端粒酶逆转录酶活性的调节机制专家讲座.pptx

端粒酶逆转录酶活性调整机制与抗肿瘤药品筛选端粒重复扩增法(telomeric repeat amplificatlon protocol，简称TRAP)端粒酶逆转录酶活性的调节机制第1页什么是端粒酶？端粒酶(telomerase)是一个细胞RNA 依赖DNA聚合酶，其功效是维持真核细胞染色体末端端粒长度。由高度重复TTAGGG序列组成端粒，含有保护染色体末端被降解以及和其它染色体连接作用。端粒酶逆转录酶活性的调节机制第2页端粒酶组成？含有酶活性端粒酶主要由两部分组成：RNA组分(hTR)含有与端粒酶重复序列结合模板区含有逆转录酶活性蛋白催化亚基(hTERT)端粒酶逆转录酶活性的调节机制第3页hTR亚单位在大多数组织细胞中表示，而hTERT经常只在增殖细胞中表示。端粒酶活性与hTR mRNA表示水平无关，但在肿瘤中端粒酶活性与hTERT mRNA水平亲密相关。所以，hTERT表示是端粒酶活化和细胞癌变限速步骤。端粒酶逆转录酶活性的调节机制第4页转染hTERT可改变核基质与端粒结合，产生基因调整信号，下调细胞衰老相关基因表示，上调DNA修复相关基因活性，增加端粒稳定性，减低染色体自发伤。端粒酶逆转录酶活性的调节机制第5页端粒酶调整主要机制（hTERT转录调整）hTERT mRNA与端粒酶活性存在良好相关性，提醒hTERT表示是经过转录比率改变来调整，这种方式被认为是端粒酶调整主要机制。二者并非总是呈正相关。端粒酶逆转录酶活性的调节机制第6页 经研究，在体内发觉高水平hTERT开启子活性伴低拷贝数hTERT mRNA，深入发觉了4个参加hTERT基因调整主要区域。第一区域从翻译起始位(+1)(一300)，为关键开启子，含有双向活性。有多个E盒和Spl结合位点。cMyc和Max蛋白形成异二聚体后与，E盒结合活化hTERT 转录。Mad蛋白是c-Myc拮抗剂，可将MycMax结合转变成MadMax结合，从而降低hTERT 开启子活性。Spl也是经过与关键开启子中富含GC位点结合而活化hTERT 转录。Spl和c-Myc共同作用可完全活化hTERT开启子，这些主要转录因子上调，可能与癌变过程中端粒酶活化相关。有些人推测在正常细胞中存在端粒酶抑制物，在肿瘤中其功效和表示丧失，造成端粒酶再活化。此区有hTERT 负调整剂wilms 肿瘤抑制基因产物 (wilms tumor supressor gene product，Wt 1)结合位点。端粒酶逆转录酶活性的调节机制第7页第二区从(-1821-81lbp)，功效上涉hTERT第一个内含子剪切，对hTERT特异剪切起关键作用。第三区从(-800-300bp)为抑制区，含有hTERT负调整剂骨髓特异性锌指蛋白2(myeloid-specific zinc finger protein 2，MZF-2)结合位点，能降低hTERT转录活性。第四区位于结构基因外显子1起始位置(+1+1077)bp(含外显子2大部分)。在抑制hTERT开启子活性中发挥主要作用。端粒酶逆转录酶活性的调节机制第8页hTERT转录后剪切现已发觉有6种不一样hTERT剪切变异体。、为缺失型，另4个有内含子插入。这些变异体均无催化活性。在人类生长过程中，hTERT剪切含有组织特异性屡特定成人组织中激素应答性。这表明hTERT剪切不是随机。a变异体是主要端粒酶活性抑制剂，经过精细地调整a变异体和全长转录体之间百分比平衡来调整端粒酶活性。端粒酶逆转录酶活性的调节机制第9页转录后修饰hTERT转录后可在其特定丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基处磷酸化。研究发觉，尽管未受刺激淋巴细胞没有端粒酶活性，但有可检测蛋白水平。受刺激后hTERT 蛋白量仅轻度增加，但hTERT蛋白磷酸化百分比及活性大大增加，在细胞中分布发生改变。推测hTERT蛋白在未受刺激细胞中以无活性去磷酸化状态存在于细胞浆中，受刺激后磷酸化，并使其转移至细胞核中装配成有活性端粒酶，在端粒处发挥功效。现认为转录后hTERT经PKC、ERK12和Akt激酶磷酸化后，经过PKC依赖信号转导路径，增加cMyc表示而活化端粒酶。其调整与hTERT蛋白水平无关。假如用蛋白磷酸化酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)去磷酸化，则端粒酶活性显著降低，提醒去磷酸化可使端粒酶变成无活性构象。对端粒酶修饰后其功效改变深入研究，有利于研制针对这一过程特异抑制剂，开发新抗肿瘤药品。端粒酶逆转录酶活性的调节机制第10页伴侣蛋白介导调整hTERT与蛋白结合对其在细胞核装配及活化是必须。热休克蛋白(heat shock protein，HSP)伴侣复合物包含HSP90、HSP70、P23，与hTERT功效相关。HSP90靶标多是信号蛋白，它可使不稳定信号传导蛋白保持构象改变而维持其活性。加入HSP伴侣复合物纯化成份，有利于hTERT蛋白折叠、装配，显著增强端粒酶活性。HSP90可与Akt结合，保护Akt免受PP2A诱导去磷酸化作用，保持其活化磷酸化状态。这对维持端粒酶活性、抑制凋亡是必须。端粒酶逆转录酶活性的调节机制第11页其它分子和药品对hTERT调整激素：雌激素在雌激素阳性细胞中可上调hTERT mRNA 表示。雌激素原经过激活cMyc表示有利于hTERT 活化。孕酮开始时经过RasMEKERK信号路径上调hTERT mRNA 表示，随即诱导P21表示，抑制hTERT转录。端粒酶逆转录酶活性的调节机制第12页组蛋白去乙酰基酶(histone deacetylase，HDAC)抑制剂：HDAC抑制剂能诱导肿瘤细胞生长停滞、分化及凋亡细胞死亡，高浓度时可抑制端粒酶活性。被认为是治疗肿瘤潜在有效制剂。细胞周期调整因子：P53可与Spl形成复合物，抑制Spl与关键开启子结合，过分表示P53能下调hTERT 转录。在hTERT开启子转录起始区推测有E2F-1结合位点，E2F-1可降低hTERTmRNA 表示，为非经典转录抑制剂。生长因子：上皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)经过特异信号传导通路(MAP激酶信号路径)作用于hTERT开启子，上调hTERT mRNA表示。端粒酶逆转录酶活性的调节机制第13页肿瘤病毒：在正常细胞中hTERT开启子近端E盒位置存在端粒酶抑制复合物(如USF1和USF2)结合位点，人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)E6癌蛋白可作用于这些抑制复合物，使c-Myc代替抑制物与开启子结合，活化hTERT 转录。另有些人发觉，乙肝病毒和HPV 有4个整合出现在hTERT开启子及其上游区域，第五个整合出现在内含子3中，插入不改变hTERT编码序列，但可活化hTERT表示。其它对hTERT有抑制作用因子有抗癌药品如顺铂，分化诱导因子如维生素D、视黄酸等，其作用机制有待深入研究。端粒酶逆转录酶活性的调节机制第14页针对hTERT生物学功效及其调整机制，当前已经有数种方法抑制端粒酶活性。如针对hTERT及hTER反义核酸、核酶等。采取hTERT开启子与凋亡诱导基因相连形成嵌和载体，这种载体能诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无损害。抗hTERT抗体对端粒酶抑制有效性和特异性还未搞清。另外，一些小双链RNA 可在哺乳动物细胞内高效、特异地阻断特定基因表示，促使mRNA降解，介导特异性基因缄默，称为RNA干扰(RNA interference，RNAi)，可能成为关闭基因有效伎俩。采取RNAi技术抑制hTERT表示，不但可直接降低端粒酶活性，而且还可经过基因及蛋白表示改变寻找与之相作用蛋白或信号传导分子，对端粒酶在肿瘤发生、发展中作用、调控机制、抗肿瘤药品开发等含有主要意义。端粒酶逆转录酶活性的调节机制第15页肿瘤细胞端粒酶已发觉在正常体细胞和良性肿瘤组织中端粒酶活性是阴性(除了生殖细胞外)；而在人体恶性肿瘤组织和人肿瘤细胞株中都表示了很高活性。所以，认为端粒酶与恶性肿瘤发生发展有着亲密关系，有可能成为肿瘤治疗靶点。端粒酶逆转录酶活性的调节机制第16页端粒重复扩增法(TRAP)利用PCR扩增端粒重复序列，经过电泳和银染色测定扩增产物，电泳胶中6bp梯状条带确定端粒酶活性。温度30反应时间60 min时可使酶提液与未知化合物作用后还保持着酶活性，从电诛上样量及不一样浓度细胞酶提液酌结果表明，最低上群量10l 和细胞酶提液0.5g时能得到清楚6bp梯状条带。RNase0.05g对端粒酶活活性显示抑制作用，而对TaqDNA酶没有影响。端粒酶逆转录酶活性的调节机制第17页细胞培养 人肿瘤细胞株(Bel一7402、Hela),细胞均在5%CO2，37培养箱中培养，培养液为RPMI 1640(GIBCO产品)，其中含小牛血清10%，青霉素100 IUml和链霉素100gml。端粒酶逆转录酶活性的调节机制第18页人肿瘤细胞端粒酶提取取生长状态好肿瘤细胞1X 107ml，经离心、洗涤后，加入冷裂解液200l100 mmolL Tris-HCI(pH7.5)；1 mmolL MgCl2；1 mmolL EGTA；0.1 mmolL苯甲基磺酰氟(phenyI methylsulfonyl fluoride)；5mmolL-巯基乙醇(-mereaplc,exhanol)；0.5 CHAPS；10%甘油(glyceroI)，在冰浴中放置30min,然后16 000g离心4，20min，取上清液按Brodford方法 测定细胞裂解液蛋白量。分装，放置一80 C保留。端粒酶逆转录酶活性的调节机制第19页RNase与端粒酶反应取细胞酶提液1l加入不一样浓度(终浓度为1，0.5，0.05，0.01，0.005 g)RNase，在37条件下,反应20 min 然后加入PCR扩增系统中。端粒酶逆转录酶活性的调节机制第20页端粒酶活性测定(TRAP法)端粒酶产物扩增：取细胞酶提液1l分别加入TS引物036mol/L,dNTP50mol，Taq DNA多聚酶lIU，CX引物0.28mol/LMg2+15mmol。在25l反应液中进行PCR扩增。扩增程序为在30反应30min7230 s，然后在94变性30 s，55退火30 s，72延伸30 s。进行30个循环。端粒酶逆转录酶活性的调节机制第21页聚丙烯酰胺凝胶电泳分析扩增产物：用12%丙烯酰胺灌胶，胶聚合后，取扩增产物1025l加入加样孔中，以180 v电压进行电泳2 h左右。银染显色：用10%乙醇和0.5%冰醋酸固定聚丙烯凝胶35 min，然后加入硝酸银溶液(最终浓度为0.2%)，在37水搭上振荡染5 min,用超纯水洗涤三次。再加入显色液(30%氢氧化钠和0.1%甲醛)振荡直至DNA条带出现，普通为20min。最终将显色凝胶移至固定液中固定5min。普通光源照像。端粒酶逆转录酶活性的调节机制第22页RNA酶对Taq酶活性影响结果判断：以6bp梯状条带为阳性，即以PCR扩增产物间接反应端粒酶活性。本文结果均重复23次。DNA扩增系统 在反应体系中加入不一样浓度RNase。端粒酶逆转录酶活性的调节机制第23页需要研究原因？不一样温度对端粒酶活性影响端粒酶提取液热稳定性试验不一样反应时间对端粒酶活性影响不一样量细胞酶提液端粒酶活性PCR扩增产物不一样上样量电泳结果RNase对Taq DNA酶和端粒酶影响端粒酶逆转录酶活性的调节机制第24页恶性肿瘤治疗理想靶点应该是寻找到一个对肿瘤细胞生长所必须，但又不存在于正常细胞物质。端粒酶就是一个在许多肿瘤组织中处于高表示活性，而在正常组织中却没有酶活性表示特殊核糖核蛋白物质(除生殖和造血干细胞外)。它在维持肿瘤细胞高度增殖时，对端粒缩短起着主要作用，从而提醒端粒酶可能在恶性肿瘤组织中是一个标志。端粒酶逆转录酶活性的调节机制第25页谢谢！端粒酶逆转录酶活性的调节机制第26页