补体溶血实验.pptx

补体溶血试验补体溶血试验补体溶血实验第1页补体溶血试验l补体：一体：一组存在于人和脊椎存在于人和脊椎动物血清物血清中及中及组织液中含有液中含有酶样活性，不耐活性，不耐热和功效上和功效上连续反反应糖蛋白，是抗体糖蛋白，是抗体发挥溶溶细胞作用必要胞作用必要补充条件，在正常充条件，在正常情况下，血清中情况下，血清中补体大多以体大多以无活性无活性酶前体前体形式存在。形式存在。补体溶血实验第2页l物理性物理性质：不：不稳定，易受各种理化原定，易受各种理化原因影响，加因影响，加热，紫外，紫外线照射，机械震照射，机械震荡，酸碱和酒精等原因均可破坏，酸碱和酒精等原因均可破坏补体。体。l灭活：活：5656加加热30min30min即可即可灭活活补体溶血实验第3页补补体系体系统统生物学功效生物学功效（1 1）溶菌和溶溶菌和溶细细胞作用：胞作用：补补体系体系统统激活激活后，在靶后，在靶细细胞表面形成胞表面形成MAC，从而造成，从而造成靶靶细细胞溶解。胞溶解。（2）调调理作用：理作用：补补体激活体激活过过程中程中产产生生C3b、C4b、iC3b都是主要都是主要调调理素，可理素，可结结合中性粒合中性粒细细胞或巨噬胞或巨噬细细胞表面胞表面对应对应受体，受体，所以，在微生物所以，在微生物细细胞表面胞表面发发生生补补体激活，体激活，可促可促进进微生物与吞噬微生物与吞噬细细胞胞结结合，并被吞合，并被吞噬及噬及杀伤杀伤。补体溶血实验第4页（3 3）引）引发炎症反炎症反应：在：在补体活化体活化过程中程中产生炎症介生炎症介质C3aC3a、C4aC4a、C5aC5a。它。它们又称又称为过敏毒素，与敏毒素，与对应细胞表面受体胞表面受体结合，合，激激发细胞脱胞脱颗粒，粒，释放放组胺之胺之类血管活血管活性物性物质，从而增，从而增强血管通透性并刺激内血管通透性并刺激内脏平滑肌收平滑肌收缩。C5aC5a还是一个有效中性粒是一个有效中性粒细胞胞趋化因子。化因子。补体溶血实验第5页（4 4）去除免疫复合物：机制）去除免疫复合物：机制为：补补体体与与Ig结结合在空合在空间间上干上干扰扰Fc段之段之间间作用，抑作用，抑制新制新IC形成或使已形成形成或使已形成IC解离。解离。循循环环IC可激活可激活补补体，体，产产生生C3b与抗体共价与抗体共价结结合。合。IC借助借助C3b与表示与表示CR1和和CR3细细胞胞结结合而合而被肝被肝细细胞去除。胞去除。补体溶血实验第6页l（5 5）免疫）免疫调整作用：整作用：C3可参加捕可参加捕捉固定抗原，使抗原易被捉固定抗原，使抗原易被APC处处理与理与递递呈。呈。补补体可与免疫体可与免疫细细胞相互作用，胞相互作用，调调整整细细胞增殖与分化。胞增殖与分化。参加参加调调整各整各种免疫种免疫细细胞功效。胞功效。补体溶血实验第7页补体激活路径：补体激活路径：l经典路径经典路径l旁路路径旁路路径lMBL路径路径 相同点：三条路径有共同末端通路，即形相同点：三条路径有共同末端通路，即形成膜攻成膜攻击复合物溶解复合物溶解细胞。胞。补体溶血实验第8页 1 1、补补体体经经典路径典路径(classical pathway)：是：是指以指以抗原抗体复合物抗原抗体复合物为为主要刺激物，使主要刺激物，使补补体体固有成份以固有成份以C1、C4、C2、C3、C5C9次次序序发发生生酶酶促促连锁连锁反反应应，产产生一系列生物学效生一系列生物学效应应和最和最终发终发生生细细胞溶解作用胞溶解作用补补体活化路径。体活化路径。补体溶血实验第9页l2、替替换路径（旁路路径）路径（旁路路径）:是指不是指不经经C1、C4、C2活化，而是在活化，而是在B因子、因子、D因子和因子和P因因子参加下，直接由子参加下，直接由C3b与激活物与激活物结结合开启合开启补补体体酶酶促促连锁连锁反反应应，产产生一系列生物学效生一系列生物学效应应和最和最终发终发生生细细胞溶解作用胞溶解作用补补体活化路径。体活化路径。在感染早期可在感染早期可为为机体提供有效防御机制。机体提供有效防御机制。其激活物是其激活物是病原微生物病原微生物等提供接触表面等提供接触表面补体溶血实验第10页l3 3、MBLMBL路径：在感染早期，体内分泌甘露路径：在感染早期，体内分泌甘露聚糖聚糖结合凝集素合凝集素(MBL)(MBL)和和C C反反应蛋白。蛋白。MBLMBL与与细菌表面甘露糖残基菌表面甘露糖残基结合，然后与合，然后与丝氨酸氨酸蛋白蛋白酶结合形成合形成MASPMASP（MBLMBL相关相关丝氨酸蛋白氨酸蛋白酶），），MASPMASP继而水解而水解C4C4和和C2C2开启后序开启后序酶酶促促连锁连锁反反应应，产产生一系列生物学效生一系列生物学效应应和最和最终终发发生生细细胞溶解作用胞溶解作用补补体活化路径。激活物体活化路径。激活物（或激活（或激活剂剂）是）是炎症期炎症期产生蛋白和病原体生蛋白和病原体。补体溶血实验第11页三条路径区分见下表 l区分点l经典路径l旁路路径lMBL路径激活物激活物IgG1IgG13 3或或IgMIgM与与AgAg复合物复合物l脂多糖、酵母多糖、l凝聚IgA和IgG4MBLMBL（甘露聚糖甘露聚糖结合凝集素合凝集素）l参加成份C1C1C9C9C3C3，C5C5C9C9，BB、P P、D D因子因子l同经典路径C3C3转化化酶C4b2bC4b2bC3bBbC3bBbl同经典路径C3C3转化化酶C4b2b3bC4b2b3bC3bnBbC3bnBbl同经典路径所需离子所需离子CaCa2 2MgMg2 2MgMg2 2l同经典路径作用作用l参加特异性免疫在感染后期发作用l参加非特征免疫，在l感染后期发挥作用l同经典路径补体溶血实验第12页补体起源、采集l试验室惯用豚鼠、兔新鲜血清作为补体起试验室惯用豚鼠、兔新鲜血清作为补体起源。源。l补体采集：普通选取补体采集：普通选取3-5只健康未妊娠豚鼠只健康未妊娠豚鼠或兔子，以无菌操作采集血液，采集好血或兔子，以无菌操作采集血液，采集好血液置液置4冰箱过夜，次日离心分离血清即可冰箱过夜，次日离心分离血清即可分离到补体。分离到补体。补体溶血实验第13页l溶血素（抗溶血素（抗绵羊羊红细胞抗体）：是以胞抗体）：是以SRBCSRBC作作为抗原免疫家兔所得到兔抗血清，无需抗原免疫家兔所得到兔抗血清，无需深入提深入提纯，但，但试验前前应先先5656加加热30min30min或或者者603min603min灭活活补体。体。l溶血反溶血反应：因：因为抗原（抗原（红血球）和抗体血球）和抗体（溶血素）（溶血素）进行特异性行特异性结合，在合，在电解解质存存在在时能能发生凝集，若再有生凝集，若再有补体参加，体参加，红血血球球则被溶解。被溶解。补体溶血实验第14页试验目标试验目标l掌握掌握补体体测定方法定方法l加深了解加深了解补体作用和激活条件体作用和激活条件补体溶血实验第15页材料与试剂材料与试剂l试剂1.1.抗原：抗原：2%2%绵羊羊红细胞胞2.2.抗体：溶血素抗体：溶血素3.3.补体：体：试验室常以室常以健康豚鼠健康豚鼠血清作血清作为补体体l材料材料:小小试管，生理管，生理盐水，水浴箱水，水浴箱补体溶血实验第16页试验方法l取取试管管4 4支，按下表加入各物支，按下表加入各物试管号管号溶血素溶血素补体体2%SRBC2%SRBC生理生理盐水水结果果1 10.50.50.50.50.50.50.50.52 20.50.5-0.50.51.01.03 3-0.50.50.50.51.01.04 40.50.50.50.5（灭活）活）0.50.50.50.5补体溶血实验第17页试验方法试验方法l将上述将上述试管放在管放在3737水浴箱内水浴箱内3030分分钟观察察有没有溶血有没有溶血现象。象。l将不溶血将不溶血试管离心，管离心，3000rpm3000rpm，5min5min，使，使红细胞沉淀。胞沉淀。l将将2 2、3 3号管上清液分号管上清液分别移入移入5 5、6 6管，按下管，按下表加入表加入试剂补体溶血实验第18页试验方法试验方法试管号管号内容物内容物溶血素溶血素补体体2%2%SRBCSRBC生理生理盐水水结果果2 2管管2 2沉淀物沉淀物-0.50.5-2.52.53 3管管3 3沉淀物沉淀物0.50.5-2.52.54 4管管4 4沉淀物沉淀物-0.50.5-2.52.55 5管管2 2上清上清液液-0.50.50.50.5-6 6管管3 3上清上清液液0.50.5-0.50.5-l将上述将上述5 5支支试管放入管放入3737水浴箱内水浴箱内30min30min观察有没有溶血察有没有溶血现象，并解象，并解释原因原因补体溶血实验第19页试验结果试验结果l溶血：液体呈溶血：液体呈红色透明色透明l不溶血：呈不溶血：呈红细胞混胞混悬液液补体溶血实验第20页思索题l依据所给条件，请预测哪几管会溶血？哪几管不会溶血？请你详细分析溶血和不溶血原因。补体溶血实验第21页