然也经过许多步骤，但是效果非常好。而且省去了细胞培养的阶段，可以获得大量分裂细胞，但是属于侵害性的，因此这种方法适用于动物来源丰富、动物个体较小的材料。

三、 实验仪器、材料和用具
实验材料
体重20克左右的小鼠一只
仪器用具
恒温水浴槽、离心管2支、刀片、解剖盘、解剖剪、镊子、离心机、光学显微镜、带数码相机的光学显微镜
药品试剂
0.075mKCl低渗液、固定液（甲醇：醋酸＝3:1）、0.4%秋水仙素、改良苯酚品红溶液

四、 实验步骤
Procedures
Attention
腹腔注射秋水仙素溶液：在做实验前2~3小时，对实验用小鼠按0.1ml/20g小鼠的量对其进行0.4％的秋水仙素注射。
（此步由老师完成）

取材：实验时，用断颈法迅速将小鼠处死，通过解剖取出股骨，用刀片将附着在股骨上的肉剥离干净，剪开股骨头，暴露骨髓腔。用注射器吸取低渗液1~2毫升，将针头插入骨髓腔中冲洗骨髓，使冲洗液从股骨的另一端流出。收集冲洗液到5ml刻度的离心管中。

低渗液需要在37℃下保温。
低渗：用吸管将冲洗液吹打几次，然后把离心管放在37℃恒温水浴槽内低渗20分钟。
时间稍长比较合适。
固定：之后取出并加1ml的固定液，吹打之后放入37℃恒温水浴槽内固定10分钟。

离心：然后将1000rpm离心10分钟，弃去上清。

再固定：加入固定液继续固定10分钟。

先吹打，再放入恒温水浴槽
离心：再1000rpm的速度离心10分钟。弃去上清。

制备细胞悬液：离心结束后，弃去上清。小心操作，避免将沉淀悬起，最后留大约与沉淀等量的上清液，

滴冰片：从冰箱里取出预冷的载玻片，根据细胞悬液体积的大小在铺了报纸的地上将4张载玻片并排摆在一起，将细胞悬液吸入吸管内，手持吸管在载玻片上方向下滴片。
载玻片一定要是预冷过的；滴片的高度越高越好。
干燥：让其自然晾干。
注意在干燥后用记号笔将滴有液体的部分标记，可以在载玻片的背面标记。
染色：用改良苯酚品红溶液染色15分钟左右。

去浮色：清水冲洗，风干。
注意洗玻片的时候不要将水直接冲到做过标记的位置，而应该是靠水流来洗。
镜检：先用低倍镜找到一好的分裂相区域，然后转用高倍镜观察。

五、 实验结果（使用的5号机观察）

经秋水仙素处理的小鼠（Mus musculus）骨髓细胞染色体照片：100×10（油镜，数码相机）

在考试的十分钟内，就拍了这么一张，之前看到的比较好的都没有找到。这里主要有个小插曲，我在自己的显微镜看好之后，就继续找有没有更好的，这时候老师就突然叫到我的名字（主要是我前面那位朋友突然要求先不考了，实在以外啊）。有点不知所措，但是还是决定去考。由于我的片其实本来做得不是很好，主要表现在视野中并没有特别多的染色体，而且相当一部分还没有散开，所以到考试的时候，自己有点准备不足，凭着印象看了一圈还是没有找到，就拍了这个不太好的。我拍的这张只能说是染色体，但是由于没有散开，所以数量是没有法数了。我做的片子能够数的其实很少，我看到过的最好的是能够数的，但是就总体来讲这个片子还是做得很不好的。对于其中最关键的三个步骤：低渗、预冷和滴片。前面两个都是老师提前准备好的，我们也是按照步骤来做，问题应该不大，要说的话有一点，就是预冷的载玻片，我们是直接用手取的，后来想起来，手是有温度的，应该用镊子效果更好，但是其实玻璃并不是热的良导体，所以短时间应该不会造成很大的影响；至于滴片的步骤，我们可是保证了相当高的高度，唯一我觉得遗憾的是，我们之前没有用水来试滴。结果由于离片太远，滴的时候不太好控制方向，最后虽然勉强滴到了板上，但是我认为效果肯定是欠佳的，比如我们一共用了4张片，有一张是没有滴到的，而且有几滴是滴到了外面的，我们最后的液体本来就不多，这样一来，也就只能勉强拿片子往下面做了。
我们的片子中最后看来染色体的数量不是很多，这个可能就与取材、离心等步骤有关系了。比如取材，我们按照书上说的方法做的，但是这样的效果好不好就不能评估了。在离心的步骤中，去掉上清液的过程也可能导致我们把细胞不小心去除了一部分，以至于最后的染色体数量不多。还有一种可能，就是我在去浮色的时候，不小心把水冲到了滴片的位置，这也可能是造成染色体数量少的原因。
最后就是染色体分开的问题了，在我们做的片子里，有一部分是仍旧被细胞核包裹的染色体，这个应该就是滴片的关系了，滴片给我的感觉是绝不仅仅是高度就完全决定的，应该考虑包括角度在内的其他因素吧，还有就是预冷的玻片取出来以后，一定要马上就滴片，否则一旦恢复了温度，那么效果肯定就不好了。

六、 实验讨论
1、关于实验处死动物的原则：在不影响动物实验结果的前提下，使实验动物短时间无痛苦地死亡。本实验使用的是脊椎脱臼法：右手抓住鼠用力向后拉，同时左手拇指与食指用力向下按住鼠头，将脊髓与脑髓拉断，鼠便立即死亡。其优点是比较易于掌握，而且大多数情况下要求不高，容易致死。不过我们在操作的时候，可能是心没有足够狠，小鼠并没有立即死亡，后肢还会动，继续重复刚才的操作，情况还是没有很大的改变，反复几次后小鼠终于死去。事实证明，力大并不是就好，比如我们旁边的一组同学，就直接把小鼠拉成了两半。
2、低渗和高空滴片
其共同目的都是使染色体能够分散开。
低渗液的作用是使细胞充分吸水膨胀而不破裂，从而一直保持在胀得很大而又没有破裂的状态。进而使得细胞内的中期染色体就能够足够分散开来，从而使得经固定等步骤后仍然处于膨胀状态。之后经过滴片时的摔打和骤降温过程，使细胞很快破碎，染色体进一步分散开。在滴片的时候就能够获得一团仅属于一个细胞的分散的中期染色体的片子，易于在显微镜下观察和对染色体进行计数。
而如果开始时就直接用蒸馏水使细胞破裂，这样虽然染色体更分散，但是为数很少的染色体都分散到大量的溶液中去，视野里就没几条染色体了；就无法对染色体数目进行统计。为了保持细胞的活性，所以需要对低渗液保温。低渗时间上应该也是长点较好，使细胞充分膨胀。
老师说滴片是越高越好。为了保证滴片的成功，如果有条件的话，多拿几块载玻片排起来肯定滴到其中一块上的概率会大一些。

七、 思考题
1、找到一个分裂相好的区域，进行显微照相。
前面已经完成。
2、统计小鼠2n染色体的数目，仔细观察其形态特征。
由前所述，照的这张片子染色体没有分开，所以无法进行有效计数。小鼠染色体的形态是两个臂比较均匀，每一个臂都是较短且较粗，由一个着丝粒连接。
3、低渗液起到什么作用，在使用的过程中应该注意什么问题。
低渗液的作用是使细胞充分吸水膨胀而不破裂，从而一直保持在胀得很大而又没有破裂的状态。进而使得细胞内的中期染色体就能够足够分散开来，从而使得经固定等步骤后仍然处于膨胀状态。之后经过滴片时的摔打和骤降温过程，使细胞很快破碎，染色体进一步分散开。在滴片的时候就能够获得一团仅属于一个细胞的分散的中期染色体的片子，易于在显微镜下观察和对染色体进行计数。
而如果开始时就直接用蒸馏水使细胞破裂，这样虽然染色体更分散，但是为数很少的染色体都分散到大量的溶液中去，视野里就没几条染色体了；就无法对染色体数目进行统计。为了保持细胞的活性，所以需要对低渗液保温。低渗时间上应该也是长点较好，使细胞充分膨胀。
4、你在实验中遇到什么问题，如何分析和解释。
在第五部分已经做了分析。

八、 参考文献
张贵友等 《普通遗传学实验指导》 清华大学出版社 2003