NY∕T 540-2023 （代替 NY∕T 540-2002）鸡病毒性关节炎诊断技术.pdf

2023?02?17发布2023?06?01实施鸡病毒性关节炎诊断技术41中华人民共和国农业行业标准备案号：XXXX-XXXX11.220CCS B5402023Diagnostic techniques for avian viral arthritis中华人民共和国农业农村部发 布代替 NY/T?5402002学兔兔 标准下载N Y/T 前言本文件按照G B/T 标准化工作导则第部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草.本文件代替NY/T 鸡病毒性关节炎琼脂凝胶免疫扩散试验方法,与NY/T 相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下:a)增加了引言;b)增加了规范性引用文件(见第章);c)增加了术语和定义(见第章);d)增加了缩略语(见第章);e)增加了临床诊断(见第章);f)增加了样品采集和处理(见第章);g)删除了琼脂凝胶免疫扩散试验(见 年版的第章);h)增加了病毒分离与鉴定(见第章);i)增加了R T P C R试验(见第章);j)增加了实时荧光R T P C R试验(见第章);k)增加了间接E L I S A(见第 章);l)增加了综合判断(见第 章).请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.本文件由农业农村部畜牧兽医局提出.本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(S A C/T C )归口.本文件起草单位:中国动物卫生与流行病学中心、山东农业大学、青岛易邦生物工程有限公司.本文件主要起草人:李阳、于晓慧、唐熠、刘东、刘朔、左媛媛、蒋文明、李金平、张富友、苏红、王楷宬、王素春、王一新、王静静、侯广宇、刁有祥、刘华雷.本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为:年首次发布为NY/T ;本次为第一次修订.学兔兔 标准下载N Y/T 引言鸡病毒性关节炎,又称病毒性腱鞘炎或滑液囊炎,是由不同血清型及致病型的禽呼肠孤病毒(A v i a nR e o v i r u s,A R V)感染引起的鸡或火鸡的一种传染病.该病传播速度快、发病范围广,不同日龄、不同品种的鸡均可感染,但对商品肉鸡的危害尤为严重,给我国肉鸡养殖业造成严重经济损失.农业农村部将本病列为三类动物疫病.该病一年四季均可流行,以冬季多发,呈散发或地方性流行.病鸡和带毒禽是主要的传染源,可通过消化道和呼吸道传播.同时,病鸡在鸡群中既能水平传播,也能经蛋垂直传播.临床上多见于周龄 周龄的鸡,尤以周龄周龄多发,以跛行、关节炎、腱鞘炎、腓肠肌肌腱断裂为主要特征.禽呼肠孤病毒在分类地位上属于呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属,病毒粒子呈二十面体对称排列,有双层衣壳结构,无囊膜,直径约 n m,一般无血凝特性.病毒的基因组为分节段的双股R NA,由大小不同的个类别的 个节段组成.鸡病毒性关节炎目前仍是严重威胁养禽业健康发展的重要疫病,近年来呈现新的流行特点,流行毒株也不断变异,存在多种血清型和基因型的病毒同时流行.随着近些年科技的进步,原有的标准已不能满足当前我国鸡病毒性关节炎诊断的技术需求,需要对原标准进一步完善.学兔兔 标准下载N Y/T 鸡病毒性关节炎诊断技术范围本文件规定了鸡病毒性关节炎的临床诊断、病毒分离与鉴定、反转录聚合酶链式反应(R T P C R)、实时荧光R T P C R(R e a l t i m eR T P C R)和间接E L I S A抗体检测方法的技术要求.本文件适用于鸡病毒性关节炎的诊断、检疫、检测、监测和流行病学调查等.规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用本文件.G B/T 分析实验室用水规格和试验方法G B 实验室生物安全通用要求术语和定义下列术语和定义适用于本文件.鸡病毒性关节炎A i a nv i r a l a r t h r i t i s由禽呼肠孤病毒感染引起的鸡或火鸡的一种重要传染病.缩略语下列缩略语适用于本文件.A R V:禽呼肠孤病毒(A v i a nR e o v i r u s)C E F:鸡胚成纤维细胞(C h i c k e nEm b r y o n i cF i b r o b l a s t s)C P E:细胞病变效应(C y t o p a t h i cE f f e c t)E L I S A:酶联免疫吸附试验(E n z y m eL i n k e dI mm u n o s o r b e n tA s s a y)MEM:基础E a g l e培养基(M i n i m a lE a g l esM e d i u m)P B S:磷酸盐缓冲液(P h o s p h a t eB u f f e r e dS a l i n e)R T P C R:反转录聚合酶链式反应(R e v e r s eT r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s eC h a i nR e a c t i o n)R e a l t i m eR T P C R:实时荧光反转录聚合酶链式反应(R e a l t i m eR e v e r s eT r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s eC h a i nR e a c t i o n)S P F:无特定病原(S p e c i f i cP a t h o g e nF r e e)T A E:三羟甲基氨基甲烷乙酸乙二胺四乙酸(T r i h y d r o x y m e t h y lAm i n o m e t h a n e a c e t i cA c i d e t h y l e n ed i a m i n e t e t r aA c e t i cA c i d)TMB:,四甲基联苯胺(,T e t r a m e t h y l B e n z i d i n e)临床诊断 流行病学 该病一年四季均可发生.不同品种的鸡均可感染,但肉用型或肉蛋兼用型等体型较大的鸡多发.不同日龄的鸡均可感染.发病率高,死亡率较低,日龄越小越易感.雏鸡感染后,发病率和死亡率显著高于青年鸡和成年学兔兔 标准下载N Y/T 鸡.日龄大的鸡感染后潜伏期较长,有的可耐过.该病可垂直传播,也可水平传播.临床症状 病鸡精神沉郁,食欲减退,卧地倦动.跗关节肿胀,腿变形,站立困难,跛行或单腿跳跃,严重病例瘫痪.生长停滞、贫血、消瘦,日龄小的严重病例可逐渐衰竭死亡.病理变化 剖检变化 跗关节和跖关节的剑鞘水肿,病鸡关节腔内有淡黄或淡红色渗出液,病程后期逐渐形成纤维素性渗出.腿骨质脆,易折断.肌腱断裂.组织学病变 在急性期,出现水肿、凝固性坏死,异嗜细胞集聚血管周围浸润,网状细胞增生,最后引起腱鞘壁层明显增厚,滑膜腔充满异嗜细胞和脱落的滑膜细胞,随着破骨细胞增生而形成骨膜炎.在慢性期,滑膜形成绒毛样突起,并有淋巴样结节,大量纤维组织增生,明显见到网状细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和浆细胞的浸润或增生.趾关节和跗关节区也出现相同的一般炎症反应.结果判定当鸡符合 且符合 、之一的,可判定为疑似鸡病毒性关节炎.样品采集和处理 器材 手术剪刀和镊子.离心管.样品保存管.组织匀浆器.采血器.滤器(孔径 m).试剂 m o l/Lp H P B S,配方应符合附录A中A 的规定.青霉素(I U/m L).链霉素(g/m L).样品采集 生物安全措施实验室生物安全措施按照G B 的规定执行.组织病料采集 活禽采样:灭菌棉拭子插入泄殖腔旋转圈圈后,放入含青霉素 I U/m L和链霉素g/m L的无菌P B S样品保存管中.病死禽采样:无菌采取肝脏、脾脏、肾脏等组织样品或者关节腔内容物样品,放入样品保存管中.血清样品采集经翅静脉采集鸡血液,每只应不少于m L.无菌分离血清,装入m L离心管中,密封后冷藏或 冷冻保存.学兔兔 标准下载N Y/T 样品处理 拭子样品:经剧烈振荡后,r/m i n离心 m i n,取上清液,冷藏或 冷冻保存.组织样品:无菌条件下将组织剪碎,按加入生理盐水(青霉素 I U/m L和链霉素g/m L)后组织研磨器制成匀浆,反复冻融次次,r/m i n离心 m i n,取上清液,用直径 m滤器过滤除菌,冷藏或 冷冻保存.病毒分离与鉴定 器材 冰箱(、不同温度).恒温孵化箱.离心机.c m细胞培养瓶.倒置生物显微镜.试剂 m o l/LP B S(p H ),配方按照A 的规定执行.细胞培养液,配方按照A 的规定执行.细胞维持液,配方按照A 的规定执行.胰酶,配方按照A 的规定执行.试验细胞与动物 日龄日龄S P F鸡胚或日龄 日龄S P F鸡胚.C E F细胞.试验程序 鸡胚分离病毒 取处理后的拭子样品或组织样品,经卵黄囊途径无菌接种于枚日龄日龄的S P F鸡胚,或者经绒毛尿囊膜途径接种枚日龄 日龄的S P F鸡胚.具体操作如下:分别在S P F鸡胚无血管处和气室顶端打一小孔,用吸球在气室顶端孔处抽吸以制造人工气室,然后用注射器于S P F鸡胚无血管处接毒(设对照胚枚,以同样方式接种无菌P B S),m L/枚,之后将所打孔用石蜡封闭,继续孵化.接种 h内死亡的鸡胚弃去不用.h后每 h照胚一次,记录鸡胚死亡情况.收集 h以后的死胚及 h仍存活鸡胚,置于条件下h或过夜,无菌收取鸡胚进行病毒鉴定.用初代分离的鸡胚参照 的要求进行处理后,参照 和 的要求于S P F鸡胚继续盲传代.细胞培养分离病毒 制备C E F见附录B.接种病毒 待细胞长成单层后,先倒去细胞培养瓶中的营养液,加入m L已经处理后的拭子样品或组织样品,孵育 m i n,其间每隔 m i n轻轻摇动细胞培养瓶,孵育后弃掉样品,用细胞维持液洗细胞次,加入m L细胞维持液,在 C O培养箱培养.细胞对照瓶不接种样品,弃去细胞培养液后加m L细胞维持液.观察和记录:以上单层细胞出现细胞变大变圆、遮光度增加等典型C P E时,将细胞培养学兔兔 标准下载N Y/T 物冻融后,离心去掉细胞碎片,取上清液进行病毒鉴定.盲传:如果接种d后仍未见C P E,弃去培养液,将培养物反复冻融次,收集细胞和病毒的冻融液,r/m i n离心m i n,收集上清液,按 所述方法再接种单层细胞进行盲传,如此盲传代.病毒鉴定鸡胚和出现C P E的细胞培养液,应选用本文件中第章(R T P C R)或第章(实时荧光R T P C R)所述方法进行核酸鉴定.结果判定 细胞盲传代未见C P E或鸡胚传代未见病变,且经本文件第章或第章中所述任一方法检测阴性者,判定病毒分离阴性.对出现C P E的细胞培养液或出现病变的鸡胚,且经本文件第章或第章中所述任一方法检测阳性者,判为病毒分离阳性.R T P C R试验 器材 级生物安全柜.P C R仪.离心机(最大转速为 r/m i n).电泳仪.电泳槽.紫外凝胶成像仪.冰箱(、).微量移液器(最大量程分别为 L、L、L、L),带滤芯的枪头.电子天平:精度为 g.试剂 符合G B/T 规定的一级水.核酸提取试剂盒.R T P C R相关试剂;可选用商品化试剂盒.D NA分子量标准(D L b p或其他等效力分子量标准).阳性对照标准品采用已知病毒材料,如鸡呼肠孤病毒感染的S P F鸡胚.阴性对照标准品采用S P F鸡胚.R T P C R检测所需引物:a)上游引物F:AT C C AT G G G GAT T AA C T C AA ;b)下游引物R:AG T C GA C T G G T AT C GAT G C C ,扩增片段长度为 b p,引物浓度为 m o l/L.T A E缓冲液:配制方法按照A 的规定执行.琼脂糖凝胶:配制方法按照A 的规定执行.试验程序 R N A提取可选市售商品化R NA提取试剂盒,按说明书进行.核酸扩增 引物:将引物稀释到工作浓度 m o l/L.学兔兔 标准下载N Y/T R T P C R反应体系配置:R T P C R反应体系配置见表.表R T P C R反应体系配置表组分体积,L一步法R T P C R缓冲液 上游引物F 下游引物R R T P C R酶 d d HO R NA 总体积 R T P C R扩增:按照 的加样顺序加完后,充分混匀,瞬时离心,使液体都沉降到P C R管底.同时,设立阳性对照和阴性对照.按照下列程序进行扩增:反转录 m i n;预变性m i n;然后进行 个循环:变性 s、退火 s、延伸 s;最后 延伸 m i n;保存备用.也可选用其他等效的R T P C R扩增试剂盒.R T P C R扩增产物电泳 加样:取LLR T P C R扩增产物和L加样缓冲液混匀,后加入到T A E缓冲液配制的 琼脂糖凝胶中,每次电泳同时设标准D NA M a r k e r、阴性对照、阳性对照.电泳:电压 V V或电流 mA mA,电泳 m i n m i n.最后,由凝胶成像系统观察并拍照记录.试验成立条件电泳结束后,取出凝胶置凝胶成像仪(或紫外透射仪)上观察.阳性对照电泳结果应出现约 b p扩增条带,同时阴性对照无扩增条带.结果判定试验成立的情况下,被检样品扩增产物电泳出现约 b p目标条带,判定为A R V核酸阳性(见附录C);被检样品无扩增条带,判为A R V核酸阴性.实时荧光R T P C R试验 器材 荧光P C R仪.其余器材同 .试剂 符合G B/T 规定的一级水.核酸提取试剂.一步法实时荧光R T P C R试剂盒.阳性对照标准品采用已知病毒材料,如鸡呼肠孤病毒感染的S P F鸡胚尿囊液.阴性对照标准品采用S P F鸡胚尿囊液.实时荧光R T P C R检测所需引物及探针:a)上游引物F:AT G G C C T AT C T AG C C A C A C C T G ;b)下游引物R:C AA C G T GAT AG C AT C AAT AG T A C ;c)探针P:F AM T G C T AG GAG T C G G T T C T C G C A B HQ ,扩增片段长度为 b p,引物、探针浓度为 m o l/L.试验程序学兔兔 标准下载N Y/T 核酸提取同 .核酸扩增 实时荧光R T P C R反应混合液配制:按照表的规定配置实时荧光R T P C R反应体系.表实时荧光R T P C R反应体系配置表组分体积,LR T P C R缓冲液 酶混合液 上游引物F 下游引物R 探针 无核酶灭菌水 R NA 总体积 实时荧光R T P C R反应按照 的加样顺序加完后,充分混匀,瞬时离心,使液体都沉降到P C R管底.同时,设立阳性对照和阴性对照.将P C R管放在荧光P C R仪上进行扩增,反应条件为:m i n,s,进行个循环;s,s(收集荧光信号),进行 个循环.反应结束后,根据收集的荧光曲线和C t值判定结果.也可选用其他等效的实时荧光R T P C R扩增试剂盒.试验成立条件阳性对照品扩增曲线有明显对数增长期,且C t值;同时,阴性对照品扩增曲线无对数增长期.结果判定试验成立,被检样品C t值,且出现标准的S形扩增曲线,则判为阳性;当 C t值,则判定为可疑,重复测定后仍在可疑区间的样本判为阳性;当无C t值或C t值,则判为阴性(见附录D).间接E L I S A 器材 台式高速离心机(最大转速为 r/m i n).酶标仪.微量移液器:最大量程分别为 L、L、L、L.聚苯乙烯板.水平振荡器.恒温培养箱.试剂 阳性血清:S P F鸡接种A R V参考毒株 d,经R T P C R检测为阳性后制备的血清.阴性血清:S P F鸡血清.A R V抗原:A R V参考毒株制备的抗原.酶标二抗:兔抗鸡辣根过氧化物酶标记的I g G,效价应在 以上.P B S:配制方法按照A 的规定执行.包被液:配制方法按照A 的规定执行.洗涤液:配制方法按照A 的规定执行.样品稀释液(封闭液):配制方法按照A 的规定执行.底物溶液:TMB底物显色液.学兔兔 标准下载N Y/T 终止液(浓度为m o l/L):配制方法按照A 的规定执行.样品 取 中处理的待检鸡血清样品,每份宜不少于 L,应无溶血.用样品稀释液将被检血清样品稀释 倍(,如 L血清加入 L稀释液中).每稀释一个样品应更换一个吸头,做好样品的标记.稀释的样品血清充分混匀后,加入包被孔.操作步骤 将试验试剂预温到 .将全病毒抗原用包被液稀释 倍,每孔 L加入到 孔聚苯乙烯板中,孵育h后,继续孵育过夜.孵育后应用洗涤液洗次,在吸水纸上拍干板上残余液体.每孔加入 L封闭液,温箱孵育h,用 方法洗板.在A、A 孔各加 L阴性血清对照,A、A 孔各加 L阳性血清对照.将稀释好的待检血清加入其他各孔,L/孔,混匀后,孵育h,用 方法洗板.酶标二抗应用样品稀释液按 倍稀释,每孔加入 L,孵育h,用 方法洗板.每孔加入 LTMB显色液,避光条件下孵育 m i n.每孔加入 L终止液,轻轻振荡,终止反应.将酶标板置于酶标仪中,于 n m测定各孔样品的吸光值(O D),该操作应在 m i n内完成.试验成立条件阳性对照平均值减去阴性对照平均值之差必须大于 ,阴性对照平均值必须小于或等于 ,试验条件成立;否则,试验不成立,应重新测定.结果判定 样品O D ,判为A R V抗体阳性.样品O D ,判为A R V抗体阴性.样品 O D ,判为可疑,重复测定后仍在可疑区间的样本判为阳性.也可采用等效E L I S A抗体检测试剂盒进行检测.综合判断 临床判定为疑似的鸡,按照病毒分离与鉴定(第章)、R T P C R试验(第章)和实时荧光R T P C R试验(第章)中规定的任一方法检测为阳性的,判定为鸡病毒性关节炎.临床非免疫鸡,经间接E L I S A(第 章)检测出抗体阳性的,可判定为鸡病毒性关节炎.学兔兔 标准下载N Y/T 附录A(规范性)溶液配制(试剂要求分析纯及以上)A m o l/L磷酸盐缓冲液(P B S,p H )配制 m o l/L磷酸盐缓冲液所需试剂如下:a)g的氯化钠(N a C l);b)g的氯化钾(K C l);c)g的磷酸氢二钠(N aH P O HO);d)g的磷酸二氢钾(KHP O).试剂加水溶解至L,调整p H为 ,高压灭菌,保存.A 细胞营养液准确量取MEM营养液 m L、犊牛血清 m L,充分混匀,使用碳酸氢钠(N a HC O)调整p H至 ,保存.A 细胞维持液准确称取MEM营养液 m L、犊牛血清m L,充分混匀,使用碳酸氢钠(N a HC O)调整p H至 ,保存.A 胰酶准确称取MEM营养液 m L、胰酶 g,充分混匀,溶解后过滤除菌,保存.A T A E缓冲液准确称取 T A E缓冲液 m L,加入 m L去离子水,充分混匀,室温保存.A 琼脂糖凝胶加热完全融化,待冷却至 ,加入适量核酸染料,混匀,倒入凝胶板中,冷却备用.A 包被液(m o l/L,p H )准确称取碳酸钠(N aC O)g、碳酸氢钠(N a HC O)g,加入 m L去离子水,充分混匀,调整p H为 ,室温保存.A 洗涤液准确量取P B S m L,加入 m LT w e e n ,充分混匀,室温保存.A 样品稀释液(封闭液)准确称取脱脂奶粉 g,加入 m L洗涤液,充分混匀后,室温保存.A 终止液(m o l/L)准确量取浓硫酸()m L,加入 m L去离子水,充分混匀后,室温保存.学兔兔 标准下载N Y/T 附录B(资料性)C E F细胞制备方法B 将选好的d d的发育良好的S P F鸡胚用的碘酒棉球消毒蛋壳气室部位,再用酒精棉球脱碘.B 无菌取出鸡胚,放入灭菌的玻璃皿内,用p H 的P B S冲洗次,去头、四肢和内脏;再用p H 的P B S冲洗次.B 用剪刀剪成小块(mmmm),用p H 的P B S冲洗次.B 加约m L 胰酶溶液,消化 m i n,其间 m i n轻摇次.B 消化结束,弃掉胰酶消化液,用p H 的P B S冲洗次,再用细胞培养液冲洗次.B 加入适量的细胞培养液,用刻度吸管反复吹打(使细胞充分分散).B 将细胞分散液倒入带层层纱布的 m L灭菌烧杯中(过滤之前先用少许细胞培养液润湿纱布),加入适量培养液(m L/胚),过滤.按上述操作重滤一遍.B 计数,滤液中活细胞浓度应为 个/m L 个/m L.B 分装到培养瓶中(m L/瓶m L/瓶),置于 培养箱培养.状态良好(细胞透明度大,轮廓清晰)的细胞适宜病毒接种.学兔兔 标准下载N Y/T 附录C(资料性)禽呼肠孤病毒R T P C R检测阳性参照图图C 为禽呼肠孤病毒R T P C R检测阳性参照图.标引序号说明:M D NA分子量标准(D L M a r k e r);禽呼肠孤病毒阳性对照;禽呼肠孤病毒阳性样品;阴性对照.图C 禽呼肠孤病毒R T P C R检测阳性参照图学兔兔 标准下载N Y/T 附录D(资料性)禽呼肠孤病毒实时荧光R T P C R检测阳性参照图图D 为禽呼肠孤病毒实时荧光R T P C R检测阳性参照图.标引序号说明:阳性对照;阴性样品.图D 禽呼肠孤病毒实时荧光R T P C R检测阳性参照图学兔兔 标准下载